[LT] Monokloniniai antikūnai, pasižymintys imunostimuliuojančiu poveikiu, specifiškai rišasi prie B limfoblastoidinių ląstelių ir sukelia periferinių kraujo limfocitų proliferaciją bei aktyvaciją. Juos sušvirškus laboratoriniams gyvūnams, pastebimas priešvėžinis efektas.
[EN] A monoclonal antibody having immuno-stimulatory effect, binds specifically to B lymphoblastoid cells and induces proliferation and activation of peripheral blood lymphocytes, and when injected into tumor-bearing animals elicits an anti-tumor effect.
[0001] Pagrindinė šio išradimo sritis yra imunoterapija, būtent monokloniniai antikūnai, tokios terapijos rėmuose naudojami daugeliui ligų, pvz., vėžiui gydyti.
[0002] Įvairios vėžio formos yra svarbiausia žmonių mirties priežastis. Viena trečioji JAV gyventojų suserga vėžiu, o 20 % miršta nuo vėžio (494 000 individų per 1988).
[0003] Labiausiai paplitę vėžio gydymo būdai yra chirurgija, švitinimas bei chemoterapija. Pastaraisiais metais buvo pasiūlytas kitas gydymo būdas, pagrįstas biologinio atsako modifikatorių (BAM) naudojimu. Dažniausiai naudojami BAM yra citokinai (pvz.: interleukinas 2 (IL-2) ir a-interferonas (a-IFN)), aktyvuotos vienbranduolės ląstelės (pvz.: limfokinais aktyvuotos kilerinės ("žudikės") ląstelės (LAK) bei antikūnai. BAM tiesiogiai veikia auglius ir netiesiogiai stiprina nespecifinius ar specifinius imunologinius bei citotoksinius mechanizmus.
[0004] Kol kas BAM naudojimas nedavė jokio realaus klinikinio efekto, svarbiausia to priežastis yra jų toksiškumas bei sukeliami pašaliniai reiškiniai. Buvo išbandyta ir aktyvi imunizacija prieš vėžį, tačiau šis metodas taip pat pasirodė esąs neaktyvus. Kai kurie monokloniniai antikūnai (mAk) yra tinkami vėžio diagnostikai bei gydymui, tačiau lig šiol nėra įrodymų, kad nors vieni mAk būtų efektyvūs standartinės vėžio gydymo procedūros rėmuose.
[0005] Nustatyta, kad įvairūs mAk, gebantys susirišti su determinantėmis, esančiomis ant T-ląstelių paviršiaus, sukelia šių ląstelių proliferaciją, aktyvaciją bei diferenciaciją (Clark, E.A. and Ledbetter, J.A., Amplification of the immune response by agonistic antibodies, Immunol., Today, 7:267-270,1986.). Buvo pastebėta, kad mAk, prisirišantys prie CD3/TCR komplekso ant T-ląstelių (Meuer, S.C., Huspey, R.E., Cantrell, D.A., Hodgdon, J.C, Schlornman, S.F., Smith, K.A. and Reinberg, E.L., Triggering of the T3-T1 antigen-receptor complex results in clonal T cell proliferation through an interleukin-2 dependent autocrine pathway, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 31:1509-1513, 1984.,Van Wauve, J.P., De Mey, J.R. and Gooser, J.G, OKT3: a monoclonal anti-human T lymphocyte antibody and potent mitogenic properties,/. Immunol., 124:2708-2713, 1980., Jung, G., Martin, D.E. and Muller-Eberhard, J.H., Induction of cytotoxicity in human peripheral blood mononuclear cells by monoclonal antibody OKT3, J. Immunol., 139:639-644,1987.) paviršiaus, bei mAk, prisirišantys prie CD2 (Van Lier, R., Blocmena, E., Brouwer, M., Van Heijm, J., Weinreich, S. and Aarden, L., Studies on monocyte dependence on T-cell proliferation induced by monoclonal antibodies directed against region I and II of CD2 antigen, Immunology, 67:333-338, 1989.) antigeno receptoriaus ant T-ląstelių, o taip pat abiejų rūšių aukščiau paminėtų antikūnų prisirišimas prie T-ląstelių sukelia T-ląstelių proliferaciją, IL-2 receptoriaus ekspresiją ir IL-2 sintezę T-ląstelėse, skatinančią citolitinj procesą. Buvo parodyta, kad CD3 mAk sužadina priešvėžini aktyvumą in vivo gyvūnų modelyje (Ellenhorn, J.D., Hirsch, R., Schreiber, H. and Bluestone, J.A., In vivo administration of an anti-CD3 prevents malignant progressor tumor growth, Science (Washington DC), 242 :569-571, 1988., Gallinger, S., Hoskins, D.W., Mullen, J.B.M., Wong, A.H.C. and Roder, J.C., Comparison of cellular immunotherapies and anti-CD3 in the treatment of MCA-38-LD experimental hepatic metastases in C57BL/6 mice, Cancer Res., 50:2476-2480, 1990)
[0006] Yra paskelbta apie įvairius kitus antikūnus prieš T-limfocitų antigenus, kurie, susirišę su ląstelėmis, jas aktyvuoja, pvz.: mAk prieš CD5 (Van Lier, R., Blocmena, E., Brouvver, M., Van Heijm, J., Weinreich, S. and Aarden, L., Studies on monocyte dependence on T-cell proliferation induced by monoclonal antibodies directed against region I and II of CD2 antigen, Immunology, 67:333-338, 1989.), prieš CD69(Moretta, A., Goggi, A., Pende, D., Tripodi, G., Orengo, A., Pella, N., Augugliaro, R., Bottino, G, Ciccone, E. and Moretta, I., CD69-mediated pathway of lymphocyte activation: anti-CD69 monoclonal antibodies trigger the cytolytic activity of different lymphoid effector cells vvith the exception of cytolytic T lymphocyte expresing T cell receptor a/b, J. Exp. Med., 174 :1393-1398, 1991.), ir prieš CD28 (Van Lier, R.A., Brouwer, M. and Aarden, L.A., Signals involved in T-cell activation. T cell proliferation induced through the synergistic action of anti-CD28 and ant-CD2 monoclonal antibodies, Eur. J. Immunol., 13:167-172, 1988., Jenkins, M.K., Taylor, P.S., Norton, S.D. and Urdahl, K.B., CD28 delivers a costimulatory signal involved in antigen-specific IL-2 production by human T cells, J. Immunol., 147 :2461-2466, 1991).
[0007] Paskelbti duomenys apie tai, kad anti-CD28 mAk sulėtina pelių melanomos augimą, nors visiškai ir nepašalina šio tipo auglių (Tovvnsend. S.E. and AJlison, J.P., Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T cells by B7-transfected melanoma cells, Science (Washington CD), 259:368-370,1993).
[0008] Žinoma, kad mAk prieš žmogaus B limfoblastoidinių ląstelių liniją, vadinama " Daudi", stimuliuoja pelės limfocitus ir žmogaus periferines T- ląsteles (Hardy, B., Dotan, D. and Novogrodsky, A., A monoclonal antibody to human B lymphoblastoid cells activates human and murinę T lymphocytes, Cell Immunol., 118 :22-29.1989).
[0009] Šio išradimo svarbiausias aspektas yra monokloniniai antikūnai, pasižymintys imunostimuliuojančiu poveikiu, gebantys prisirišti prie B limfoblastoidinių ląstelių ir sukeliantys periferinių kraujo limfocitų proliferaciją bei aktyvaciją; monokloniniai antikūnai, pasižymintys šiomis savybėmis sušvirkštus juos laboratoriniams gyvūnams, turintiems auglius, sužadina priešvėžinį efektą šiems gyvūnams.
[0010] Priešvėžinis efektas yra biologinis efektas, kuris gali pasireikšti kaip auglio apimties sumažėjimas, metastazių skaičiaus sumažėjimas, gyvenimo trukmės pailgėjimas arba daugelio fiziologinių simptomų, susijusių su vėžiniu susirgimu, susilpnėjimas. Be to, priešvėžiniu efektu galima laikyti ir mAk savybę sustabdyti pirminio auglio atsiradimą. Dėl savo savybių šio išradimo mAk gali būti naudojami tiek ūmaus vėžio gydymui, tiek ir vėžio profilaktikai.
[0011] Šio išradimo antikūnai gali būti paruošiami, imunizuojant gyvūnus imunogenu, kuris yra B limfoblastoidinės ląstelės, lizuotos B limfoblastoidinės ląstelės arba jų membraninis preparatas. Po imunizacijos atsiradus imuninei reakcijai imunizuotuose gyvūnuose, B-limfocitai yra išskiriami iš gyvūnų kraujo, ląstelių linijos auginamos ir selekcionuojamos taip, kad būtų gauta linija, išskirianti antikūnus, gebančius prisirišti prie imunogeno. Tokie mAk toliau selekcionuojami ir atrenkami tie, kurie sugeba sukelti periferinių kraujo limfocitų proliferaciją ir aktyvaciją.
[0012] Tam, kad būtų gauti šio išradimo mAk, antikūnai, atrinkti aukščiau aprašytu būdu, toliau selekcionuojami ir atrenkami tie, kurie pasižymi priešvėžiniu efektu. Tam, kad būtų atrinkti tokie antikūnai, kaip taisyklė, taikomas gyvūnų vėžio modelis. Kartais efektas gali būti tiriamas ir įvairiuose in vitro modeliuose. Toks modelis, pavyzdžiui, gali būti bet koks laboratorinis gyvūnas, kuriam buvo sukeltas vėžys. Ypač tinkami, konkrečiai parenkant peles žmonių gydymo tikslams, yra modeliai, kuriuose auginami žmogaus augliai. Pastarojo tipo gyvūnų modelių pavyzdžiai yra pelės su susilpnintu imunitetu, pvz., SCID pelės arba pelės su pašalinta čiobrialiauke, kurioms buvo įšvirkštos ar implantuotos vėžinės ląstelės ar audinys, paimtas iš onkologinių pacientų. Tokioje selekcijoje mAk sugebėjimas sumažinti auglio dydį, pailginti gyvenimo trukmę ir t.t. yra nustatomas lyginant su kontrole (panašus gyvūnas, turintis auglį, nepaveiktas mAk arba paveiktas kitu mAk).
[0013] Šiuo selekcijos procesu taip pat tikrinamas mAk sugebėjimas užkirsti kelią auglio atsiradimui atitinkamame modelyje. Pavyzdžiui, mAk gali būti suleidžiamas gyvūnams, turintiems įgimtą polinkį vėžiniams susirgimams, ir tada auglio atsiradimas bei gyvūnų grupės, paveiktos mAk, išgyvenimo lygis yra lyginamas su kontroline grupe, kurios gyvūnams nebuvo suleisti antikūnai, o laikymo sąlygos buvo tos pačios. mAk sugebėjimas užkirsti kelią auglio atsiradimui dar sėkmingiau gali būti tikrinamas įvairiuose kituose gyvūnuose, neturinčiuose įgimto polinkio vėžiniams susirgimams, iš pradžių paveikus gyvūnus mAk, o po to suleidžiant piktybines ląsteles.
[0014] Tam, kad būtų pasiektas toks priešvėžinis efektas, gyvūnas turi būti paveiktas efektyviu šio išradimo mAk kiekiu. Terminą " efektyvus kiekis" reikėtų suprasti kaip tokį mAk kiekį, kuris sukelia terapinį efektą. Efektyvus kiekis, kurio reikia galutiniam terapiniam efektui gauti gali priklausyti nuo daugelio veiksnių, tokių kaip, pavyzdžiui, auglio tipas ar paciento būklės sunkumas (t.y. vėžio stadija), o taip pat nuo to, ar mAk vartojamas kartu su kita medžiaga, kuri kartu su mAk veikia papildančiai ar sinergetiškai (apie tokį dvigubą vartojimą žr. toliau).
[0015] Imortalizuota ląstelių linija, išskirianti šio išradimo mAk, gali būti išgauta daugeliu per se žinomų būdų, tokių kaip suliejimas su imortalizuota ląstelių linija taip, kad būtų gauta hibridoma, transformuojant EBV, genetiškai keičiant ląstelių linijas, pvz.: CHO ląstelių liniją, kurią galima išgauti daugeliu per se žinomu būdų ir t.t. Apskritai, imortalizuotų ląstelių linijų, išskiriančių monokloninius antikūnus, išgavimas šiandien yra rutininė, profesionalams žinoma procedūra, todėl ją aprašyti šiame dokumente nėra tikslinga.
[0016] Kaip taisyklė, jei mAk ketinamas naudoti žmonėms gydyti, imunogenas yra žmogaus kilmės. Vis dėlto kartais stebimas tarp-rūšinis kryžminis atsakas, ir retkarčiais įmanoma žmonėms taikyti mAk, gautus imunizavus ne žmogaus kilmės imunogenu, o, pvz., primatų kilmės.
[0017] Šio išradimo antikūnai - tai visuma monokloninių antikūnų, kurie gali priklausyti IgG ir IgM klasėms, gali būti šių antikūnų Fab fragmentai, F(ab') 2 fragmentai, viengrandžiai antikūnai ir pan. Be to, ne žmogaus kilmės antikūnai, pvz.: pelės, gali būti "sužmoginami" jvairiais genų inžinerijos metodais ("sužmogintas" antikūnas yra toks antikūnas, kuriame didesnioji molekulės dalis yra pakeista žmogaus kilmės molekulės dalimis).
[0018] Antikūnai, gauti pagal šį išradimą ir tinkami daugeliui terapinių indikacijų, naudojami vėžiui gydyti, pasirenkant tinkamiausią šiame išradime pateiktą kompoziciją. Nustatyta, kad monokloniniai antikūnai, gauti pagal šį išradimą, yra aktyvūs, mažinant daugelio auglių tumorigeniškumą.
[0019] Būdinga hibridominė ląstelių linija, gauta pagal šį išradimą, buvo deponuota Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institute Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 757224, Paryžiuje, Cedex 15, deponavimo Nr. 1-1397, 1994 metų sausio 28 dieną. Šios linijos ląstelės čia ir toliau žymimos "BAT-1 ląstelės", o atitinkami monokloniniai antikūnai - "BAT-1 mAk".
[0020] Monokloninių antikūnų, charakterizuojamų kaip BAT-1 mAk, ir būtent pačių BAT-1 mAk, panaudojimas yra tinkamiausias šio išradimo įgyvendinimas.
[0021] BAT-1 monokloniniai antikūnai buvo atrinkti pagal jų savybę prisirišti prie Daudi žmogaus limfoblastoidinės linijos ląstelių. Nustatyta, kad BAT-1 mAk rišasi prie baltyminės medžiagos (toliau žymima "BAT-1 rišantis baltymas"), kurios molekulinė masė pagal SDS-PAGE yra 48-50K daltonų.
[0022] BAT-1 rišantis baltymas suformuoja kitą šio išradimo aspektą. BAT-1 rišantis baltymas gali būti išskirtas naudojant įvairias per se žinomas priemones ir šio išradimo mAk. Tada BAT-1 rišančiu baltymu gali būti imunizuojami gyvūnai, tam, kad būtų gauti šio išradimo antikūnai.
[0023] Šis išradimas taip pat apima ir farmacinę kompoziciją, kurios veiklioji medžiaga yra šio išradimo mAk efektyvus kiekis bei fiziologiškai suderintas nešiklis.
[0024] Kitas šio išradimo aspektas yra išrasti mAk, skirti panaudoti efektyviais kiekiais gydyti imuninės sistemos sutrikimus, o ypač vėžį. mAk vartojami įprastais parenteraliniais būdais, pvz., intraveniniu būdu (i.v.), leidžiami į pilvo ertmę (i.p.) ar į raumenis (i.m.). Tirpikliu gali būti bet kas iš žinomų per se, pvz.: NaCl tirpalas arba bet kuris kitas tinkamas fiziologinis tirpalas.
[0025] Pastebėta (kaip jau buvo minėta anksčiau), kad šio išradimo mAk yra aktyvūs, mažinant daugelio auglių tumorigeniškumą. Šio išradimo mAk efektyvumas, mažinant tumorigeniškumą, siejasi su jų sugebėjimu sužadinti citotoksinį limfocitų aktyvumą. Tam, kad būtų palaikytas šis aktyvumas, kartais palanku vartoti šio išradimo mAk kartu su kitais preparatais, kurie gali papildyti vienas kito veikimą ar veikti sinergetiškai. Kaip pavyzdį galima paminėti įvairius citokinus, tokius kaip IL-1 (interleukinas-1), LI-2, IL-6 ir a-IFN (a-interferonas).
[0026] Šio išradimo mAk gali būti naudingi ir kitoms, nevėžinėms, ligoms gydyti, kur aktyvacija ar kiti mAk poveikiai imuninės sistemos citotoksiniam aktyvumui gali turėti terapinį efektą. Tokios ligos, pavyzdžiui, gali būti ankstyvos ŽIV (virusas, sukeliantis įgytą imunodeficito sindromą - AIDS) infekcijos stadijos, įvairūs autoimuniniai susirgimai ar kai kurie įgimto ar įgyto imunodeficito atvejai.
[0027] Gydant vėžį, šie antikūnai gali būti naudojami vienu iš dviejų atvejų: diagnozavus pirminį ar antrinį auglį arba profilaktikos tikslais, kai yra didelė auglio atsiradimo rizika, pavyzdžiui, individams, patyrusiems apšvitinimą ar turintiems įgimtą polinkį. ŽIV infekuotiems asmenims šie mAk gali būti taikomi, kai dar nėra jokių ligos požymių, o taip pat ir ankstyvose ŽIV infekcijos proceso stadijose.
[0028] Toliau šis išradimas bus iliustruojamas įvairiais pavyzdžiais, aprašančiais eksperimentus, kurie demonstruoja priešvėžinį gydomąjį poveikį. Suprantama, pavyzdžiai pateikiami tiktai iliustravimo tikslais ir jokiu būdu nėra vieninteliai.
[0029] Fig.l rodo BAT monokloninių antikūnų (mAk) prisirišimo prie išgrynintų žmogaus T-limfocitų pratekančios citometrinės analizės rezultatus. BAT antikūnų prisirišimas buvo įvertintas antriniais antikūnais, žymėtais fluorescensine žyme - FITC-žymėti ožkos antikūnai prieš pelės antikūnus. Fig.l a - fono reikšmė be BAT antikūnų; Fig.lb - antikūnai prieš CD3; Fig.lc - BAT-1; Fig.ld - BAT-5; Fig.le - BAT-2; Fig.lf - BAT-4; Fig.2 rodo žmogaus periferinio kraujo monocitų (PKM) (kairioji plokštelė) ir Jurkat T ląstelių (dešinioji plokštelė), dvigubos žymės pratekančios eitom etrinės analizės rezultatus, kur pirminiai antikūnai yra arba BAT m Ak, arba anti CD3 mAk, o antriniai antikūnai - FITC-konjuguoti ožkos antikūnai prieš pelės IgG. Fig.2 A - neatskirtos ląstelęs; Fig.2 A(a) - PKM ląstelės, padengtos BAT mAk; Fig.2 A(b) - PKM ląstelės, paveiktos anti-CD3 mAk; Fig.2 A(c) - Jurkat T ląstelės, paveiktos BAT mAk; Fig.2 A(d) - Jurkat T ląstelės, paveiktos anti-CD3; Fig.2 B - atskirtos ląstelęs;
[0030] Fig.2 B(b) - (Rl) ląstelės, paveiktos BAT mAk; Fig.2 B(c) - (Rl) ląstelės, paveiktos anti-CD3 mAk; Fig.2 B(d) - (R2) ląstelės, paveiktos BAT mAk;
[0031] Fig.3 rodo BAT surišančio baltymo paviršiaus ekspresijos ir CD3 ekspresijos ant žmogaus PKM dvigubai žymėtais antikūnais pratekančios citometrinės analizės rezultatus, kur BAT mAk žymėti FITC, o antikūnai prieš CD3 žymėti PE. Fig.3 A - neatskirtos; Fig.3 A(a) - Becton-Dikinson vienalaikė neigiama kontrolė; Fig.3 A(b) - PE-antiCD3; Fig.3 A(c) - FITC-BAT mAk; Fig.3 A(d) - dvigubas žymėjimas FITC- BAT mAk ir PE-antiCD3; Fig.3 B - atskirtos ląstelęs; Fig.3 B(a) PKM ląstelės, suskirstytos į smulkias (Rl) ir dideles (R2) ląsteles; Fig.3 B(b) (Rl) ląstelės dvigubai žymėtos FITC- BAT mAk ir PE-antiCD3; Fig.3 B(c) (R2) ląstelės dvigubai žymėtos FITC- BAT mAk ir PE-antiCD3; Fig.4 rodo BAT-1 antikūnų prisirišimo prie įvairių Daudi ląstelių lizatų Western Blot analizę. Fig.4(l) - Daudi ląstelių lizatai; Fig.4(2) - lizatai paveikti neuraminidaze (0.2 v/ml); Fig.4(3) - lizatai paveikti neuraminidaze (0.4 v/ml);
[0032] Fig.5 [3H]timidino įsijungimo j ląsteles, kurios buvo kultivuojamos šešias dienas, esant didėjančioms BAT mAk koncentracijoms, grafinis vaizdas: BAT-1 (- ■*-), BAT-2 (- X -), BAT-3 (- • -), BAT-5 (- * -), BAT-6 (-1 -), BAT-7 (-■-). Fig.6 yra grafinis vaizdas eksperimento, kuriame citotoksinio aktyvumo indukcija buvo tiriama PKM ląstelės, kurios buvo kultivuojamos su 2.5 ųg/ml BAT mAk įvairius laiko intervalus. HT-29 (kairėje) ar RC 29 (dešinėje) ląstelės buvo parinktos kaip ląstelės taikiniai. Efektorių ir taikinių santykis buvo 20:1. Kontrolė (- 0 -), BAT-1 (- • -), BAT-2 (-X -), BAT-3 (- ^ -). Fig.7 rodo C57BL pelių, kurioms buvo suleistos B-16 melanomos ląstelės, plaučius: viršutinė eilė rodo pelių, kurioms buvo suleistos tik šios ląstelės, plaučius po 24 dienų; apatinė eilė rodo pelių, kurioms buvo suleistos B-16 melanomos ląstelės, o praėjus 14 dienų į veną suleista 10 pg f BAT-1 mAk, plaučius. Fig.8 Eksperimentų, pademostruotų Fig.7, grafinė santrauka, rodanti metastazių skaičių plaučiuose pelių, kurioms buvo suleista B-16 melanomos ląstelės, 3LL Lewis plaučių karcinomos ląstelės ar MCA 105 fibrosarkomos ląstelės, praėjus vienam mėnesiui. Rezultatai apibendrina 3-4 eksperimentus, atliktus su kiekviena iš auglių rūšių. 10 ųg/pelei BAT-1 doze paveiktos (+) ar nepaveiktos (-) pelės, praėjus 2 savaitėms po vėžinių ląstelių suleidimo. Metastazė (• ), nėra metastazių (0). Fig.9 rodo pelių, kurioms buvo suleista 3LL Lewis plaučių karcinomos ląstelės, plaučius. Panašiai kaip ir Fig. 7 , viršutinė eilė rodo pelių, kurioms buvo suleistos tik vėžinės ląstelės, o
[0033] apatinė eilė rodo pelių, kurioms praėjus 14 dienų j veną suleista 10 jag f BAT-1 mAk, plaučius.
[0034] Fig.10 rodo panašų į Fig. 9 parodytą eksperimentą, kur naudojamos vėžinės ląstelės yra MCA 105 fibroblastomos ląstelės.
[0035] BALB/c pelės buvo imunizuotos membraniniu Daudi ląstelių preparatu. Daudi ląstelių membranos buvo paruoštos hipotoninio glicerolio šoko metodu (Jett, M., Seed, T.M., and Jamieson, G.A., J. Biol. Chem., 252:2134, (1977)). Ant 50-80xl06 ląstelių, suspenduotų FBT ir inkubuotų, esant 37°C, buvo palaipsniui užsluoksniuotas 30 % glicerolis. Po 5 minučių inkubacijos ant ledo ląstelės buvo centrifuguojamos ir resuspenduojamos šaltame Tris lizuojančiame buferyje (10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, pH 7.4), maišomos 5 min., esant 4°C ir centrifuguojamos, esant 700 g. Supernatantas pašalinamas ir centrifuguojama, esant 3300 g (10 min., 4°C). Nuosėdos dar kartą praplaunamos, ir du supernatantai, turintys membraninę frakciją, suliejami į vieną. 260 įj.1 membraninio preparato (3 mg/ml) emulguojami 260 įiI pilno Freund'o adjuvanto ir sušvirkščiami BALB/c pelėms j pilvo ertmę. Po trijų savaičių pelių blužnys buvo išoperuotos. Splenocitai buvo sumaišyti su mielomos ląstelių linija NS-0 santykiu 10:1. Sumaišymui buvo naudojamas polietilenglikolis, ir šios hibridomos buvo auginamos selektyvioje terpėje pagal Kohler and Milstein (Kohler, G., and Milstein, C, Nature, (London) 256:495. (1975)).
[0036] Imobilizuotų ląstelių imunofermentinė analizė (IFA) ant Daudi ląstelių buvo taikoma augančių hibridomų supernatantų aktyvumui įvertinti (Glassy, M.C. and Surh, C.D., J. Immunol. Method, 81:115 (1985)). Teigiami hibridomų supernatantai toliau buvo selekcionuojami pagal jų sugebėjimą sužadinti žmogaus PKM proliferaciją, analizuojami pagal [3H], Teigiami klonai buvo perklonuoti, naudojant ribinio praskiedimo metodą, pakartotinai patikrinti ir auginami.
[0037] Iš augimo terpės mAk buvo išskirti, išsodinant 50% amonio sulfate ir dializuojant FBT. Toliau gryninama afininės chromatografijos būdu, naudojant sefarozės kolonėlę, padengtą antikūnais prieš pelių imunoglobulinus.
[0038] Augimo terpė
[0039] Visos ląstelės buvo suspenduotos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10 % veršelio embriono serumu (VES), Na-piruvatu (1.1 mg/ml), L-glutaminu (0.3 mg/ml) ir antibiotikais (200 v/ml penicilino ir 10 pg/ml) ir inkubuojama drėgname inkubatoriuje, esant 5 % angliarūgšties. IL-2 aktyvumas išreikštas Cetus vienetais (1 Cetus vienetas lygus 3 tarptautiniams vienetams).
[0040] Žmogaus periferinio kraujo vienbranduolės ląstelės (PKVL) buvo gautos iš sveikų suagusių donorų kraujo, centrifuguojant fikolio-hypaąue tankio gradiente (Histopaąue, Sigma). PKVL nuo monocitų buvo atskirtos naudojant Sephadex G10 kolonėles. T-ląstelės buvo atskirtos SRBC rozečių metodu. CD3-teigiamų ir Leu 19 teigiamų ląstelių išskyrimas buvo atliktas naudojant imunomagnetinę techniką. PKVL kultūra, 5-6 dienas inkubuota su BAT mAk ar kontrole, buvo plaunama FBT tris kartus. Į ląsteles pilnoje RPMI terpėje įdedami nekonjuguoti antikūnai prieš CD3 arba Leul9 (CD56) ir inkubuojami vieną valandą, esant 4° C. Įmagnetintos dalelės, padengtos antikūnais prieš pelės imunoglobulinus, įdedamos 30 min. Prie dalelių prilipusios ląstelės pašalinamos magnetu, ir toliau analizuojamas neprilipusių ląstelių citotoksinis aktyvumas ir dažoma pratekančios citometrijos metodais.
[0041] Citotoksiškumo analizė
[0042] Citotoksiškumo analizė atliekama pagal toliau pateiktą schemą: 2-4xl06 ląstelių-taikinių sumaišoma su 200 jaCi 51Cr-chromato vienai valandai terpėje be serumo. Jos plaunamos tris kartus pilna terpe ir galiausiai resuspenduojamos RPMI-10% FCS, tada išsėjama po 104 ląstelių į šulinėlį. Ląstelės-efektoriai yra kultivuojamos, limfocitai, gauti iš normalaus periferinio kraujo, inkubuojami įvairius laiko tarpus su skirtingais mAk, izotipinė kontrolė atliekama su IgG ir IL-2. Prieš analizę ląstelės plaunamos tris kartus RPMI terpe, gyvybingumui tikrinti jos dažomos 1% tripano mėliu, sumaišomos su ląstelėmis-taikiniais įvairiais efektoriaus/taikinio santykiais apvaliadugnėse mikrotitravimo plokštelėse ir inkubuojamos 3 valandas, esant 37°C 5% CO2. Terpės supernatantai buvo atskirti ir nustatytas jų aktyvumas p-scinciliatoriniu skaitikliu. Maksimalus izotopų atsiskyrimas (MA) gaunamas inkubuojant ląsteles-taikinius su tritonu x-100. Spontaninis atsiskyrimas (SA) yra matuojamas inkubuojant taikinius tik su terpe. Ląstelių lizavimo procentas apskaičiuojamas pagal (EA-SA/MA-SA)xlOO, kur EA yra eksperimentinis atsiskyrimas nuo efektorių.
[0043] PKM ląstelės (4xl06/ml) buvo kultivuojamos 6 dienas kartu su BAT mAk. Po to ląstelės plaunamos tris kartus ir, naudojant įmagnetintas daleles, padengtas antikūnais prieš pelės F(ab')2, atskiriamos CD3 ir Leul9 ląstelės ir tikrinamas citotoksiškumas prieš K562 ir Daudi ląsteles.
[0044] Ląstelės paviršiaus antigenai buvo nustatyti pratekančiosios citometrijos būdu, naudojant FACS 440 (Becton-Dickinson). Kiekvienai analizei imama 106 ląstelių. Ląstelės buvo dažomos, po to inkubuojamos, esant optimalioms pelės mAk prieš žmogaus CD3,1L-2 receptorių ar gautų mAk BAT 1-9 koncentracijoms. Šiame netiesioginiame dažyme ožkos antikūnai prieš pelės F(ab') 2 konjuguoti su FITC buvo naudojami kaip antriniai antikūnai. Visos inkubacijos buvo atliktos FBT, pH 7.4, kuriame buvo 1% BSA ir 0.5% Na-azido, esant 4 °C, inkubacijos trukmė - 30 min., po to plaunama tris kartus tuo pačiu buferiniu tirpalu. Analizuojama 104 nudažytų ląstelių.
[0045] BAT mAk surišančių determinančių nustatymas ant Daudi B limfoblastoidinių ląstelių lizatų buvo atliktas naudojant Western Blot techniką. Trumpai tariant, 50xl06 ląstelių/ml, suspenduotų FBT, buvo laipsniškai užsluoksniuotos 30% gliceroliu, membranos atskirtos centrifuguojant.
[0046] Membraninių preparatų pavyzdžiai buvo atskirti SDS-PAGE (12%) ir perkelti ant nitroceliuliozės blotų, kurie buvo pamerkti į FBT su 1% nuriebintu pienu. BAT mAk surišančic baltymo nustatymas ant nitroceliuliozės blotų buvo atliktas, inkubuojant šiuos blotus su BAT mAk dvi valandas kambario temperatūroje, po to 30 min. inkubuojama su krienų peroksidaze konjuguotais antikūnais 70 prieš pelės IgG (Fab') 2- Tada ląstelės buvo nuplautos, o juostos išryškintos O-dianizidino substratu.
[0047] Eksperimente buvo naudojami trijų tipų pelių auglių modeliai: B-16 melanoma, Lewis plaučių karcinoma (3LL) ir metilcholantrenu sukelta fibrosarkoma (MCA 105). C57BL pelėms (8 savaičių amžiaus) j veną suleista 50-200xl06 ląstelių. Po dviejų savaičių buvo suleista 1-10 |ig/pelei (i.v.) BAT-1, po 10 dienų pelės buvo išskrostos ir suskaičiuotos plaučių metastazės.
[0048] Devyni monokloniniai antikūnai (mAk), pažymėti BAT 1-9 ir gauti imunizuojant B limfoblastoidinėmis ląstelėmis, buvo selekcionuojami, pirmiausia, pagal sugebėjimą prisirišti prie Daudi ląstelių, o paskui - pagal sugebėjimą indukuoti žmogaus periferinio kraujo limfocitų proliferaciją. Šie BAT mAk izotipai buvo nustatyti dviem būdais: IFA ir Ochterlony metodu. Nustatyta, kad BAT'1,2,3,6,7 ir 9 priklauso IgGl klasei, tuo tarpu BAT 4 ir 5 priklauso IgM klasei. BAT8 buvo IgG2a.
[0049] Šių mAk prisirišimas prie išgrynintų periferinių žmogaus T ląstelių buvo išanalizuotas FACS, naudojant netiesiogini imunofluorescensinį dažymą. 1 pav. rodo tokio eksperimento FACS analizės rezultatus. Kaip matyti, BAT mAk rišasi prie periferinio kraujo CD3+ T ląstelių. Surišimo laipsnis svyravo nuo 44% BAT-2, 38% - BAT-5, 32% - BAT-1 iki šiek tiek silpnesnio surišimo - 13% - BAT-4. Išgryninti tų pačių donorų periferinio kraujo limfocitai nesuriša šių mAk (duomenys nepateikiami).
[0050] Kaip matyti Fig. 2, tolesnė FASC analizė parodė, kad BAT-1 rišasi prie žmogaus PKM CD3+, o taip ir prie Jurkat T-lastelių. Atradimas, kad BAT-1 rišasi prie PKM CD3+ ląstelių, buvo patvirtintas tolesne dvigubai žymėtų ląstelių FASC analize ( Fig.3 ).
[0051] Kaip parodyta 1 lentelėje, BAT-1 rišasi ne tik prie CD3 turinčių ląstelių, bet ir prie Leu 19/NK ląstelių.
[0052] Buvo ištirtas BAT-1 mAk susirišimas su įvairiais ląstelių tipais. Kaip parodyta 2 lentelėje, be PBL, Daudi ir Jurkat T-ląstelių linijos BAT-1 mAk rišasi prie K562, eritroleukemijos ląstelių linijos, MCF7, žmogaus krūties karcinomos ląstelių linijos. Susirišimo laipsnis svyruoja tarp BAT mAk ir tirtų ląstelių tipų, prie pelės inkstų karcinomos
[0053] (MR28) mAk 2-9 rišasi tik labai silpnai. BAT-8 rišasi prie MEL (pelės eritroleukemija) labai silpnai.
[0054] Tam, kad būtų nustatytas membraninio baltymo, sąveikaujančio su BAT-1 mAk, molekulinė masė, membraninis Daudi ląstelių preparatas buvo ištirpintas ir baltymas atskirtas SDS-PAGE. Perkelti nitroceliuliozės blotai buvo inkubuojami su BAT-1 mAk, po to inkubuojami su antikūnais prieš pelės IgG (Fab') 2 konjuguotais su krienų peroksidaze ir išryškinti O-dianizidino substratu. Nustatyta, kad BAT-1 rišančio baltymo molekulinė masė yra apie 48-50KDa (Fig.4 )
[0055] BAT mAk rišantis baltymas buvo išgrynintas naudojant BAT mAk konjugatą su sefaroze. Šis surišantis baltymas taip pat gali būti gautas, klonuojant molekulinės biologijos metodais. BAT-1 taikymas pelėms in vivo sužadino BAT antikūnų atsiradimą.
[0056] Žmogaus periferinio kraujo ląstelės buvo kultivuojamos 6 dienas, esant didėjančioms BAT mAk koncentracijoms, ir paveiktos [3H]timidinu 20 valandų prieš surinkimą.
[0057] Kaip matyti Fig.5 , laipsniškas BAT mAk koncentracijos didinimas, nors ir nelabai stipriai, bet statistiškai patikimai padidino [3H]timidino įsijungimą j PKM ląsteles. Vis dėlto, didelė antikūnų dozė susilpnino pasisavinimą. Kontroliniuose eksperimentuose pagal izotipą suporuoti antikūnai nepadidino [3H]timidino kiekio PBL ląstelėse. Tai rodo, kad agonistinis BAT mAk efektas priklausė nuo jų surišimo specifinių savybių. Pavyzdžiui, mūsų laboratorijoje paruoštas IgGl izotipo mAk prieš kiaušidžių karcinomos ląsteles nesukėlė
[0058] [3H]timidino pasisavinimo padidėjimo, skirtingai nuo BAT 1,2,3,6,7 ir 9 mAk, kurie irgi priklauso IgGl klasei.
[0059] Buvo tikrinamas žmogaus periferinio kraujo vienbranduolių ląstelių kultūros, inkubuotos su BAT mAk įvairius laiko periodus, sugebėjimas lizuoti auglių ląstelių linijas.
[0060] Kaip matyti iš 3 lentelės, žmogaus PKM ląstelės vieną savaitę inkubuotos su BAT mAk buvo citotoksiškos K562, žmogaus eritroleukemijos (NK jautrios) ir RC-29, inkstų karcinomos ląstelių linijoms (NK atsparios).
[0061] Buvo tiriama citotoksinio žmogaus PKM, stimuliuotų BAT mAk, aktyvumo kinetika. Kaip parodyta Fig.6, maksimalus citotoksiškumas žmogaus storosios žarnos karcinomai (HT-29) ir inkstų ląstelių karcinomai (RC-29) buvo pasiektas 7 dienas žmogaus PKM inkubavus su BAT mAk.
[0062] Tam, kad būtų išaiškinta ar BAT mAk sukeltas žmogaus PKM citotoksinio aktyvumo sustiprėjimas priklauso nuo NK ląstelių aktyvacijos, T ląstelių aktyvacijos ar abiejų kartu, NK ir T ląstelės buvo išgrynintos ir nustatytas BAT mAk sąlygojamas jų citotoksiškumas. NK ir T ląstelių gryninimui Leu 19 ir CD3 monokloniniai antikūnai buvo inkubuojami su žmogaus PKM ląstelėmis, po to - su magnetinėmis dalelėmis, padengtomis antikūnais prieš pelės IgG. Tai leido identifikuoti ląstelių subpopuliacijas, susirišančias su tam tikrais antikūnais. Kaip matyti toliau pateiktoje 4 lentelėje, lizavimo vienetų skaičius išaugo ir CD3, ir Leul9 atskirtose ląstelių kultūrose. BAT 6 ir 8 buvo naudojami šiuose eksperimentuose, taikiniai buvo žmogaus eritroleukemijos (K562) ir žmogaus limfomos (Daudi) ląstelės.
[0063] Sinergizmas tarp BAT mAk ir IL-2, sužadinant citotoksiškumą
[0064] Citotoksiškumo sužadinimas žmogaus PKM buvo tikrinamas, inkubuojant PKM ląsteles su BAT mAk ir IL-2 kombinacija. Suboptimali IL-2 koncentracija (lv/ml) buvo įdėta kartu su didėjančiomis BAT-2 mAk koncentracijomis. Citotoksiškumas buvo patikrintas po vienos savaitės K562 ir HT29 vėžinių ląstelių kultūrose. Kaip matyti iš 5 lentelės, nedidelės BAT-2 koncentracijos veikė sinergiškai su IL-2, sužadinant PKM ląstelių citotoksiškumą abiejų tipų ląstelėms-taikiniams.
[0065] Yra žinoma, kad a-IFN stiprina MHC-1 klasės antigenų ekspresiją. Todėl a-IFN taikymas turėtų skatinti priešvėžinį BAT efektą, kuris perduodamas per citotoksines ląsteles ir yra nukreiptas prieš jvairias auglių ląsteles (turinčias MHC klasės I antigeną).
[0066] BAT-1 mAk pasižymi stimuliuojančiomis savybėmis pelių splenocitų atžvilgiu, kurios panašios j žmogaus PKL. Tai yra: (i) padidinta splenocitų proliferacija in vitro, nustatoma pagal 3H timidino įsijungimą (6 Lentelė ); (ii) sinergetinis stimuliuojantis poveikis, inkubuojant splenocitus su BAT-1 ir IL-2 kombinacija (6 Lentelė); 6 lentelė
[0067] cpm [ 3H] Timidinas x 103 BAT- 1 IL2 Įig / ml ~ I 1 U/ ml 10 U/ ml j 1. 5+ 0. 07 16. 0+ 0. 9 67. 5±1. 6
[0068] _10 11. 0±0. 4 32. 1±1. 5 241. 6±17. 1 J 12. 9+ 0. 8 35. 9+ 3. 3 247. 8+ 1. 9
[0069] 0. 1 18. 1+ 0. 9 51. 0+ 7. 3 255. 1+ 18. 0 0. 001 10. 5+ 0. 1 34. 1+ 0. 5 215. 1+ 20. 8 0. 0001 2. 6+ 0. 1 13. 2+ 0. 9 73. 3 ±5 . 6
[0070] C57BL pelės splenocitai inkubuojami 5 dienas in vitro su įvairiomis BAT-1 koncentracijomis ir interleukinu 2 (lv ir 10 v per ml)
[0071] (iii) padidėjęs citotoksiškumas pelės splenocitų kulturose su BAT-1 ir tolesnis citotoksiškumo didėjimas po inkubacijos su interleukinu 2 (7 Lentelė). 7 lentelė Specifinis 51Cx išskyrimas (%) a BAT-1 Interleukinas- 2 ng/ ml - 1 u/ml 10 u/ ml 7. 4 10. 0 31. 1 100 249 313 52A 10 174 26/7 5Z8 1 123 219 4^8
[0072] 0. 1 12. 2 21. 7 45. 5
[0073] Citotoksiškumo indukcija C57BL pelių splenocitų kultūrose po 5 dienų inkubacijos in vitro, esant įvairioms BAT-1 koncentracijoms ir nedidelėms IL 2 dozėms.
[0074] aB16 melanomos ląstelės buvo naudojamos kaip taikiniai;
[0075] Pelių auglių ląstelės-taikiniai, kurioms buvo priskiriamas kilerinis BAT-1 aktyvuotų splenocitų efektas, buvo šios: B16 melanoma, Lewis plaučių karcinoma (3LL), fibrosarkoma (MCA 105), inkstų ląstelių karcinoma (MR 28) ir limfoma (YAC) (8 Lentelė).
[0076] Kaip matyti 9 lentelėje, BAT-1 pasižymėjo imunostimuliuojančiu poveikiu in vivo. Sis poveikis apima: (i) [3H]timidino įsijungimo j pelių, kurioms prieš 10 dienų buvo suleista BAT-1, splenocitus stimuliacija (9A Lentelė). Maksimali stimuliacija (dešimtkartinė) buvo pasiekta, suleidus
[0077] (ii) Citotoksiškumo indukcija pelių, kurioms buvo suleista BAT, splenocituose (9B Lentelė).Įvairios BAT-1 koncentracijos buvo švirkščiamos 10 dienų prieš atliekant citotoksiškumo analizę pelės melanomos (B16-F10) ląstelėms, inkstų ląstelių karcinomos (MR-28) ląstelėms ir limfomos (YAC) ląstelėms. Maksimalus efektas buvo pasiektas suleidus 10 (jg/pelei BAT dozę.
[0078] Kaip parodyta 10 lentelėje, BAT-1 taikymas pelėms, kurioms buvo suleistos melanomos ląstelės praėjus 14 dienų po vėžinių ląstelių suleidimo, sumažino metastazių skaičių pelių, turinčių B16, 3LL ir MCA auglius, plaučiuose.
[0079] al BAT- 1 panaikina pelių, kurioms buvo suleistos B16 melanomos ląstelės, plaučiu metastazes, naudojant nustatytą plaučiu metastazių modeli
[0080] C57BL pelėms į veną buvo suleista 50xl03 B16 melanomos ląstelių (10 lentelė). Po 24 dienų plaučiuose atsirado daugybė metastazių (beveik pasiektas didžiausias tankis, Fig.7, viršutinė eilė). Tuo tarpu Fig.7, apatinėje eilėje, matome pelių, kurioms buvo suleista BAT-1 (10 |ag/pelei), praėjus 2 savaitėm po B16 melanomos suleidimo, plaučius, kuriuose praktiškai nėra metastazių.
[0081] Fig.8 apibendrina šešių skirtingų eksperimentų rezultatus, atliktus esant panašioms į aukščiau aprašytas sąlygas.
[0082]
[0083] b. BAT- 1 panaikina pelių, kurioms buvo suleistos Lewis plaučiu karcinomos C3I 1, 1 ląstelės, plaučiu metastazes, naudojant nustatyta plaučiu metastazių modeli
[0084] Eksperimento sąlygos panašios j aprašytas B16 melanomai (žr. aukščiau), išskyrus tai, kad buvo suleista 2xl05 3LL ląstelių. Fig. 9 , viršutinėje dalyje matyti pelių, kurioms buvo suleista 3LL ląstelės, plaučiai su daugybe metastazių. Fig.9 apatinėje eilėje galima matyti pelių, kurioms buvo suleista BAT-1, plaučius praėjus 14 dienų po vėžinių ląstelių suleidimo. Plaučiuose metastazių beveik nėra.
[0085] c. BAT panaikina pelių, kurioms buvo suleistos MCA plaučiu fibrosarkomos ( MCA 105) ląstelės, plaučių metastazes, naudojant nustatytą plaučiu metastazių modeli
[0086] Eksperimento sąlygos panašios j aprašytas 3 LL Lewis plaučių karcinomos modelio atveju (žr. aukščiau). Fig.10, viršutinėje eilėje matyti pelių, kurioms buvo suleista MCA 105 ląstelės, plaučiai su daugybe metastazių. Fig.10 apatinėje eilėje galima matyti pelių, kurioms buvo suleista BAT-1, plaučius, praėjus 14 dienų po vėžinių ląstelių suleidimo. Plaučiuose metastazių beveik nėra.
[0087] Pelės, kurioms suleista B16 melanomos ar 3LL ląstelės, kaip jau buvo minėta, miršta per 25-35 dienas po vėžinių ląstelių suleidimo. Priešingai tam (Fig.ll ), visos pelės, kurioms buvo suleista BAT-1 (10 Įig/pelei), praėjus 14 dienų po vėžinių ląstelių suleidimo išgyveno daugiau nei 100 dienų. Dauguma gyvūnų, kurie buvo stebėti 5 mėnesius, nesirgo ir jų skrodimo metu metastazių nepastebėta.
[0088] Pelių, kurioms buvo suleista vien tik BAT-1 mAk arba iš pradžių B16 melanomos ląstelės, o po to BAT-1 mAk, splenocitai buvo perkelti recipientinėms pelėms. Recipientinėms pelėms buvo sušvirkštos B16 melanomos arba 3LL vėžinės ląstelės. Kaip matyti 12 lentelėje, splenocitų perkėlimas iš pelių, kurioms buvo suleista BAT-1 mAk, sukėlė auglio regresiją pelėms, gavusioms perkeltus splenocitus. Efektyviausias gydymas buvo pasiektas, kai 103 splenocitų, gautų iš pelių, kurioms buvo suleista BAT-1 praėjus 14 dienų po B16 melanomos ląstelių suleidimo, buvo perkelta recipientinėms pelėms, turinčioms auglius. Kaip matyti 12 lentelėje, šiuo atveju melanomos ląstelės buvo visiškai pašalintos iš BĮ6 auglį turinčių recipientų ir stebima didelė 3LL auglių regresija, apie kurią galima spręsti iš metastazių skaičiaus o taip pat ir plaučių svorio.
[0089] Šie rezultatai rodo, kad splenocitai, gauti iš pelių, paveiktų B16 ir BAT-1 pasižymi priešvėžiniu poveikiu B16 ir 3LL augliams. Todėl įmanoma, kad BAT-1 stiprina nespecifinius ląstelinius efektorinius mechanizmus. Be to, auglio buvimas skatina tokių efektorinių ląstelių, kurias indukuoja BAT-1, susidarymą.
[0090]
1. Monokloninis antikūnas arba jo antigeną rišantis fragmentas, kuris yra:i) monokloninis antikūnas, išskirtas hibridominės ląstelių linijos, deponuotos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), deponavimo Nr. 1-1397, arbaii) monokloninis antikūnas, kuris rišasi prie to pat antigeno, kaip ir i) antikūnas.
i) monokloninis antikūnas, išskirtas hibridominės ląstelių linijos, deponuotos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), deponavimo Nr. 1-1397, arbaii) monokloninis antikūnas, kuris rišasi prie to pat antigeno, kaip ir i) antikūnas.2. Monokloninis antikūnas arba jo fragmentas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad juos išskiria hibridominė ląstelių linija, deponuota CNCM, deponavimo Nr. 1-1397.
3. Imortalizuota ląstelių linija, išskirianti antikūną pagal 1 arba 2 punktą.
4. Imortalizuota ląstelių linija pagal 3 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra hibridominė ląstelių linija.
5. Hibridominė ląstelių linija pagal 4 punktą, besiskirianti tuo, kad ji yra hibridominė ląstelių linija, deponuota CNCM, deponavimo Nr. 1-1397.
6. Monokloninis antikūnas arba jo fragmentas pagal 1 arba 2 punktą, skirti panaudoti imuninės sistemos paveikimui.
7. Monokloninis antikūnas arba jo fragmentas pagal 1 arba 2 punktą, skirti panaudoti individo imuninės sistemos citotoksinio aktyvumo stimuliacijai.
8. Monokloninis antikūnas arba jo fragmentas pagal 1 arba 2 punktą, skirti panaudoti priešvėžinių preparatų gamybai.
9. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje kaip veiklioji medžiaga yramonokloninio antikūno pagal 1 arba 2 punktą efektyvus kiekis bei fiziologiškai suderintas nešiklis.
10. Farmacinė kompozicija pagal 9 punktą, besiskirianti tuo, kad savo sudėtyje turi kitą nei minėtas antikūnas medžiagą, kuri gali sužadinti citotoksinį limfocitų aktyvumą, veikdama papildančiai arba sinergetiškai su minėtu antikūnu.
11. Baltyminė medžiaga, prie kurios specifiškai rišasi monokloninis antikūnas pagal 1 arba 2 punktą.
12. Medžiaga pagal 11 punktą, besiskirianti tuo, kad jos molekulinė masė, nustatyta pagal gel-elektroforezę, yra 48-50 K daltonų.