[LT] Būdai, skirti konstravimui naujų grandinei specifinių nikuojančių endonukleazių, pasinaudojant plazmidžių bibliotekos, turinčios atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną, praturtinimu in vivo. Plazmidės turi gretimą genui skaldomą arba nikuojamą seką, skaldymui arba nikavimui geno endonukleazės produktu ir antrąją atpažinimo vietą antrajai endonukleazei. Plazmidžių biblioteka naudojama nemodifikuotų ląstelių-šeimininkių transformavimui. Plazmidės iš išaugintų transformuotų ląstelių gali būti analizuojamos in vitro būdu dėl nikavimo, nikuotos plazmidės surenkamos ir naudojamos transformuoti ląsteles-šeimininkes. Produktas po to surenkamas ir nustatomas endonukleazės viengrandis specifiškumas. Produktas arba klonuojamas po amplifikacijos, arba identifikuojamas, naudojant selektyvų markerį.
[EN] Methods are provided for engineering novel strand-specific nicking endonukleases by means of an in vivo enrichment of a plasmid library containing a randomly mutagenised restriction endonukleaze gene. The plasmids contain adjacent to the gene a cleavable or nickable saquence for cleaving or nicking by the endonuclease product of the gene and a second recognition site for a second endonuclease. The plasmid library is used to transform unmodified host cells. Plasmids from the cultured transformed cells may be analyzed by in vitro assay for nicking and the nicked plasmids pooled and used to transform host cells. The product is then pooled and the single-stranded specificity of the endonuclease is then determined. The product is either cloned after amplification or identified by use of a selectable marker.
[0001] Yra daugiau negu 240 II tipo restrikcijos endonukleazių su unikaliomis savybėmis, atrastų kaip iš bakterinių, taip ir iš virusinių šaltinių. Tačiau komerciškai yra gaunami tik septyni nikuojantys fermentai: N.BstNBI, N.AlwI, N.BbvCIA (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA); N.Bpul0I (Fermentas Inc., Hanover, MD); ir N.CviQXI (CviNY2A) ir N.CviPII (CviNYSI) (Megabase Research Products, Lincoln, NE (www.cvienzymes.com).Yra tam tikras skaičius fago koduojamų nikuojančių fermentų, pavyzdžiui bakteriofago .. f1 II geno produktas (gpII), kuris yra būtinas virusinės DNR replikacijai. II geno produktas įveda trūkį (+) grandinėje, tuo inicijuodamas riedančio rato replikaciją. Jis taip pat dalyvauja perkeltosios (+) grandinės ligavime, generuojant viengrandę faginę DNR (Geider et al., 1. Biol. Chem. 257:6488-6493 (1982); Higashitani et al., J. Mol. Biol237:388-400 (1994). gpll baltymas ir egzonukleazė III gali būti bendrai naudojami viengrandės DNR gavimui, kuri naudojama mutagenezei ir kaip matrica naujos DNR grandinės sintezei in vitro.
[0002] Yra trys pagrindiniai specifiškai DNR grandines nikuojančių fermentų gavimo šaltiniai. Vienas iš jų - nikuojančių fermentų atrinkimas iš Chlorella algae viruso lizatų, iš kurių buvo pradžioje išskirti N.CviQXI (CviNY2A) ir N.CviPII (CviNYSI) (Zhang Y. et al. Virology, 240:366-375 (1998); Xia Y. et al. Nucl. Acids Res. 16:9477-9487 (1988)). Antrasis šaltinis - bakterijos, kuriose atrasti natūraliai pasitaikantys nikuojantys fermentai N.BstNBI ir N.BstSEI (Morgan R.D. et al. Biol. Chem. 381:1123-5 (2000); Abdurashitov, et al., Mol. Bio/. (Mosk) 30:1261-1267 (1996). Trečiasis šaltinis - nikuojančių fermentų gavimas baltymų inžinerijos būdu iš egzistuojančių IIA tipo restrikcijos fermentų.
[0003] Sekanti klasifikacija yra skirtingų II tipo restrikcijos endonukleazių potipių apibrėžtys (Roberts R.J. et al. Nucl. Acids Res. 31:1805-1812 (2003)):
[0004] IIA tipo endonukleazėms būdingos asimetrinės DNR atpažinimo sekos. Kirpimo vieta gali būti atpažinimo sekos viduje arba išorėje (už) atpažinimo sekos. Pavyzdžiai yra BsmI (GAATGC 11-1, viršutinė grandinė kerpama per vieną bazę už atpažinimo sekos, apatinė grandinė kerpama atpažinimo sekoje), AciI (CCGC -3/-1), BssSI (CACGAG -5/-1) ir SapI (GCTCTTC 1/4). Svarbiausiai, IIA tipas apima lIG, IIH, llS ir IIT restrikcijos endonukleazių tipus. Todėl daugelis fermentų patenka daugiau negu į vieną potipį. Pavyzdžiui, SapI gali būti identifikuotas kaip llA arba llS tipo fermentas.
[0005] llS tipo restrikcijos endonukleazės turi asimetrines atpažinimo sekas ir DNR kerpa šių atpažinimo sekų išorėje, t.y. kerpa nuo 1 iki 20 bazių atpažinimo sekų išorėje. Pavyzdžiai yra BsmAI (GTCTC 115), BsmBI (CGTCTC 115), FokI (GGATG 9/13) ir SapI (GCTCTTC 1/4).
[0006] lIG tipo restrikcijos endonukleazės turi sulietus endonukleazės ir metilazės domenus. Tuo būdu, lIG tipo fermentai turi ir endonukleazinį ir metilazinį aktyvumus ir šie aktyvumai gali būti stimuliuojami pridedant S-adenozilmetionino. lIG tipo fermentų DNR atpažinimo sekos gali būti simetrinės arba asimetrinės. Pavyzdžiai yra BpmI (CTGGAG 16/14) ir BseRI (GAGGAG 10/8). lIG tipo fermentai gali taip pat priklausyti IIA arba llS tipams.
[0007] lIH tipo restrikcijos endonukleazių genetinė organizacija panaši i I tipo restrikcijos-modifikacijos sistemą. Atpažinimo seka gali būti simetrinė arba asimetrinė. Pavyzdžiai yra BcgI (10112 CGANsTGC 12/10) (SEQ ID NO:27) ir BaeI (10/15 ACN4GTAYC 12/7) (SEQ ID NO:28).
[0008] IIT tipo restrikcijos endonukleazės yra heterodimerai arba tetramerai (2X heterodimerai). Atpažinimo sekos gali būti simetrinės arba asimetrinės. Pavyzdžiai yra Bpul0I (CCTNAGC -5/-2) ir Bsll (CCN7GG) (SEQ ID NO:29).
[0009] Būtų pageidautina sukonstruoti didelę įvairovę nikuojančių endonukleazių, išvestų iš restrikcijos endonukleazių su asimetrinėmis atpažinimo sekomis, kurių daugiau kaip 79 IIA tipo endonukleazės žinomos su unikaliomis savybėmis. (http://rebase.neb.com/rebase/).
[0010] Dauguma šių IIA tipo restrikcijos-modifikacijos sistemų yra klonuotos ir ekspresuotos heterologiškuose šeimininkuose (Rebase). Tuo būdu daugumos IIA tipo restrikcijos fermentų baltymų seka yra žinoma, nors asimetrinio kirpimo mechanizmas paaiškintas tik nedideliam kiekiui fermentų, dalinai IIT tipui. Likusių IIA tipo fermentų (kur fermentai yra atviro skaitymo rėmelio produktai) dominuojantis kirpimo mechanizmas iki šiol yra neaiškus.
[0011] Racionaliai suprojektuoti metodai pritaikyti tam tikriems fermentams, kurių pradinės turimos žinios apie dimerizacijos domenus yra tokios, kad gali būti pasiektas domenų atskyrimas. Domenų atskyrimas priklauso nuo santykinai didelio aminorūgščių sekos panašumo tarp planinio fermento varianto ir natūraliai atsiradusio nikuojančio fermento. Pavyzdžiui, Xu et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 98:12990-12995(2001) gavo nikuojantį fermentą N.AlwI domenų atskyrimu tarp AlwI ir homologiško, natūraliai atsiradusio nikuojančio fermento N.BstNBI (GAGTCNNNNAN, (SEQ ID NO:30), A žymi trūkio poziciją). Sukonstruotas fermentas N.AiwI negali būti suformuotas iš homodimero ir vien tik nikuoja viršutinę DNR grandinę kaip monomeras.
[0012] Besnier et al. EMBO Report 2:782-786 (2001); ir Kong et al. U.S. Patentas Nr. 6395523 naudojo kryptingą mutagenezę Mly viršutinę grandinę nikuojančio varianto sukonstravimui, remdamasis aukštu panašumo laipsniu su natūraliai pasitaikančiu nikuojančiu fermentu N.BstNBI.
[0013] Stahl F. et al. Proc. Nathl. Acad. Sci. USA, 93 :6175-80 (1996) išskyrė nikuojantį fermentą iš II tipo restrikcijos endonukleazės EcoRV (kurioje natyvus fermentas formuoja homodimerus ir atpažįsta simetrinę seką GAT/ATC). EcoRV nikuojantisfermentas buvo pagamintas sujungiant subvienetą, turintį neaktyvų katalitinį saitą, su antru subvienetu, turinčiu DNR prisirišimo defektą. Tačiau tokie EcoRV variantai yra nespecifiniai tuo atžvilgiu, kuri grandinė yra nikuojama ir tuo būdu tokių mutantų taikymas DNR manipuliacijoms yra labai apribotas. Priešingai, Heiter et al. (U.S. patento paraiška 20030100094) ir Janulaitis et al. (EP 1176204 A1) in aktyvavo heterodimerinio fermento vieno subvieneto katalitinį centrą, ko pasekoje buvo gauta nikuojanti endonukleazė. Tačiau šis principas yra ribotas IIT tipo fermentams su aiškiai išreikštomis ir išsaugotomis katalitinėmis vietomis.
[0014] Priešingai aukščiau aprašytiems būdams, Heitman ir Model aprašė EcoRI restrikcijos
[0015] endonukleazės atsitiktinę mutagenezę (Heitman 1. And Model P., EMBO J. 9:3369-3378 (1990)), kad būtų nustatyta substrato atpažinimo liekamoji reikšmė. Be jokios nikuojančių variantų selekcijos Heitman et al. atsitiktinai identifikavo nikuojančio aktyvumo variantą (Heitman J. And Model P., Proteins 7:185-197 (1990)).
[0016] IŠRADIMO SANTRAUKA
[0017] Išradimo įgyvendinime, grandinę specifiškai nikuojančių endonukleazių konstravimo būdui numatyti sekantys etapai: a) ląstelių- šeimininkių, neturinčių metilazinės apsaugos prieš restrikcijos endonukleazes, transformacija plazmidžių biblioteka, turinčia atsitiktinai mutuotą geną, koduojantį restrikcijos endonukleazę, plazmides įskaitant sekos vietą išorėje geno, kurią skaldo geno koduojama endonukleazė, ir b) transformantų auginimą, plazmidžių išskyrimą iš jų ir fakultatyvaus in vitro atrinkimo, kurios plazmidės turi nikuotą DNR. Be to būdas apima plazmidžių skaldymą su iš anksto nustatyta grandinę specifiškai nikuojančia endonukleaze. Šios endonukleazės nikavimo vieta yra skirtinga seka, negu atsitiktinai mutagenizuotų restrikcijos endonukleazių kirpimo vieta. Kadangi nikuojančios endonukleazės kerpa priešingą grandinę, negu mutagenizuota restrikcijos endonukleazė, susidaro du lipnūs galai. Reversinis pradmuo, kuris komplementarus lipniam galui šalia geno, arba yra identiškas lipnaus galo daliai arba visam lipniam galui, naudojamas geno amplifikavimui kartu su tiesioginiu pradmeniu, einančiu prieš geną. Amplifikuotas produktas po to klonuojamos. Arba kitaip, atrenkamas žymėtasis genas gali būti įterptas tarp dviejų lipnių galų plazmidės, kuri po to transformuojama i ląstelę ir identifikuojama selektyvioje terpėje. Sukonstruota nikuojanti endonukleazė taigi, yra gaunama abiem aukščiau aprašytais metodais.
[0018] Nikuojantis fermentas gali nikuoti vieną arba daugiau DNR dupleksų, RNRlDNR hibridą ir RNR dupleksą. Ląstelės-šeimininkės gali būti pasirinktos iš bet ,kurių bakterijų, naudojamų rekombinantinių restrikcijos endonukleazių ekspresijai. Tinkami promotoriai yra parinkti tokie, kad būtų gaunamas norimas ekspresijos lygis. Plazmidžių biblioteka gali būti sudaryta iš vienos rūšies plazmidžių arba daugybės skirtingų plazmidžių. Kiekviena plazmidė gali turėti vieną atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną arba apimti daugiau negu vieną geną, koduojančius daugybę fermentų arba subvienetų.
[0019] Metodo igyvendinimas apima restrikcijos endonukleazės geno mutagenizavimą, suformuojant deleciją ar inserciją arba vieno ar daugiau nukleotidų pakeitimą. Ypatingai, mutagenizuotas genas gali turėti vieną arba daugybę mutacijų. Mutagenizuotas genas gali turėti deleciją nuo 3 iki 600 nukleotidų ribose.
[0020] Išradimo įgyvendinimo metodas apima atrinkimą arba įterpimą restrikcijos endonukleazės kirpimo vietos sekos už geno plazmidėje. Po to kai ląstelės-šeimininkės, turinčios plazmidžių biblioteką, išauginamos, transformantai bendrai sukaupiami ir plazmidės, išskirtos iš šios sankaupos, analizuojamos nustatant plazmidžių koduojamų nikuojančių endonukleazių specifiškumą grandinėms. Nikuojančių endonukleazių išskyrimo efektyvumas gali būti sustiprintas praturtinimo pakopa, kuria plazmidinė DNR išskiriama iš transfonnantų sankaupos, atskyrus nikuotą DNR nuo superspiralizuotos ir linijinės DNR. Šis atskyrimas gali būti vykdomas elektroforeze agarozės gelyje arba tankio centrifugavimu. Modifikuotos E. coli ląstelės transformuojamos nikuota plazmidine DNR ir plazmidės iš šių transfonnantų arba patys transformantai padalinami i dvi sankaupas taip, kad vieną sankaupą būtų galima testuoti, nustatant viršutinės grandinės skilimo aktyvumą, o kitą sankaupą -nustatant apatinės grandinės skilimo aktyvumą.
[0021] Nikuojančios endonukleazės kirpimo specifiškumo grandinei priklausomybę galima nustatyti liguojant viengrandžius adapterius su iš anksto nustatytais lipniais galais. Lipnus galas, prie kurio prisijungia adapteris, susiformuoja, jeigu antroj i kirpimo vieta nustatyta iš anksto yra viršutinėje plazmidės grandinėje ir ekspresuota nikuojanti endonukleazė nikuoja apatinę grandinę. Panašiai, jeigu antroji numatyta skilimo vieta yra apatinėje plazmidės grandinėje, gali būti atrinktos ekspresuotos nikuojančios endonukleazės, kurios nikuoja viršutinę grandinę. DNR, atitinkanti geną, koduojantį nikuojančią endonukleazę su apibrėžtu viengrandžiu nikavimo aktyvumu, gali būti amplifikuota naudojant pradmenis, kurie hibridizuojasi su sekomis į kitą pusę nuo geno, pavyzdžiui su seka prieš geną ir viengrandžiu adapteriu arba kur pradmuo prieš geną yra iš esmės identiškas viengrandžio adapterio sekos daliai.
[0022] Įgyvendinant išradimą, pageidautina mutacija nikuojančioje endonukleazėje, nustatoma sekvenuojant sukonstruotą nikuojančią endonukleazę pagal aukščiau aprašytą metodą, gali būti įvesta kryptingos mutagenezės būdu į restrikcijos endonukleazės izošizmerą arba neošizomerą, taip gaunant nikuojančią endonukleazę. Analogiškai sukonstruotos nikuojančios endonukleazės nikuojantis aktyvumas gali būti sustiprintas arba dvigrandės DNR skilimo aktyvumas sumažintas kryptingos mutagenezės būdu įvedant pageidautiną mutaciją,
[0023] Įgyvendinant išradimą, numatytas būdas, kuriame mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas yra IIA tipo endonukleazės genas. Nikuojanti endonukleazė yra termostabili nikuojanti endonukleazė.
[0024] Įgyvendinant išradimą, numatytas būdas grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės konstravimui, kuris apima: ląstelių-šeimininkių transformaciją plazmidėmis, turinčiomis atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną, ląsteles-šeiminikes stokojančias apsauginio metilinimo; viengrandžio adaptoriaus ligavimą su sukauptomis plazmidėmis, išskirtomis iš išaugusių transformantų nustatymui, kuri plazmidė koduoja restrikcijos endonukleazės viršutinės arba apatinės grandinės variantą; mutagenizuotos restrikcijos endonukleazės geno amplifikavimą ląstelių-šeiminikių transformavimui; nustatymą kuri ląstelė-šeimininkė turi nikuojantį aktyvumą ir jos nikuojantį fenotipą; gavimą sukonstruotos grandinei specifinės nikuojančios endonukleazės.
[0025] Įgyvendinant būdą, restrikcijos endonukleazė yra SapI, iš kurios išskirtos sukonstruotos nikuojančios endonukleazės yra Nt.SapI ir Nb.SapI.
[0026] Įgyvendinant išradimą, metodas numatytas įvedimui vieno arba daugiau vietos specifinių trūkių į iš anksto parinktas DNR duplekso grandines, metodas apima DNR duplekso hidrolizę su nikuojančia endonukleaze palankiomis nikavimo aktyvumui sąlygomis.
[0027] TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS
[0028] Fig. 1 parodyta ekspresijos vektoriaus pSAPV6, naudojamo nikuojančio fermento Sapl klonų atrinkimui, polilinkerio seka. Pakopos apima: (a) atsitiktinai mutuotas SapI endonukleazės bibliotekos paruošimas pSAPV6, kurioje yra pACYCT7-ter su modifikuotu polilinkeriu; (b) E. coli kamieno transformacija, kuriame esminė laukinio tipo SapI klono ekspresija žudo ląsteles; (c) išaugusių kolonijų surinkimas ir plazmidinės DNR išskyrimas; (d) plazmidžių bibliotekos frakcionavimas elektroforeze agarozės gelyje ir nikuotų plazmidžių išskyrimas; (e) plazmidžių telkinio padalijimas į 2 grupes ir hidrolizė su N.BvbCI A arba SapI nikuotų plazmidžių ištiesinimas ir specifinių iškyšų gavimas B; (t) viengrandžio adapterio ligavimas su iškyša; ir (g) darbas su viršutinei ir apatinei grandinei specifiškos grandinės amplifikacijos strategija.
[0029] Fig. 2 parodyta amplifikavimo strategijos apatinei grandinei specifiškų SapI nikuojančio fermento klonų atrinkimo schema. Pakopos apima: (a) ligavimo adapteri su 4 bazių iškyša; (b) Klionovo užpildymo reakcijos panaudojimas; (c) nesuliguoto adapterio pašalinimas, naudojant Sp in kolonėlę; (d) PGR amplifikacija; (e) amplifikacijos produkto klonavimas į pSAPV6; (f) T7 ekspresijos kamieno, apsaugoto SapI metilinimu, transformacija; ir (g) ekstraktų nikuojančio aktyvumo tyrimas.
[0030] Fig. 3 parodyta amplifikavimo strategijos viršutinei grandinei specifiškų SapI nikuojančio fermento klonų atrinkimo schema.
[0031] Fig. 4 parodyta pradinis Nb.SapI (33 variantas) išskyrimas. Nikuojantis aktyvumas yra parodomas inkubuojant ląstelių ekstraktą su superspiralizuota pUCI9. M takelis yra lkb DNR diagrama, kurioje yra gerai matoma 3 kb juosta. Nikuota pUCI9 forma migruoja aukščiau už 3 kb. 33 takelis turi žymų lygį nikuotos pUC 19, išskirtos iš 33 varianto ekstrakto. Kiti takeliai turi tipišką lygi nikuotos pUC 19, gautos nespecifiniu nikuojančiu aktyvumu. 39 variantas parodo dvigrandį kirpimo aktyvumą.
[0032] Fig. 5 parodyta išvalyto Nb.SapI (33 variantas) titravimas naudojant substratu superspiralizuotą pUCI9. M takelis yra lkb DNR diagrama, kurioje 3 kb juosta yra gerai matoma. 1 takelyje yra neperkirpta pUC 19. 2 takelyje pUC 19 linearizuota SapI pagalba. 3-8 takeliuose buvo inkubuojama atitinkamai su 4, 2, I, 0,5, 0,25 ir 0,125 vienetais Nb.SapI (33 variantas) 60 min 37°C temperatūroje.
[0033] Fig. 6 parodyta Nb.SapI (33 variantas) nikavimo vietos patvirtinimas "run-off" sekvenavimo metodu. Substratas pUC 19 buvo nikuotas su išvalyta 33 varianto dauguma. Nikuotas žiedinis DNR produktas buvo išvalytas iš gelia ir sekvenuotas, naudojant pradmenį, kuris susieina su SapI kirpimo vieta. Tag DNR polimerazė prideda adenino bazę (A) pradmens prailginimo produkto gale (DNR transferazinis aktyvumas, nepriklausomas nuo matricos).
[0034] Fig. 7 parodo Nt.SapI pradinio išskyrimo variantus, turinčius E250K pakeitimą, Nikuojamntis aktyvumas atskleidžiamas inkubuojant mažėjantį tūrį ląstelių ekstrakto su superspiralizuota pUCI9. Klonai Nr. 2, 9, 11, 15 ir 18 buvo sekvenuoti, tam, kad butų surasti dažni pakitimai K80E, E250K ir K273R. M takelyje yra 1 kb DNR diagrama, kurioje gerai matoma 3 kb juosta. Nikuota pUC 19 forma juda> 3 kb.
[0035] Fig. 8 Nt.SapI (E250K) aktyvumo tyrimas. Nikuojantis aktyvumas parodomas inkubuojant mažėjantį ląstelių ekstrakto kiekį su superspiralizuota pUCI9. M takelis yra 1 kb DNR diagrama, kurioje gerai matoma 3kb juosta. 1 takelyje yra neperkirpta pUCI9. 2 takelyje - SapI linearizuota pUCI9. 3-8 takeliuose buvo atitinkamai inkubuota su 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 ir 0.0625 J.lI Nt.SapI 60 min. 37° C temperatūroje.
[0036] Fig. 9. parodo "run-off' sekvenavimą, kuriuo nustatoma Nt.SapI (E250K) nikavimo vieta. pUC19 substratas buvo nikuojamas ląstelių ekstraktu, turinčiu E250K variantą, Nikuotos žiedinės DNR produktas buvo išvalytas iš gelio ir sekvenuotas, naudojant pradmenį, kuris susieina su SapI kirpimo vieta. Taq DNR polimerazė prideda adeniną (A) DNR gale (DNR transferazinis aktyvumas, nepriklausomas nuo matricos).
[0037] Fig. 10 parodyta laukinio tipo sapIR geno iš Saccharopolyspora rūšies nukleotidų seka (SEQ ID NO:23) ir atitinkama amino rūgščių seka (SEQ ID NO:24).
[0038] Fig. 11 parodyta Nb.SapI (33 variantas) aminorūgščių seka (SEQ ID NO:25). Fig. 12 parodyta Nt.SapI (E250K variantas) aminorūgščių seka (SEQ ID NO:26).
[0039] DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
[0040] Šio išradimo įgyvendinimas leidžia kvalifikuotam specialistui sukonstruoti sekai specifinius ir viršutinei ar apatinei grandinei specifinius DNR nikuojančius fermentus iš egzistuojančių IIA tipo restrikcijos endonukleazių, turinčių asimetrines atpažinimo sekas.
[0041] Metodas apima sukūrimą plazmidžių bibliotekos, kurioje plazmidės turi vieną ar daugiau atsitiktinai mutagenizuotų restrikcijos endonukleazės genų, kur genas ar genai koduoja fermentus arba subvienetus. Biblioteka nebūtinai turi turėti plazmidžių tipų mišinį ir/arba daugybę atsitiktinai mutagenizuotų restrikcijos endonukleazių. Bakterijos yra transformuotos plazmidžių biblioteka ir in vivo įvyksta griežta genetinė atranka, kuria restrikcijos endonukleazę ekspresuojančios plazmidės yra letalios (mirtinos) ląstelėms-šeimininkėms, jeigu įvestos į kamieną neturintį giminingos metilinimo apsaugos ir kame yra pasiekiamas atitinkamas ekspresijos lygis.
[0042] Genetinė atranka gali būti įvykdyta vienos arba daugiau in vitro atrankų metu, kad būtų pasiekta galutinė plazmidžių biblioteka, kurioje dominantis nikuojančių fermentų klonas yra praturtintas ir dėl to lengvai išskiriamas iš bibliotekos ribotu bibliotekos patikrinimu. Genetinė atranka teikia pirmenybę faktui, kad nA tipo fermentas yra toksiškas ląstelėms-šeimininkėms, nesant apsauginio metilinimo.
[0043] Nikuojančių endonukleazių griežta genetinė atranka yra galima čia, kadangi bakterinio genomo integralumas yra labiau išlaikomas po vienos grandinės perkirpimo nikuojančia endonukleaze, palyginus su dvigubos grandinės perkirpimu restrikcijos endonukleaze. Taigi, ląstelės, ekspresuojančios nikuojantį fermentą yra labiau gyvybingos (išlieka gyvos). Išlikusios ląstelės surenkamos ir iš jų išskiriamos plazmidės. Pirmoji fakultatyvi atranka in vitro atliekama plazmides frakcionuojant elektroforezės agarozės gelyje būdu arba ultracentrifuguojant tankio gradiente.
[0044] Kadangi plazmidės yra konstruojamos turėti mažiausiai vieną strategiškai nustatytą substrato vietą, gretimą restrikcijos arba nikuojančios endonukleazės vietai, tokie plazmidžių klonai, ekspresuojantys nikuojančius fermentus, gali būti nikuoti. Nikuotos DNR migracija agarozės gelyje yra žymiai sulėtėjusi, palyginus su nenikuota superspiralizuota forma. Arba kitaip, naudojant centrifugavimą cezio chlorido tankio gradiente nikuotos ir superspiralizuotos plazmidės po keleto valandų centrifugavimo migruos i skirtingas pozicijas. Nikuotų plazmidžių atskyrimas nuo superspiralizuotų pasiekiamas pirmajame plazmidžių bibliotekos praturtinimo in vitro etape.
[0045] Po to, kai išskiriama plazmidinė DNR atitinkanti nikuotą, t.y. atvirą apskritimo formą, DNR perkirpimui in vitro naudojama antroji endonukleazė. Antroji endonukleazė gali būti nikuojantis fermentas arba restrikcijos fermentas ir ši substrato vieta yra strategiškai lokalizuota gretimai pirmosios nikavimo vietos (dominančios substrato vietos).
[0046] Pirmiausiai, endonukleazės skėlimo reakcija in vitro linearizuoja plazmidinę DNR ir sukuria iš anksto numatytus lipnius galus, kurie tarnauja kaip rankenos. Galutinėje in vitro stadijoje šie lipnūs galai panaudojami specifiniam tokių DNR klonų atrinkimui, kurie ekspresuoja arba viršutinę arba apatinę grandinę nikuojančių fermentų variantus. Jeigu lipnūs galai yra per trumpi pradmens priklausomai amplifikacijai (mažiau negu 4 nukleotidai), gali būti prijungtas adaptorius. Tada DNR gali būti amplifikuojama bet kuria iš galimų amplifikavio technikų, tokių kaip polimerazinės grandinės reakcija (PGR), helikazės priklausoma amplifikacija (HDA) arba grandinės priklausoma reakcija (SDA). Galiausiai, bibliotekos elementai transformuojami į bakterijas prieš tai modifikuotas apsauginiu metilinimu ir nikuojantys fermentai superekspresuojami taip, kad ląstelių ekstraktuose gali būti tiriamas nikuojantis aktyvumas. Kai nikuojantis variantas yra išskirtas, grandinės ir sekos specifiškumas patvirtintas ir nustatoma ištisa klono seka. Aminorūgščių pakeitimai, esantys kiekviename variante funkciškai analizuojami, nustatant jų poveikį į nikuojančios endonukleazės specifiškumą ir nikavimo aktyvumą,
[0047] Kai reikalinga, variantas optimizuojamas testuojant kitus pakeitimus pozicijose manomai reikšmingus nikuojančiam fenotipui. Aminorūgščių pakeitimas endonukleazėje, gaunant nikuojantį aktyvumą, gali būti įvestas į izošizomerą, neošizomerą arba į fermentą su gimininga aminorūgščių seka.
[0048] Genų bibliotekos ekspresijos atitinkamas lygis yra paprastai optimizuojamas vadovaujantis preliminariu laukinio tipo endonukleazės klono tyrimu.
[0049] Dalinai metodas yra įgyvendinamas naudojant SapI (žr. pavyzdžius). llS tipo endonukleazė SapI buvo modifikuota sukuriant grandines specifiškai nikuojančias endonukleazes. Buvo išskirtas SapI variantas, kuris daugiausia nikuoja apatinę grandinę ir pavadintas Nb.SapI 33 variantas. Be to, buvo išskirta keletas SapI variantų, kurie išimtinai nikuoja viršutinę grandinę. Labiausiai aktyvus viršutinės variantas buvo nustatytas palyginimo būdu ir surastas aminorūgšties pakeitimas E250K ir pavadintas Nt.SapI.
[0050] Naujų nikuojančių endonukleazių konstravimo metodo įgyvendinimas apima vieną arba daugiau sekančių žingsnių:
[0051] 1. Ekspresijos vektoriaus (plazmidės) modifikavimas
[0052] Atitinkamas ekspresijos vektorius yra parenkamas pagal tai, koks restrikcijos endonukleazės kirpimo vietų dažnis bus modifikuojamas bakterijos genome. Pavyzdžiui, restrikcijos endonukleazei, kuri yra dažnai kerpanti, pageidautina parinkti vektorių su sumažintu kopijų skaičiumi ir/arba santykinai silpnu promotoriumi, kadangi nikuojantis endonukleazės variantas, kuris yra atsitiktinės mutagenezės produktas, priešingu atveju gali sukelti toksinį efektą, atsirandantį dėl didelio trūkių skaičiaus. Pavyzdžiui, T7 promotorius gali būti naudojamas šeimininke, kuris neturi T7 RNR polimerazės. Vėlesniame veiksmų plane, minimalaus ekspresijos lygio tikimasi iš ištisinio nu skaitymo transkripcijos nuo kitų promotorių, esančių vektoriuose. Vis dėlto, gali būti pageidautina varijuoti vektoriaus-šeimininko derinį, kad būtų gauta padidinta ekspresija. 2-ame pavyzdyje SapI ekspresija nuo T7 promotoriaus ne T7 šeimininke, buvo nepakankama genetinės selekcijos pakopai. Taigi, vektorius su T7 promotoriumi buvo ekspresuojamas šeimininke, turinčiame T7 RNR polimerazę.
[0053] Be T7 promotoriaus, yra daugybė promotorių ir plazmidžių, turinčių pasirinktinai promotorius, kurie yra publikuoti ir/arba komerciškai prieinami. Atitinkama plazmidė gali būti pasirinkta numatytų charakteristikų pagrindu, kad būtų sukonstruota norima nikuojanti endonukleazė ir jos nikuojantis aktyvumas. Tai gali būti nesunkiai apibrėžta be pernelyg didelių eksperimentinių tyrimų aprašytų dėl SapI, kuriuose atsitiktinai mutuota restrikcijos endonukleazė įterpiama į pasirinktą plazmidę transformacijai į ląsteles-šeimininkes. Ląstelės gali būti surenkamos ir ištiriamos nikuojančios formos ir nustatomas preliminarių pakopų lyginamasis efektyvumas.
[0054] Kita aplinkybė vektoriaus konstravime yra substrato kirpimo vietų skaičius ir išsidėstymas. Kad būtų maksimizuotas genetinės atrankos pakopos efektyvumas, vektorius neturi turėti substrato kirpimo vietos replikacijos srityje ir esminių vektoriaus funkcijų atviro skaitymo rėmeliuose. Pavyzdžiui, endonukleazės genas neturėtų turėti substrato kirpimo vietos, pavaldžios ekspresuojamos endonukleazės kirpimui. Substrato kirpimo vietos buvimas, kaip aprašyta aukščiau, gali interferuoti su informacinės RNR molekulių transkripcija.
[0055] Pateiktame įgyvendinime atitinkamas ekspresijos vektorius yra modifikuotas įterpiant restrikcijos endonukleazės atpažinimo seką (substrato kirpimo vietą) už genų bibliotekos klonavimo vietos. (Žiūr. fig. 1). Šios DNR substrato vietos strategine padėtimi ekspresijos vektoriuje sudaro sąlygas tokių klonų selekcijai, kurie ekspresuoja endonukleazės variantus, kurie yra pajėgūs nikuoti kiekvienas savo ekspresijos vektorių in vivo.
[0056] Antroji, alternatyvi nikavimo vieta gali būti įterpta šalia dominančios substrato sekos, kad skaldymas su antruoju nikuojančiu fermentu sukurtų dvigrandį trūkį su iš anksto numatytais lipniais galais. Šie nustatyti lipnūs galai tokiu būdu įgalina atranką in vitro tokių mutuotų endonukleazės genų, kurie ekspresuoja kirpimo vietai specifines ir grandinei specifines nikuojančias endonukleazes. Šie nustatyti lipnūs galai taip pat gali būti gaunami dvigrandžio skėlimo metu šalia dominančios nikavimo vietos. Šiuo atveju mažas viengrandis DNR fragmentas bus produkuojamas, linearizavus ekspresijos vektorių. Trumpas viengrandis DNR (ssDNR) fragmentas išsisklaido ir pašalinamas iš DNR bibliotekos, kad būtų išvengta trukdymų tolimesniuose molekulinės atrankos žingsniuose. Trumpos ssDNR pašalinimas gali būti atliktas gryninimu iš agarozės gelio arba spin kolonėlės procedūra, kaip aprašyta 1 ir 2 pavyzdžiuose.
[0057] 2. Mutantinės endonukleazių bibliotekos sukūrimas
[0058] Mutantinė endonukleazės biblioteka yra sukuriama vienu iš žinomų metodų. Pavyzdžiui, endonukleazės geno mutagenezė gali būti atlikta:
[0059] (a) Turinti polinkį į klaidas PGR(Leung, et al., Technique 1: 11-15 (1989), Cadwell and Joyce, peR Methods Applie., 2:28-33 (1992)).
[0060] (b) Oligonukleotidu kryptinga mutagenezė,geriau PGR persidengiančio pratęsimo mutagenezės metodas (Morrison ir Desrosiers, Biotechniques 14:454-457 (1993)).
[0061] c) Surinkimo PGR.Terminas "surinkimo PGR" remiasi procesu, kuris apima PGR produkto surinkimą iš mažų DNR fragmentų mišinio. Didelis skaičius skirtingų PGR reakcijų vyksta lygiagrečiai tame pačiame tūryje, su vienai reakcijai parengta is produktais su kitos reakcijos produktais.
[0062] d) Lytinė PGR mutagenezė.Šis terminas "lytinė PGR mutagenezė" (taip pat žinoma kaip "DNR purtymas") remiasi homologine rekombinacija tarp skirtingų, bet labai susijusių DNR sekų in vitro, sukelta DNR molekulių atsitiktinio fragmentavimo, išplaukiančio iš sekų homologijos, paremta krosoverio fiksacija pradmens prailginimo PGR reakcijos metu.
[0063] e) Kasetės mutagenezė.Terminas "kasetės mutagenezė" nurodo bet kokį dvigrandės DNR molekulės mažos srities pakeitimo procesą sintetine oligonukleotido kasete, kuri skiriasi nuo natyvios sekos. Oligonukleotidas dažnai turi pilnai arba dalinai randomizuotą natyvią seką (Domer et al., J. Mol. Biol. 285:1515-1523 (1999)).
[0064] f) Rekursinė visumos mutagenezė.Terminas "rekursinė visumos mutagenezė" nurodo į baltymų konstravimo algoritmą (baltymų mutagenezė), sukurtą skirtingų populiacijų fenotipiškai susijusių mutantų gavimui, kurių nariai skiriasi aminorūgščių seka. Šis metodas naudoja grįžtamojo ryšio mechanizmą, kontroliuoti nuoseklius kasetinės mutagenezės ciklus (Arkin and Yuvan, Proc. Nat!. Acad. Sci., USA 89:7811-7815 (1992)).
[0065] g) Eksponentinė visumos mutagenezė.Terminas "eksponentinė visumos mutagenezė" nurodo į kombinatorinių bibliotekų, su dideliu unikalių ir funkcionalių mutantų procentingumu, sukūrimo procesą, kur mažos liekanų grupės atsitiktinai parenkamos kad būtų kiekvienoje pakeistoje pozicijoje lygiagrečiai identifikuotas aminorūgštys, kurios yra svarbios baltymų funkcionalumui (Delegrave and Youvan, Biotechnology Res. 11:1548-1552 (1993)) ir atsitiktinei ar kryptingai mutagenezei (Arnold, Curr. Opin. Biotecnol. 4:450-455 (1993)).
[0066] h) Cheminiai mutagenai:hidroksilamino, natrio bisulfato ar bet kurio kito mutageno veikimas (Sambrook, J., et al., Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 15.105- 15.107 (1989)).
[0067] i) Mutagenezė in vivo.Terminas "mutagenezė in vivo" nurodo i atsitiktinių mutacijų atsiradimą bet kokioje klonuotoje DNR E. coli kamienuose, turinčiuose mutacijas vienoje arba keliose DNR reparacijos sistemose. Tokie mutantiniai kamienai turi aukštesnį atsitiktinės mutagenezės santykį, negu laikinio tipo kamienai. Dauginant plazmidinę DNR viename iš šių kamienų atsiras atsitiktinės DNR mutacijos (Long-McGie, et al., Biotechnol.Bioeng. 68:121-125 (2000)). Nekryptinga mutagenizuota endonukleazių biblioteka gali būti sukurta ekspresuojant giminingą metilazę in vivo mutagenezės pakopoje.
[0068] j) Atvirkštinė PGR mutagenezė,panaudojant tiesioginį ir atvirkštinį oligonukleotidų prijungimą atsitiktinai mutuoto geno viduje arba išorėje. Lokalizuotų nukleotidų randomizacija gali būti apsunkinta taikant oligonukleotidų valdymui atsitiktinius arba pusiau atsitiktinius segmentus.
[0069] 3. Endonukleazės genų bibliotekos klonavimas ekspresijos vektoriuje
[0070] Jeigu endonukleazės genų biblioteka yra mutuota naudojant, pavyzdžiui, bet kurį iš (a)-(g) metodų, po to mutagenizuota genų biblioteka prieš transformaciją į genetiškai parinktą bakterijų kamieną klonuota modifikuotame ekspresijos vektoriuje. Jeigu naudojami (h)-(j) mutagenezės metodai, tuomet mutagenizuota plazmidžių biblioteka gali būti transformuojama tiesiai į genetiškai parinktą bakterijų kamieną, apeinant klonavimo stadiją.
[0071] Bakterijų kamienas genetinei selekcijai yra toks, kuriame konstitutyvinė arba indukuota laukinio tipo endonukleazės geno ekspresija baigiasi ląstelių letališkurnu. Dauguma laboratorinių kamienų tenkins šį reikalavimą. Kamienas gali ekspresuoti T7 RNR polimerazę genų bibliotekos ekspresavimui nuo T7 specifinio promotoriaus. Be to, konstitutyvinės ekspresijos iš T7 vektoriaus IetaIus lygmuo nereikalauja T7 RNR polimerazės buvimo.
[0072] Išgyvenusios bakterijų kolonijos surenkamos ir išskiriama plazmidinė DNR. Tokios ląstelės, turinčios funkcionaliai aktyvias restrikcijos endonukleazes, negali išgyventi, nesant metilazinės apsaugos. Išgyvenusios kolonijos gali paslėpti endonukleazės klonus, kurie neturės dvigrandės DNR skėlimo aktyvumo. Daugumoje atvejų, tik mažas procentas šių klonų ekspresuos nikuojančius fermentus, kadangi dauguma klonų ekspresuos neaktyvius fermentus.
[0073] 4. Plazmidžių analizė išgyvenusiose ląstelėse-šeimininkėse.
[0074] Plazmidžių biblioteka pajungiama elektroforezei preparatyviniame agarozės gelyje ir iš gelio išskiriama nikuota, turinti atvirą apskritimo formą DNR. Arba nikuotų plazmidžių išskyrimui gali būti naudojamas ultracentrifugavimas tankio gradiente. Įprastiniu būdu išskiriant plazmides iš E. coli, yra keletas nikuotų plazmidžių. Taigi, nikuotos bibliotekos plazmidžių išskyrimas negali garantuoti, kad kiekvienas endonukleazės genas koduos nikuojantį fermentą. Tačiau, šiuo požiūriu atrinkti klonai gali būti analizuojami pagal nikuojančių fermentų variantų ekspresiją. Plazmidžių biblioteka, išskirta iš genetiškai parinkta šeimininko gali būti transformuota į šeiminiką, ekspresuojantį apsauginę metilazę ir gali būti ištirta atskirų endonukleazės variantų aktyvumas ir specifiškumas nepajungiant plazmidžių bibliotekos bet kokiai in vitro atrankos procedūrai.
[0075] 5. Fakultatyvi plazmidžių molekulių, koduojančių nikuojančias endonukleazes atranka" in vitro"
[0076] Plazmidžių biblioteka gali būti po to padalinta į dvi grupes. Vėlesnės manipuliacijos su kiekvienos iš grupių DNR yra nukreiptos į grandinės specifiškumo nustatymą, Atitinkamai, viršutinę arba apatinę grandinę nikuojančių plazmidžių klonų nustatymas aprašytas žemiau. (Fig. 2 ir 3).
[0077] Kiekviena grupė hidrolizuojama su atitinkamu sekančiu nikuojančiu fermentu (arba restrikcijos fermentu) tam, kad linearizuotume plazmidės klonus, gautume dominančius iš anksto nustatytus lipnius galus. Jeigu restrikcijos fermentai naudojami linearizacijai, tuomet susidarę trumpi ssDNR fragmentai pašalinami.
[0078] Selekcija gali būti pasiekiama vienu iš keleto būdų. Keletas selekcijos metodologijos pavyzdžių yra pateikiama žemiau.
[0079] (a) Viengrandės DNR adapteris gali būti liguojamas su plazmidės lipniais galais ir dominantys mutantiniai genai yra amplifikuojami iš bibliotekos, naudojant, pavyzdžiui, PGR. Efektyviam ligavimui lipnus galas geriausiai turėtų būti apie 4-10 bazių. Jeigu ligavimo adapteris didesnis negu 4 nukleotidai, plazmidžių bibliotekos temperatūra galėtų būti pakelta, pavyzdžiui, iki 55°C, prieš pridedant adapterio perteklių ir po to ataušinant iki ligavimo temperatūros. Ligavimas atliekamas ir po to pašalinamas nesuliguotas adapteris valant per afininę kolonėlę. Apatinės grandinės atrinkimo procedūroje komplementarios suliguoto adapterio DNR grandinės susintetinimui naudojama užpildymo reakcija. Ši naujai suformuota grandinė naudojama matrica atrinktos genų bibliotekos PGR amplifikacijai. Užpildymo reakcija, einanti po adapterio suligavimo, gali būti atlikta, pavyzdžiui, naudojant Klionovo fragmentą. Ir viršutinės ir apatinės grandinių selekcijoje dominantys nikuojančių fermentų genai gali būti amplifikuoti naudojant PGR. Tiesioginis PGR pradmuo turėtų būti anilinamas prieš geną. Reversinis PGR pradmuo planuojamas arba komplementarus adapteriui (viršutinė selekcija, Fig. 3), arba sutrumpinta adapterio versija (apatinė selekcija, Fig. 2). Norint sumažinti klaidingą amplifikaciją, reversinio pradmens sekos 3' galas geriau ne rodytų žymaus bendrumo su bet kuria ekspresijos vektoriaus sritimi arba endonukleazės genu. Amplifikuota genų biblioteka klonuojama atgal į ekspresijos vektorių, transformuojama į iš anksto modifikuotą šeimininką (ekspresuojantį giminingą arba negiminingą DNR metilazę) ir individualios kolonijos auginamos bei tiriama dominančio nikuojančio fermento ekspresija.
[0080] (b) Jeigu plazmidės turi iš anksto žinomus lipnius galus, gali būti pridedamas prie linearizuotos plazmidžių bibliotekos kaip atrankos žymuo atsparus antibiotikui genas su tokiais pat lipniais galais. T4 DNR ligazė dedama nuo 10 minučių iki 16 valandų ir mišinys transformuojamas i iš anksto modifikuotas bakterijas, turinčias apsauginę DNR metiltransferazę. Transformacijos mišinys išsėjamas ant terpės, turinčios antibiotiką, atitinkantį įterptam atsparumo genui. Atsparios kolonijos auginamos individualiai ir tiriama dominančio nikuojančio fermento ekspresija.
[0081] (c) Jeigu plazmidžių biblioteka turi plazmides su vietos ir grandinės specifiniu trūkiu, sukurtu in vivo ir yra inkubuojamos su antru, alternatyviu nikuojančiu fermentu, siekiant gauti antros grandinės trūkį, dominančios linearizuotos plazmidės gali būti atskirtos nuo nikuotų plazmidžių elektroforeze agarozės gelyje. Po to gali būti pridedama T4 DNR ligazė mažoje koncentracijoje (2-4 ng/μl), kad būtų cirkuliarizuota kiekviena plazmidė. Ligavimo mišinys transformuojamas į iš anksto modifikuotą šeimininką ir individualios kolonijos auginamos bei tiriama dominančio nikuojančio fermento ekspresija.
[0082] 6. Nikuojančių fermentų suradimas
[0083] Nikuojantys fermentai gali būti surasti tiriant iš indukuotų arba neindukuotų kultūrų gautų ląstelių ekstraktus. Atrinkti bibliotekos klonai transformuojami į iš anksto modifikuotą šeimininko kamieną ir auginami su atitinkamu antibiotiku plazmidžių atrinkimui. Baltymų ekspresija gali būti indukuota vėlyvoje log fazėje. Ląstelių kultūros centrifuguotos ir ląstelių ekstraktas gautas ultragarsu suardytas ląsteles resuspendavus buferyje, kuris neturėtų įtakos fermento aktyvumui ir padėtų palaikyti baltymą tirpale (pavyzdžiui, tris-HCl arba fosfatinis buferis, turintis 10mM β-merkaptoetanolio ir 0,1 mM EDTA). Antraip, lizė gali būti atlikta veikiant lizocimu, veikiant detergentu arba šaldant-šildant. Tipinis bandymas susideda: 2-5JlI ląstelių ekstrakto pridėjus 1 Jll DNR substrato reakcijos buferyje optimaliame laukinio tipo endonukleazei. DNR substratas gali turėti vieną arba daugiau nikavimo vietų ir nikuotos formos judrumas turi neabejotinai atsiskirti nuo superspiralizuotos formos, jegu pajungiama elektroforezei agaroziniame gelyje (t.y. geriausiai maža, didelio kopijų skaičiaus plazmidė, tokia kaip pUC19). Kiekvieno nikuojančio varianto vietos ir grandinės specifiškumas nustatomas nikuotą DNR produktą sekvenuojant "run-off" metodu. Kiekviena dvigrandės plazmidės matrica sekvenuojama su dviem pradmenimis, kurie konverguoja menamoje nikavimo vietoje. Jeigu nikuojantis fermentas yra specifiškas grandinei, viena sekvenavimo reakcija turėtų sustoti trūkio vietoje. Jeigu naudojama Taq DNR polimerazė sekvenuojant didezoksi terminacijos metodu, adeninas (A) pridedamas prie pradmens prailginimo produkto galo nuo matricos nepriklausomo transferazinio aktyvumo.
[0084] 7. Mutacijos identifikavimas endonukleazėje
[0085] Dominantys mutantiniai klonai sekvenuojami aminorūgščių pakeitimų nustatymui.
[0086] Jeigu yra daugiau negu vienas aminorūgšties pakeitimas(i), tuomet tikslingas pakeitimas(i) patvirtinamas kryptingos mutagenezės būdu.
[0087] 8. Nikuojančio fermento aktyvumo optimizavimas
[0088] Nikuojančio fermento aktyvumo optimizavimas gali būti baigtas vykdyti aminorūgšties liekanos, identifikuotos 7 pakopoje, kryptinga mutageneze. Kai kuriais atvejais, variantai su DNR nikuojančiu aktyvumu taip pat rodo silpną dvigrandės DNR skėlimo aktyvumą. Siekiant optimizuoti nikuojantį aktyvumą, identifikuota aminorūgšties liekana gali būti pajungiama kryptingai prisotinimo mutagenezei, išskiriant likusių aminorūgščių pakeitimus (pavyzdžiui 18 mutacijų). Tuomet nikuojantis DNR aktyvumas palyginamas tarp visų mutantų. Atrenkamas geriausiai nikuojantis variantas su minimaliu dvigrandės DNR kirpimo aktyvumu. Variantai, turintys skirtingus aminorūgščių pakeitimus toje pačioje pozicijoje, gali būti išskirti tam kad parodyti optimalų nikuojančio fermento aktyvumą. Aminorūgšties liekanos, paveikusios nikuojantį aktyvumą, gali būti atskirtos arba sujungtos tam, kad būtų gautas geresnės kokybės nikuojantis fermentas. Aminorūgšties pakeitimai, duodantys nikuojantį aktyvumą, gali būti įvesti į izošizomerus arba neošizomerus arba į fermentus su gimininga atpažinimo seka ar panašia aminorūgščių seka (nuo 15% iki 99% aminorūgščių sekos panašumas).
[0089] 9. Vietos specifinių nikuojančių endonukleazių gryninimas
[0090] Baltymo gryninimo palengvinimui, tag baltymas (peptidas), toks kaip His-tag, chitiną surišantis domenas ar maltozę surišantis domenas gali būti pridedamas prie nikuojančio fermento N- arba C- galo. Po išgryninimo, tag gali būti pašalinamas veikiant proteaze arba baltymų kirpimu (splicing).
[0091] 10. Fermento variantų atrinkimo šeimininku kamienai
[0092] Nikuojančių fermentų variantų atrinkimo bakteriniai šeimininkai neapsiriboja E. coli. Kiti bakteriniai šeimininkai, kaip Bacillus ir Pseudomonas taip pat gali būti naudojami iš anksto tikintis atitinkamo klonavimo/ekspresijos vektoriaus turėjimo ir gana didelio DNR transformacijos ar elektroporacijos efektyvumo. Termofiliniams fermentams gali būti naudojami Thermus thermofhilus šeimininkas ir Thermus-E. coli purtymo (shuttle) vektorius (Wayne et al. Gene 195:321-328 (1997)). Šis genetinės atrankos nikuojančių fermentų išskyrimo metodas gali būti pritaikytas ir DNR skaldantiems fermentams, tokiems kaip fago terminazė, transpozazė, rekombinazė, integrazė, introno koduojama endonukleazė arba inteino koduojama endonukleazė.
[0093] Aukščiau aprašytas baltymų inžinerijos metodas gali būti pritaikytas IIA tipo fermentuose viršutinę arba apatinę grandinę nikuojančių endonukleazių gavimui. Pavyzdžiuose llS tipo restrikcijos endonukleazė SapI buvo modifikuota siekiant suformuoti SapI variantą, kuris daugiausia nikuoja apatinę grandinę buvo pavadintas kaip Nb.SapI 33 variantas. Be to, buvo išskirti kai kurie SapI variantai išimtinai nikuojantys viršutinę grandinę. Labiausiai aktyvus viršutinės grandinės variantas turintis aminorūgšties pakeitimą E250K ir buvo pavadintas Nt.SapI (E250K).
[0094] Yra daugeriopi nikuojančių endonukleazių pritaikymai. Jie apima:
[0095] 1) Grandinės perkėlimo DNR amplifikacija. Nikuojančiu fermentu gali būti įvestas specifinis trūkis į DNR matricą. Bst DNR polimerazė arba kitos DNR polimerazės gali inicijuoti naujos grandinės sintezę nuo trūkio ir perkelti nikuotą grandinę, susidarant linijiniam DNR amplifikacijos produktui.
[0096] 2) Geno fragmentų surinkimo rekombinantinė technologija. Išskirstyti trūkiai gali būti įvesti į viršutinę ir apatinę grandines tam, kad susidarytų dideli lipnūs galai (8-20 bp ilgio). Komplementarūs lipnūs galai gali būti atkaitinti kartu ir taip išvengta ligavimo pakopos atkaitinta DNR gali būti naudojama tiesiog transformacijoje, elektroporacijoje ar transfekcijoje. Nikuojantys fermentai gali būti naudojami gaminant ssDNR galus DNR fragmentų surinkimui linijinėje ar apskritimo formoje. Grandinei specifiniai DNR nikuojantys fermentai yra naudojami viengrandžių sričių formavimui, nikuojant prie viengrandės srities ribos, arba priešingoje DNR grandinėje (sukuriant galines viengrandes sritis) arba toje pačioje grandinėje (sukuriant viengrandžius plyšius) (U.S. patentas Nr. 6660475).
[0097] 3) Genetinio polimorfizmo nustatymas. Maži PGR fragmentai gali būti amplifikuoti nuo genominės DNR. Nikuojančiu fermentu gali būti įvestas trūkis į taikinį. Po denatūravimo HPLC, nikuotas produktas gali būti "perskaitytas" masių spektrometru siekiant nustatyti genetinius pakitimus (alteracijas). Nikuojantys fermentai gali būti naudojami onkogeninių mutacijų pašalinimui, bakterinių ar virusinių patogenų nustatymui.
[0098] 4) Specifinis genomo taikinys. Nikuojantys fermentai, turintys ilgą atpažinimo seką arba pastarąją konjuguotą su PNA gali nutaikyti specifinę sritį genome.
[0099] 5) DNR dupleksas, turintis vieną trūkį, rodo pakeistą migraciją judrumo gelyje bandymuose. Ši charakteristika gali būti naudojama tiriant skirtingą bazių išsidėstymą ir artimiausių kaimynų energetiką.
[0100] 6) Nikuotų DNR dupleksų arba DNR su plyšiais ruošimas, tiriant DNR ekscizijų atitaisymą.
[0101] Šie išradimo įgyvendinimai toliau iliustruoti sekančiais pavyzdžiais. Pavyzdžiai pateikti tam, kad padėtų suprasti išradimą ir ne interpretuojami kaip jo apribojimas. Yra susitarta, kad patyrę tyrinėtojai gali su šiuo išradimu daryti nedideles modifikacijas ir variacijas ir pasiekti tą patį rezultatą. Nuorodos pacituotos aukščiau ir žemiau čia yra įtrauktos į nuorodas.
[0102] PAVYZDŽIAI
[0103] 1 pavyzdys. Grandinę specifiškai nikuojančio fermento Nb.Sapl konstravimas iš restrikcijos endonukleazės SapI
[0104] 1. Ekspresijos vektoriaus. turinčio strategiškai fiksuota SapI kirpimo vieta. projektas ir konstravimas.
[0105] Ekspresijos vektoriaus pACYCT7-ter (Xu et al, Mol. Gen. Genet. 260:226-231 (1998)) polilinkeris buvo modifikuotas, įvedant SapI kirpimo vietą, Du komplementarūs fosforilinti oligonukleotidai (25 nukleotidai) išvalyti poliakrilamido gelyje, atkaitinti ir liguoti į pACYCT7-ter BamHI kirpimo vietą. Iš tinkamo įterpimo, sukurto vienoje BamHI kirpimo vietoje išplaukia SapI, SalI ir BbvCI kirpimo vietos (žr. Fig. 1). Modifikuotas polilinkeris buvo patvirtintas sekvenuojant su T7 universaliu pradmeniu iš NEB Nr. S 1248S, New England Biolabs, Inc,. Beverly, MA. Modifikuotas vektorius pavadintas pSAPV6.
[0106] 5' P-GATCCGCTCTTCGTCGACCCTCAGC 3'viršutinis įterptas polilinkeris (296-332) (SEQ ID NO:1)
[0107] 5' P-GATCGCTGAGGGTCGACGAAGAGCG 3' apatinis įterptas polilinkeris (296-333) (SEQ ID NO:2)
[0108] 2. Klaidas sąlygojanti sapIR geno PGR mutagenezė ir mutantinės plazmidžių bibliotekos
[0109] išskyrimas.
[0110] sapIR genas (1299 bp) buvo PGR amplifikuotas nuo Saccharopolyspora rūšies DNR (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), naudojant 0,4J.lM oligonukleotidų pradmenį, turintį NdeI ir BamHI kirpimo vietas:
[0111] 5' AGAGTCITGCATATGCGGAGGCITGCTACAC 3' tiesioginis (298-022) (SEQ ID NO:3)
[0112] NdeI kirpimo vieta pabraukta.
[0113] 5' TGGTTTGGATCCCCTGAAATGGGITAGGGC 3' reversinis (298-023) (SEQ ID NO:4) BamHI kirpimo vieta pabraukta.
[0114] Termociklinimas buvo atliktas per 30 ciklų (94°C 30 s , 56°C 30 sir 72 °C 90 s) esant NEB ThermoPol buferio (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), turinčio 7 mM MgS04 ir penkis vienetus Taq DNR polimerazės. Kad būtų įtakojamas mutacijos dažnumas, buvo dedama nevienoda dNTP koncentracija: 0.2 mM dA TP, 0.2 mM dGTP, 1.0 mM dCTP ir 1.0 mM dITP. Termociklinimas buvo atliekamas naudojant Gene Amp® 2700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). PGR produktas buvo išvalytas , naudojant Qiagen spin kolonėlę, hidrolizuotas su NdeI/BamHI ir išvalytas iš agarozės gelio. Išvalyta genų biblioteka buvo liguota į pSAPV6, paruoštą hidrolizuojant NdeIlBamHI ir veikiant CIP. Inkubavus per naktį 16°C temperatūroje, ligavimo mišinys buvo kaitinamas 10 min 65°C temperatūroje ir 4 valandas dializuojamas prieš distiliuotą vandenį. Pabaigoje ligavimo mišinys buvo elektroporacijos arba cheminės transformacijos būdu transformuotas į ERI992 ląsteles ir išsėtas ant LB agaro, turinčio 30μg/ml chloramfenikolo ir 80 μg/ml X-gal. ERI992 yra DNR pakenktas indikatorinis kamienas, turintis dinDI:lacZ genų suliejimą (V.S. patentas Nr. 5498535). Jeigu ląstelės yra išsėjamos ant terpės, turinčios X-gal, mėlynos spalvos išsivystymas žymi SOS atsako indukciją. Buvo padaryta prielaida, kad pilnai nikuojantis endonukleazės klonas gali indukuoti SOS atsaką E. coli ląstelėse. Todėl 120 vidutiniškai mėlynų išaugusių kolonijų buvo sutelkta į dvi grupes. Dvi sankaupos po l0 ml buvo auginama iki prisotinimo 37°C temperatūroje ir išskiriama plazmidinė DNR.
[0115] 3. SapI klonų, pasirinktinai nikuojančiu dvigrande DNR, atranka in vitro.
[0116] Kiekviena grupė buvo kryptingai nikuojama arba su N.BbvCIA arba N.BvbCIB 37°C temperatūroje 60 min. N.BbvCIA buvo taikomas viršutinės grandinės nikuotų SapI klonų atrinkimui (Fig. 3) ir N.BvbCIB buvo taikomas apatinės grandinės nikuotų SapI klonų atrinkimui (Fig. 2). Paskui nikuojantys fermentai buvo pašalinti naudojant Qiagen centrifugavimo kolonėlę ir sudėtos adapterio ligavimo reakcijos. N.BbvCIA nikuota DNR buvo liguota su 10 pmol fosforilinto 296-334 adapterio per naktį 16°C temperatūroje. N.BbvCIB nikuota DNR buvo liguota su 10 pmol fosforilinto 296-335 adapterio per naktį 16°C temperatūroje:
[0117] 5' P-TCGACCCTCACTACGTIAGTICGCATCTGC 3' (296-334) (SEQ ID NO:5)
[0118] 5' GCAGATGCGAACTAACGTAGGGGT 3' (296-335) (SEQ ID NO:6)
[0119] Klionovo fragmentas (0.5 vieneto) ir 30 μM dNTP buvo pridėta prie "B ligavimo", viršutinės DNR grandinės, komplementarios suliguotam adapteriui, gavimui. Ši pakopa yra būtina, norint gauti matricą apačiai specifinės amplifikacijos strategijai (Fig. 2). Po užpildymo Klionovo fragmentu, polimerazė ir adapterio perteklius pašalinti Qiagen centrifugavimo kolonėle. Užbaigiant, "A ligavimo" ir "B ligavimo" produktai buvo amplifikuoti PGR, naudojant tą pačią porą pradmenų (298-024 ir 275-224):
[0120] 5' P-GGGAGATCTCOATCCCGCGAAATIAATACG 3' (298-024) (SEQ ID NO:7) yra tiesioginis pradmuo, kuris leidžia klonuoti į Smal kirpimo vietą priešais T7 promotorių.
[0121] 5' GCAGATGCOAACTAACGTAG 3' (275-224) (SEQ ID NO:8) yra strateginis reversinis pradmuo.
[0122] PGR amplifikacija buvo atlikta per 33 ciklus (94°C 30 s, 56°C 30 s ir 72°C 90 s) esant TermoPol buferiui, 0.2 μM kiekvieno dNTP, 0.4 μM kiekvieno pradmens ir Taq/Vent polimerazių mišiniui (5/0.1 vieneto). Laukiamas 1493 bp produktas buvo stebimas abiejose A ir B matricose, į kurias ligavimo metu buvo įdėtas adapteris. Matricos iš tariamo ligavimo ei kurį nebuvo įdėtas adapteris) nedavė norimo PGR produkto. Pakankamam produkto kiekiui gauti, reikalingam perklonavimui į pSAPV6, buvo pravestos papildomos PGR reakcijos per 35 ciklus, naudojant 58°C anilinimo temperatūrą. POR produktai išvalyti per kolonėlę, sukarpyti BamHI ir suliguoti su pSAPV6, paruošta su Smal/BamHI ir paveikta CIP. Ligavimo reakcijos mišinys transformuotas į T7 ekspresijos šeimininką ER2744 [fhuA2 lacZ::T7 gene l ginV44eI4-rfbDl( RelAI( EndAl spoTI( Thy-I (mcrC-mrr) 114::IS10], turintį dvigubą metilazės kloną pBR322-SapIMIM2 (U.S. patentas Nr. 5663067).
[0123] 4. Nikuojančių fermentų atranka iš ląstelių ekstraktų.
[0124] Fermento superprodukavimas buvo atliktas .inokuliuojant atskirus transformantus į 10 ml LB, turinčios 30 μg/ml chloramfenikolo ir 100 μg/ml ampicilino, auginant iki vėlyvosios log fazės ir indukuojant su 0.1 mM IPTG 37°C temperatūroje per naktį. Ląstelės buvo išsodintos centrifuguojant ir 1.0 ml ląstelių ekstrakto buvo gauta dalinai suardžius ultragarsu 10 mM Tris-HCL (pH 7.8), 10 mM mM β-merkaptoetanolio ir 0.1 mM EDTA. Nikuojantis aktyvumas buvo tiriamas inkubuojant pUCl9 (viena SapI kirpimo vieta) su 3 μl ląstelių ekstrakto 45 min. 37°C temperatūroje, esant IXNEB buferio 4 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Iš 16 spėjamų apatinei grandinei specifinių klonų vienas ląstelių ekstraktas parodė žymų nikuojantį aktyvumą (Fig. 4). Šis klonas nuo pat pradžių buvo pavadintas N.33. Iš 32 spėjamų viršutinei grandinei specifinių klonų, nė vienas ląstelių ekstraktas nerodė nikuojančio aktyvumo. Sekvenuojant N.33 klono sapIR geną parodytos mutacijos atskleidžiančios 4 aminorūgščių pakeitimus: D34Y/182V1P168L1R420I.
[0125] 5. SapI N.33 varianto specifiškumo grandinei nustatymas.
[0126] pUC19 DNR substratas buvo inkubuojamas arba su N.33 ląstelių ekstraktu, arba dalinai išvalytu baltymu. Nikuotas DNR produktas buvo valomas iš I % žemos lydymosi temperatūros agarozės gelio. Nikuota matrica buvo identifikuota sekvenuojant dvigrandę matricą su dviem pradmenimis, kurie susilieja SapI atpažinimo vietoje: (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA).
[0127] 5'GGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACG 3' (266-113) (SEQ ID NO:9) anilinamas prie pUC transkripcijos pradžios taško.
[0128] 5' CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGAC 3' (SEQ ID NO:lO) (Nr. S1224S) M13/pUC sekvenavimo pradmuo.
[0129] Sekvenavimo reakcija, naudojant Nr. SI224S pradmenį sustoja ties GCTCTICCGCTA(SEQ ID NO: II) (Fig. 6). Ši sutrumpintra seka yra nikuotos apatinės grandinės panaudojimo matrica produktas. Apatinė grandinė nikuojama tarp 4-to ir 5-to nukleotido už SapI atpažinimo sekos. Galinis adeninas (A) yra klaidingas, kadangi jis yra pridedamas Tag DNR polimerazės transferazinio aktyvumo. Patvirtinus grandinės specifiškumą, N.33 buvo pervadintas Nb.SapI (33 variantas).
[0130] 6. Nb.SapI (33 variantas) išvalymas ir charakterizavimas.
[0131] N.33 klonas buvo transformuotas į iš anksto modifikuotas ER2848 [Er2744 su Iaclq su F' (TetR)] su pBR322-SapIMIM2. Išankstinė modifikacija yra atliekama transformuojant į ER2848 metilazinę plazmidę ir po to gaminant kompetentines ląsteles CaCl2 metodu. ER2848[pACYCT7ter-N.33, pBR322-SapIM I M2] buvo auginamos prie 30°C galutiniame 3 litrų tūryje. Nikuojančio fermento superprodukcija buvo indukuojama pridedant 0.5 mM IPTO per paskutines 5 augimo valandas. Ląstelės išsodinamos centrifuguojant ir šaldomos prie -20°C. Valymo procedūra buvo numatyta atitinkamai pagal laukinio tipo SapI restrikcijos endonukleazės valymo procedūrą. Ląstelių nuosėdos buvo resuspenduojamos, pridedant 60 mL HEPES skaldymo buferio: 20 mM HEPES (pH 7,7), 200 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% glicerolio. Ląstelės buvo lizuojamos suardant ultragarsu, kuris buvo kontroliuojamas Bradfordo būdu matuojant išsiskyrusį baltymą. Ląstelių lizatas buvo centrifuguojamas prie 15000 aps ir nuskaidrėjęs lizatas buvo užneštas ant DEAE-Sefarozės kolonėlės prieš tai ekvilibruotos su HEPES skaldymo buferiu. Pratekėjęs skystis buvo surenkamas ir užnešamas ant heparino-sacharozės FF kolonėlės, prieš tai ekvilibruotos su HEPES skaldymo buferiu (be EDTA). Buvo surinkta trisdešimt frakcijų, suformuojant 0,2-1,0 M NaCI eliucijos gradientą. Iš jų 3-16 frakcijos, ištyrus su pUCI9, turėjo žymų nikuojantį aktyvumą. Aktyvusis telkinys buvo užneštas ant hidroksiapatito biogelio HTP kolonėlės, prieš tai ekvilibruotos su HEPES skaldymo buferiu (be EDTA). A fosfato gradientas tarnavo baltymo išplovimui iš hidroksiapatito dervos. A menzūra su HEPES buferiu (be EDTA), tuo tarpu B buferis turi 0,9 M kalio fosfato (pH 7,7), 200 mM NaCI, 1 mM DTI ir 10% glicerolio. Iš dvidešimt aštuonių išplautų frakcijų, 9-14 rodė nikuojantį aktyvumą. Aktyvusis telkinys buvo praleistas per antrą DEAE pakopą, kad būtų atliktas nukleorūgšties pašalinimas. Antroji DEAE kolonėlė buvo ekvilibruota su 20 mM HEPES (pH 7,7), 200 mM NaCI, 0,3 mM EDTA, I mM DTI ir 10% glicerolio. Paskutinėje kolonėlėje buvo frakcionuojama heparin sefaroze FF, naudojant 0,2-1,0 M NaCI HEPES skaldymo buferyje (turinčiame 1 mM EDTA). Paskutinioji 15 ml sankaupa buvo dializuota per naktį SapI saugojimo buferyje (be BSA): 10 mM Tris-HCL (pH7,5), 300 mM NaCI, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTI ir 50% glicerolio. Po dializės tūris buvo sumažintas iki 5,5 ml.
[0132] Išvalyta Nb.SapI (33 variantas) partija buvo titruojama 50 μl reakcijos tūryje, turinčiame 4xNEB buferį (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), I ug pUC 19 ir 2 ul praskiesto fermento (Fig. 5). 4-kartinis fermento praskiedimas po 60 min prie 37°C pašalina visas superspiralizuotas pUC 19 formas. Tuo būdu, išvalyta 33 varianto partija turi 2 vienetus/al. (Vienas vienetas apibrėžiamas kaip fermento kiekis, reikalingas 1 μg pUC 19 paversti į atviro apskritimo formą per 60 min, esant optimaliai reakcijos temperatūrai.)
[0133] Po išgryninimo ER2848 [pACYCT7ter-Nb.SapI33, pBR322-SapIMI M2] kamienas išskiria 1100 vienetų Nb.SapI (33 variantas) iš ląstelių gramo.
[0134] 7. Individualių aminorūgščių pakaitų, rastų 33 variante, reikšmės analizavimas kryptingos mutagenezės būdu.
[0135] Prisotinimo mutagenezei buvo pasirinktos 34, 168 ir 420 pozicijos. Buvo rasti daugybiniai pakeitimai 420 padėtyje fermentuose, geriausiai nikuojančiuose pUC19. Analizuojant variantus iš ląstelių ekstrakto, 420 pozicijoje buvo patvirtintos, leidžiančios didžiausią konversiją į nikuojančią formą, sekančios liekanos: asparaginas, serinas, treoninas, leucinas, izoleucinas, valinas, alaninas ir glicinas.
[0136] 5'GCGGGATCCGTTCAGTCCAGTGGTAGTGCTTCATCGAGAAGTGCGTCTGGNNNT TCCTTCAACTTCTC 3' (300-045) (SEQ ID NO:12) reversinis pradmuo dėl 420 randomizacijos
[0137] N = tolygus A, C, G, T mišinys
[0138] Molekulinės biologijos metodikos, pritaikytos šiame darbe:
[0139] Plazmidinės DNR išskyrimo metodika: Qiagen centrifugavimo kolonėlės buvo naudojamos plazmidinės DNR išskyrimui. Ląstelių lizė, baltymų ir ląstelinės DNR denatūracija buvo atliekama pridedant Pl, P2 ir N3 buferius. Nuskaidrintas supernatantas, turintis plazmidinę DNR, buvo užnešamas ant Qiagen centrifugavimo kolonėlių ir plaunamas PE buferiu. Plazmidinė DNR išplaunama distiliuotu vandeniu.
[0140] Transformacijos atlikimo metodika: Chemiškai kompetentinės ląstelės buvo paruoštos veikiant eksponentinės fazės E. coli ląsteles ledo šaltumo 70 mM CaCb 30 min. Kompetentinės ląstelės sumaišytos su plazmidine DNR buvo inkubuotos lede 30 min. Po 3-5 min. temperatūrinio veikimo 37°C, buvo pridedamas vienodas tūris LB terpės ir ląstelės inkubuojamos 37°C temperatūroje vieną valandą. Plazmidžių atrinkimui transformantai išsėjami ant LB agaro lėkštelių su atitinkamu antibiotiku.
[0141] Elektroporacijos atlikimo metodika: Elektrokompetentinės ląstelės buvo paruoštos dukart paveikiant eksponentinės fazės E. coli ląsteles su ledo šaltumo 10% gliceroliu (500 ml 10% glicerolio ląstelių nuosėdoms iš 500 ml ląstelių kultūros). Sumaišius 50mL ląstelių su DNR, atliekama elektroporacija , esant sekančioms sąlygoms: 1.8 kV, 200:0, 25 mF, 0.1 cm kiuvetė. Į ląsteles pridedama SOC terpės (0.5 ml) ir inkubuojama 1 val. transformantų išdauginimui. Plazmidžių atrinkimui transformantai išsėjami ant LB agaro lėkštelių su atitinkamu antibiotiku.
[0142] "Run-off" sekvenavimas ir DNR sekvenavimas: "Run-off" sekvenavimui buvo naudojami nikuoti produktai arba iš gelio išvalyti nikuoti produktai. Sekvenavimo reakcijose buvo naudojama Big dye AmpliTag didezoksi terminatorinis sekvenavimo rinkinys (Applied Biosystems, Foster City, CA). DNR seka buvo nustatyta automatiniu sekvenatoriumi AB1373A. DNR seka buvo redaguojama ir analizuojama su DNASTAR Lasergene ir GCG programomis.
[0143] 2 pavyzdys. Viršutinę grandinę specifiškai nikuojančio fermento Nt.Sapl konstravimas iš restrikcijos endonukleazės SapI
[0144] Nepasisekimas tiesiogiai išskirti viršutinę grandinę nikuojantį variantą buvo labiausiai
[0145] tikėtinas padarant riboto dydžio pradinę biblioteką (tik 120 klonų). Be to, vėliau buvo nustatyta, kad genetinė atranka ERI992 kamiene buvo nepakankamai griežta tiksliam variantų su dvigubos grandinės skėlimo aktyvumu išskyrimui. Retai kerpančio fermento atvejais (t.y. SapI) buvo naudinga genetinės selekcijos stadiją atlikti su kamienu, koduojančiu T7 RNR polimerazę, kad būtų sumažinta konstitutyvimė SapI ekspresija iš pSAPV6.
[0146] I. Mutantinės plazmidžiu bibliotekos išskyrimas genetine atranka iš ER2848.
[0147] Toks pat mutagenizuotas sapIR genas, aprašytas 1 pavyzdyje, buvo liguotas į pSAPV6 ir transformuotas į ER2848 elektroporacijos būdu. Transformacijos mišinys buvo išsėtas ant LB agaro su Km ir inkubuotas per naktį 30 oC ir 37 oC temperatūrose. Prie abiejų inkubavimo temperatūrų buvo vienodas kolonijų skaičius. Vidutiniškai 600 išaugusių kolonijų buvo surinkta į 500 ml LB terpės su Km. Kultūra auginama iki vėlyvos log fazės 37 oC temperatūroje, išsodinama centrifuguojant ir plazmidinė DNR išskiriama naudojant Qiagen Maxiprep.
[0148] 2. Nikuotos plazmidžiu bibliotekos atranka in vitro elektroforeze agarozės gelyje.
[0149] Mažas mėginys (2 iš 150 J.l I) ER2848 plazmidžių bibliotekos buvo pajungta elektroforezei agarozės ge1yje (0.7% agarozė, 150 mV 90 min). Lėčiau migruojanti DNR buvo išpjautra iš gelio ir išvalyta adsorbcija prie silicio dioksido (Compass ONA purification kit, American Bioanalytical, Natick, MA). Ši stadija pašalina daugumą superspiralizuotos plazmidinės DNR ir tarnauja bibliotekos praturtinimui nikuota plazmidine DNR.
[0150] 3. SapI klonu, kurie pasirinktinai nikuoja dvigrandės DNR viršutine grandine. atranka in vitro.
[0151] Praturtinta plazmidžių biblioteka buvo inkubuojama su N.BbvCIA 60 min prie 37 oC, kad būtų linearizuoti plazmidžių klonai, prieš tai nikuoti viršutinėje grandinėje Sapl kirpimo vietoje in vivo, Tokiu atveju, apatinės grandinės nikavimas N.BbvCIA sukuria ID-ties bazių lipnų galą (Fig. 3). Po to, N.BbvCIA buvo pašalintas su Qiagen centrifugavimo kolonėle ir atlikta adapterio ligavimo reakcija. Su N.BbvCIA nikuota DNR buvo liguota su fosforilintu adapteriu 296-334 pernakt 16 °C temperatūroje. Adapterio pridėjimas atliekamas po nikuotos DNR kaitinimo 65 °C temperatūroje, kad būtų garantuotas 10-ties bazių lipnaus galo atskyrimas. T4 DNR ligazė (1000 vienetų) pridedama atšaldžius iki kambario temperatūros. Taip pat buvo sudedamas kontrolinis ligavimas be adapterio.
[0152] 5' P-TCGACCCTCACTACGTTAGTTCGCATCTGC 3' (296-334) (SEQ ID NO: 13)
[0153] Po ligavimo per naktį 16 °C temperatūroje adapterio perteklius pašalinamas Qiagen centrifugavimo kolonėle. "A ligavimo" produktas PGR amplifikuojamas, naudojant pradmenų 298-024 ir 275-224 porą. Matrica, turinti suliguotą adapterį, davė numatyto dydžio (1493 bp) PGR produktą, tuo tarpu kai matrica iš kontrolinio ligavimo produkto nedavė. "A ligavimo" produktai buvo surinkti (400 ml), išvalyti per Qiagen centrifugavimo kolonėlę ir hidrolizuoti su NdeI ir BamHI. Po išvalymo iš gelio, genų biblioteka buvo liguojama į pSAPV6. Ligavimo reakcijos mišinys transformuotas į ER2744 [pBR322-SapMIM2] elektroporacijos būdu ir, inkubavus per naktį 37 oC temperatūroje, išsėtas ant LB agaro lėkštelių su Am ir Km.
[0154] 4. Nikuojančio fermento variantu atranka iš ląstelių ekstraktu.
[0155] Keturiasdešimt aštuonios kolonijos buvo individualiai inokuliuotos į l0ml LB kultūros su Am ir Km. Kultūros buvo auginamos 37 °C temperatūroje iki vėlyvosios log-fazės ir per naktį indukuotos 0.1 mM IPTG. Kultūros buvo centrifuguojamos ir ląstelių nuosėdos resuspenduojamos 1 ml ultragarsinimo buferio: 10 mM Tris-HCI (pH 7.8), 10 mM β-merkaptoetanolio ir 0.1 mM EDTA. Ultragarsinimas buvo atliekamas naudojant Ultrasonic Cell Disruptor. Nikuojantis aktyvumas buvo tiriamas inkubuojant pUC 19 (su viena SapI kirpimo vieta) su 3 μl Iąstelių ekstrakto 60 min 37 °C temperatūroje, esant lXNEB buferio 4 (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Penki iš 48 ląstelių ekstraktų rodė žymų nikuojantį aktyvumą (Fig. 7). Visi penki klonai (Nr. 2, Nr. 11, Nr. 9, Nr. 15 ir Nr. 18) atsakingų aminorūgščių pakeitimų nustatymui buvo sekvenuoti. Du aktyviausiai nikuojantys variantai (Nr. 11 ir Nr. 15) turėjo tris dažniausius pakeitimus: K80E, E250K ir K273R. Kryptinga PGR mutagenezė (persidengiančio prailginimo metodas) buvo atlikta nustatyti kuris pakaitas(i) atsakingas už nikuojantį fenotipą, Iš šių tyrinėjimų nustatyta, kad abu viengubi E250K ir K273R variantai produkuoja išimtinai viršutinę grandinę nikuojantį pUC 19 produktą, kadangi K80E variantas buvo negatyvus nikuojančiam aktyvumui. Kituose tyrimuose Q240R ir G271R irgi rodė viršutinę grandinę nikuojantį aktyvumą, kai buvo tiriama su pUC 19. Keturi viršutinę grandinę nikuojantys variantai buvo pavadinti Nt.SapI (E250K), Nt.SapI (K273R), Nt.SapI (Q240R) ir Nt. SapI (G271 R). Visų keturių viršutinę grandinę nikuojančių variantų palyginamoji analizė parodė, kad E250K pakeitimo rezultate gautas aktyviausias viršutinę grandinę nikuojantis SapI variantas.
[0156] E250K mutagenezės pradmenys:
[0157] 5' GCACTIATCACACGTAAGCGAAAGATATTCCTG 3' (304-120 tiesioginis) (SEQ ID NO:14)
[0158] 5' CAGGAATATCTTTCGCTIACGTGTGATAAGTGC 3' (304-121 atvirkštinis) (SEQ ID NO:15)
[0159] 5. Nt.SapI CE250K) grandinės specifiškumo nustatymas.
[0160] pUCI9 (1 μg) DNR substrato buvo inkubuojama su 5 μI E250K ląstelių ekstrakto. Nikuotas DNR produktas išvalytas iš 1 % žemos lydymosi temperatūros agarozės gelio. Nikuota matrica buvo identifikuota sekvenuojant dvigrandę matricą su dviem pradmenimis, kurie susieina SapI kirpimo vietoje: (266-113 ir New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, katalogo Nr. SI224S). Naudojant 266-113 pradmenį sekvenavimo reakcija baigiasi ties GGAAGCA (Fig. 9). Ši sutrumpinta seka gaunama naudojant matrica viršutinę nikuotą grandinę. Viršutinė grandinė nikuojama tarp l-mo ir 2-ro nukleotidų už SapI atpažinimo sekos. Galinis adeninas (A) yra klaidingas, kadangi jis prijungiamas Tag DNR polimerazės transferazinio aktyvumo.
[0161] 6. Nt.SapI CE250K) superprodukavimas.
[0162] Nt.SapI buvo superprodukuotas ER2848[pACYCT7ter-Nt.SapI, pBR322-SapIM 1 M2, pSYX33-EarIMIM2] kamiene, auginant LB terpėje su Km/Am/Kn 30 oC temperatūroje iki vėlyvosios log fazės ir po to 5 val. indukuojant 0,5 mM IPTG 30 oC temperatūroje. Ląstelių ekstraktas iš l0 ml Nt.SapI (E250K) buvo titruotas 50-yje μl reakcijos, turinčios 4NEB buferio (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), 1 μg pUC 19 ir 2 μl ekstrakto arba praskiesto ekstrakto (Fig. 8). Reakcija su 2 μl nepraskiesto ekstrakto po 60 min 37 oC temperatūroje iš esmės pašalina superspiralizuotą pUC 19 formą. Taigi, Nt.SapI produkavimo lygis iš ER2848 [pACYCT7ter-Nt.SapI, pBR322-SapIMI M2, pSYX-EarIMIM2] nustatytas 10000 vienetų/gramo šviežių ląstelių.
1. Grandinei specifinių nikuojančių endonukleazių konstravimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima:
a) ląstelių-šeimininkių, stokojančių metilazinės apsaugos prieš restrikcįjos endonukleazes, transformavimą plazmidžių biblioteka, turinčia atsitiktinai mutuotą geną, koduojantį restrikcijos endonukleazę, plazmides be to dar apimančias sekos vietą išorėje geno, kuris yra skaldomas arba nikuojamas geno ekspresuojama endonukleaze;
(b) auginimą (a) pakopos transformantų, išskyrimą iš jų plazmidžių ir atlikimą fakultatyvios atrankos in vitro, nustatant, kuri plazmidė yra nikuota in vivo;
(c) skaldymą (b) pakopos plazmidžių su iš anksto nustatyta grandinei specifine nikuojančia endonukleaze, turinčia skirtingą skėlimo vietą, negu atsitiktinai mutagenizuotos restrikcijos endonukleazės skėlimo vieta ir iš anksto paruoštus priešingoje grandinėje pirmą ir antrą lipnius galus plazmidėje;
(d) atsitiktinai mutagenizuoto endonukleazės geno lipnių galų naudojimą amplifikacijai plazmidėse ir po to klonavimą amplifikuoto geno ląstelėse-šeimininkėse arba selektyvaus markerio ligavimą į plazmidę tarp pirmo ir antro lipnių galų ir geno klonavimas selektyvioje terpėje; ir
(e) žinomo grandinės specifiškumo nikuojančios endonukleazės gavimą iš (d) pakopos DNR klono.
2. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad restrikcijos endonukleazės skėlimo vieta yra lokalizuota transkripcijos kryptimi už geno.
3. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (b) pakopa be to apima: transformantų surinkimą prieš išskiriant plazmides.
4. Būdas pagal 3 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (b) pakopa be to apima: surinktų transformantų praturtinimą genais, ekspresuojančiais nikuojančią endonukleazę.
5. Būdas pagal 4 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad praturtinimo punktas apima: plazmidinės DNR išskyrimą iš surinktų transformantų, plazmidžių analizavimą atskyrimo būdais, atskiriant nikuotą DNR nuo superspiralizuotos ir linij inės DNR, ir retransformavimą iš anksto modifikuotų E. coli ląstelių-šeimininkių nikuota plazmidine DNR.
6. Būdas pagal 5 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad atskyrimo priemonės yra parinktos iš gelio elektroforezės ir tankio centrifugavimo.
7. Būdas pagal 3, 4, ir 5 punktus, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad be to apima dviejų auginamų transformantų telkinių formavimą, kad vienas telkinys būtų testuojamas viršutinės grandinės skėlimo aktyvumui nustatyti, o kitas telkinys apatinės grandinės skėlimo aktyvumui nustatyti.
8. Būdas pagal 7 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (d) pakopa be to apima viengrandžio DNR adaptoriaus ligavimą su iš anksto nustatytu lipniu galu geno amplifikavimui.
9. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad antra iš anksto nustatyta skėlimo vieta yra fiksuota viršutinėje plazmidės grandinėje, apatinės grandinės trūkio vietos nustatymui.
10. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad antra iš anksto nustatyta skėlimo vieta yra fiksuota apatinėje plazmidės grandinėje, viršutinės grandinės trūkio vietos nustatymui.
11. Būdas pagal 9 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (c) pakopa be to apima viengrandžio adaptoriaus ligavimą su pirmu lipniu galu, kur pirmas lipnus galas yra gretimas genui.
12. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas turi vieno ar daugiau nukleotidų deleciją, inserciją ar pakeitimą,
13. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas genas turi daugybę mutacijų.
14. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas genas turi vieną mutaciją.
15. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas genas turi deleciją nukleotidų srityje nuo 3 iki 600.
16. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad (a) pakopos ląstelės-šeimininkės paruošimas yra parinktas iš gramneigiamų arba gramteigiamų bakterijų.
17. Būdas pagal I punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad be to apima: mutacijos identifikavimą nikuojančioje endonukleazėje, palyginus su laukinio tipo restrikcijos endonukleaze, iš kurios ji yra gauta ir ekvivalentinės mutacijos įvedimą kryptingos mutagenezės būdu i restrikcijos endonukleazės izošizomerą arba neošizomerą.
18. Būdas pagal 1 punktą be to apimantis papildomos mutacijos įvedimą į (f) pakopos nikuojančią endonukleazę kryptingos mutagenezės būdu nikuojančio aktyvumo sustiprinimui arba dvigrandės DNR skėlimo minimizavimui, arba abiems variantams.
19. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad mutagenizuotas restrikcijos endonukleazės genas yra IIA tipo endonukleazės genas.
20. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad nikuojanti endonukleazė yra termostabili nikuojanti endonukleazė.
21. Grandinei specifinės DNR nikuojančios endonukleazės konstravimo būdas, be sis k i r i ant i s tuo, kad apima:
(a) ląstelių-šeimininkių trasformavimą plazmidėmis, turinčiomis atsitiktinai mutagenizuotą restrikcijos endonukleazės geną, ląstelės-šeimininkės stokoja apsauginio metilinimo;
(b) viengrandžio adaptoriaus ligavimą su sutelktomis plazmidėmis, išskirtomis iš išaugusių (a) pakopos transformantų, nustatymui kuri plazmidė koduoja viršutinę grandinę arba apatinę grandinę nikuojančius restrikcijos endonukleazės variantus;
(c) mutagenizuoto restrikcijos endonukleazės geno amplifikavimą ląstelių-šeimininkių transformacijai;
(d) nustatymą kurios ląstelės-šeimininkės turi nikuojantį aktyvumą ir jų nikuojantį fenotipą; ir
(e) sukonstruotų nikuojančių endonukleazių gavimą.
22. Būdas pagal 1 arba 21 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad restrikcijos endonukleazė yra SapI.
23. Nikuojanti endonukleazė apimanti Nt.SapI.
24. Nikuojanti endonukleazė apimanti Nb.SapI.
25. Nikuojanti endonukleazė pagaminta pagal 1 punktą,
26. Vieno arba daugiau vietos specifinių trūkių įvedimo į iš anksto parinktas DNR duplekso grandines būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad būdas apima: DNR duplekso hidrolizę nikuojančia endonukleaze, pagaminta pagal I punktą palankiomis nikuojančiam aktyvumui sąlygomis.