[LT] Pateikti išskirtas trobopoetinas, išskirta DNR, koduojanti trombopoetiną, rekombinantiniai arba sintetiniai trombopoetino gavimo ir gryninimo būdai. Buvo parodyta, kad įvairios trombopoetino formos turi įtakos kraujo ląstelių, ypač megakariocitų ir megakariocitų pirmtakų replikacijai, diferenciacijai arba brendimui. Todėl šie junginiai gali būti naudojami gydant trombocitopeniją.
[EN] Isolated thrombopoietin (TPO), isolated DNA encoding TPO, and recombinant or synthetic methods of preparing and purifying TPO are disclosed. Various forms of TPO are shown to influence the replication, differentation or maturation of blood cells, especially megakaryocytes and megakaryocyte progenitor cells. Accordingly, these compounds may be used for treatment of thrombocytopenia.
[0001] Šis išradimas susietas su baltymų, įtakojančių hemopoetinių ląstelių, ypač trombocitų pirmtakų, išli-kimą, proliferaciją, diferencijaciją arba brendimą, išskyrimu, gryninimu, o taip pat su genoinžinierine arba chemine sinteze. Šis išradimas susijęs su nukleino rūgščių, koduojančių baltyminį ligandą, kuris susiriša su citokinų receptorių superšeimos nariu rapl ir akty-vuoja jį, klonavimu ir ekspresija. Toliau šis išradimas susietas su šių baltymų (atskirai ir kartu su kitais citokinais) pritaikymu, gydant imunines arba hemopoe-tinės sistemos sutrikimus, tame tarpe ir trombocito-peniją .
[0002] Hemopoetinė sistema produkuoja subrendusias specializuotas kraujo ląsteles, būtinas žinduolių išgyvenimui. Šios subrendusios ląstelės yra: eritrocitai, transportuojantys deguonį ir anglies dvideginį,
[0003] T- ir B-limfocitai, atsakingi už ląstelinį ir hurnora-linį imuninį atsaką, trombocitai, būtini kraujo krešė-jimui, bei granuliocitai ir makrofagai, kurie yra specilizuoti fagocitozei ir veikia kaip pagalbinės ląstelės kovojant su infekcija. Savo ruožtu tarp granu-liocitų išskiriami: neutrofilai, eozinofilai, bazofilai ir tukliosios ląstelės; kiekvienas šių ląstelių tipas turi savo atskiras funkcijas. Pasirodo, visos šios subrendusios specializuotos ląstelės kyla iš vienintelio bendro primytvvaus ląstelių tipo, kuris vadinamas pliuripotentinėmis (daugiapotentinėmis arba totipo-tentinėmis) kamieninėmis ląstelėmis, pirmą kartą atrastomis kaulų čiulpuose (Dexteer et al., Am. Rev. Cell Biol., 3:423-441 [1987]) .
[0004] Subrendusios specializuotos kraujo ląstelės turi būti produkuojamos dideliais kiekiais per visą žinduolio gyvenimą. Didžioji dauguma šių specializuotų kraujo ląstelių išlieka funkcionaliai aktyvioje būklėje nuo kelių valandų iki kelių savaičių (Cronkite et al., Blood cells, 2:263-284 [1976]). Todėl žinduolio kraujo ląstelių homeostazei palaikyti būtinas visų brendimo etapų ląstelių pastovus atsinaujinimas: pradedant nuo pačių kamieninių ląstelių, tarpinių, dalinai speciali-zuotų pirmtakų ir baigiant subrendusiomis kraujo ląstelėmis.
[0005] Visos hemopoetinės sistemos pagrindas yra pliuri-potentinės kamieninės ląstelės. Šių ląstelių kiekis yra sąlyginai mažas; jos pastoviai atsinaujina pasidalin-damos į dukterines kamienines ląsteles arba vystosi diferenciacijos keliu, kai transformuojasi per eilę diferenciacijos etapų i vis labiau subrendusias įvairom šakom specifines ląsteles-pirmtakus, kol pasiekia aukščiausią diferenciacijos lygį - specializuotas subrendusias kraujo ląsteles.
[0006] Pavyzdžiui, tam tikros multipotentinės ląstelės-pirmtakai, vadinamos CFC-Mix, kilusios iš kamieninių ląstelių, gali arba proliferuoti (atsinaujinti) arba diferencijuotis ir sudaryti kolonijas, kurių sudėtyje yra įvairios mieloidinės ląstelės: eritrocitai, neutrofilai, megakariocitai, trombocitų pirmtakai, makrofagai, bazofilai, eozinofilai ir tukliosios ląstelės. Kitos ląstelės-pirmtakai priklauso limfoidinei atšakai ir po proliferacijos bei brandos išsivysto į T- ir B-ląsteles.
[0007] Be to, tarp CFC-Mix pirmtakų ir mieloidinių ląstelių yra eilė žemesnio rango ląstelių-pirmtakų, kurių galimybės diferencijuotis yra ribotos. Šie specifiniai pirmtakai klasifikuojami pagal jų pali-kuonis. Žinomi šie tarpiniai mieloidinės atšakos ląstelių pirmtakai: eritroidiniai kolonijas formuo-jantys vienetai (CFU-E) - eritrocitams; granulio-citų/makrofagų kolonijas formuojančios ląstelės (GM-CFC) - neutrofilams ir makrofagams; megakariocitų kolonijas formuojančios ląstelės (Meg-CFC) - megakariocitams; eozinofilų kolonijas formuojančios ląstelės (Eos-CFC) - eozinofilams; ir bazofilų kolonijas formuojančios ląstelės (Bas-CFC) tukliosioms ląstelėms. Tarp pliuripotentinių kamieninių ląstelių ir subren-dusių kraujo ląstelių žinomi ir kiti tarpiniai pirmtakai (žiūr. žemiau). Tikimasi atrasti dar daugiau tokio tipo ląstelių-pirmtakų, kurie skirtųsi pagal specifiškumą vienai ar kitai ląstelių atšakai ir pagal savo galimybes atsinaujinti.
[0008] Pagrindinis normalios hemopoetinės sistemos vieklos principas yra toks: ląstelių sugebėjimas atsinaujinti sumažėja, mažėjant jų multipotencij ai ir didėjant specifiškumui tam tikrai atšakai. Tokiu būdu, viename hematopoetinių ląstelių spektro gale yra pliuripotentinės kamieninės ląstelės, kurios sugeba atsinaujinti ir diferencijuotis i visų tipų riboto potencialumo ląsteles-pirmtakus. Būtent šia kamieninių ląstelių savybe naudojasi kaulų čiulpų transpalanta-cijos terapija, kai primityvios kamieninės trans-plantanto ląstelės iš naujo užsieja visą hemopoetinių ląstelių sistema. Kitame spektro gale yra atskirom hemopoetinėm ląstelių atšakom specifiniai pirmtakai ir jų palikuonys, kurie jau prarado sugebėjimą atsinaujinti, bet įgijo brandų funkcionalų aktyvumą.
[0009] Kamieninių ir atšakai specifinių ląstelių-pirmtakų proliferacija ir vystymasis kontroliuojami hemato-loginiais augimo faktoriais arba citokinais. Šių faktorių vaidmuo in vivo yra sudėtingas ir nevišiskai išaiškintas. Kai kurie augimo faktoriai, kaip interleukinas-3 (IL-3) gali stimuliuoti ir multipotentines kamienines ląsteles, ir kelių atšakų ribotos potencijos ląsteles-pirmtakus, tarp jų ir raegakariocitų pirmtakus. Ankščiau buvo manoma, kad kiti faktoriai, tokie kaip granuliocitų makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (GM-CSF) veikia tik GM-CFC. Tačiau vėliau buvo išaiškinta, kad GM-CSF taip pat įtakoja interalia magakariocitų proliferaciją ir vystymąsi. Tokiu būdu, buvo parodyta, kad IL-3 ir GM-CSF biologiniai aktyvumai persidengia, tačiau jų poveikis skiriasi. Neseniai buvo taip pat parodyta, kad interleukinas 6 (IL-6) ir interleukinas 11 (IL-11), kurie patys savaime neturi įtakos meg-kolonijų formavimuisi, veikiant kartu su IL-3 žymiai sustiprina pastarojo stimuliuojamą megakariocitų brendimą (Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016
[0010] [1992]).
[0011] Tuo būdu, hemopoetiniai augimo faktoriai gali veikti vienos ar daugiau atšakų ląstelių augimą bei diferenciaciją, jų aktyvumai gali persidengti su kito augimo faktoriaus aktyvumu, veikiant tam tikras ląsteles-pirmtakus; vieni augimo faktoriai gali sustiprinti kitų augimo faktorių poveikį ląstelėms.
[0012] Taip pat parodyta, kad hemopoetiniai augimo faktoriai gali veikti įvairiose ląstelių vystymosi stadijose: pliuripotentines kamienines ląsteles, visų lygių tarpinius pirmtakus ir subrendusias kraujo ląsteles. Pavyzdžiui, eritropoetinas (EPO) indukuoja tik eritroidinių pirmtakų proliferaciją. IL-3 veikia ankstesnėje vystymosi stadijoje, įtakodamas primityvių kamieninių ląstelių ir tarpinių ląstelių-pirmtakų vystymąsi. Kiti augimo faktoriai, tokie kaip kamieninių ląstelių faktorius (SCF) veikia dar primityvesnių ląstelių vystymąsi.
[0013] Vertinant iš ateities perspektyvos, naujų hemopoetinių augimo faktorių, veikiančių kraujo ląstelių ir jų pirmtakų gyvybingumą, proliferaciją, diferencijaciją ir brendimą, atradimas būtų labai svarbus, perspektyvus ir naudingas, ypač atstatant hemopoetinę sistemą, pažeistą ligos, radio- ar chemoterapij os.
[0014] II. Megakariocitopoezė - trombocitų produkcija
[0015] Megalokariocitopoezės ir tromocitų produkcijos reguliacija nuodugniai aprašyta apžvalginiuose straipsniuose: Mazur, Exp. Hematol., 15:248 [1987] ir Hoffman, Blood, 74:1196-1212 [1989]. Reziumuojant trumpai, kaulų čiulpų pliuripotentinės ląstelės dife-rencijuojąs! į megakariocitų, eritrocitų ir mielocitų ląstelių linijas (atšakas). Manoma, kad tarp kamieninių ląstelių ir megakariocitų egzistuoja tarpinių mega-kariocitų ląstelių-pirmtakų hierarchija. Identifikuotos mažiausiai trys megakariocitų pirmtakų klasės: inten-syvaus augimo židinius formuojančių vienetų megakariocitai (BFU-MK) , kolonijas formuojančių vienetų megakariocitai (CFU-MK) ir mažo tankio megakariocitų ląstelės-pirmtakai (LD-CFU-MK). Megakariocitų brendimas pats savaime yra nenutrūkstantis vystymosi procesas, kurio suskirstymas į atskiras stadijas remiasi stan-dartinais morfologiniais kriterijais. Akstyviausias atpažįstamas megakariocitų (MK arba meg) šeimos narys yra megakarioblastas. Šios ląstelės pradžioje būna 20-30 (j.m diametro su bazofiline citoplazma ir turi šiek tiek netaisyklingos formos branduolį su netankiu, kiek tinkluotu chromatinu ir keliais branduolėliais. Vėliau megakarioblastai (poliploidiniai) gali turėti iki 32 branduolių, bet citoplazma lieka nesubrendusi. Prasidė-jus brendimui, branduolys tampa labiau skiltelėtas, citoplazmos kiekis padidėja, ji pasidaro labiau acido-filinė ir granuliuota. Labiausiai subrendusios šios šeimos ląstelės gali atrodyti kaip yrantys trombocitai periferinėje dalyje. Normaliai mažiau kaip 10 % mega-kariocitų yra blasto stadijoje ir daugiau kaip 50 % yra visiškai subrendę. Pagal sąlyginę morfologinę klasifi-kaciją, paprastai taikomą megakariocitams, išskiriami megakarioblastai ( ankstyvoji forma), promegakariocitai arba bazofiliniai megakariocitai ( tarpinė forma) ir subrendę ( acidofiliniai, granuliocitai arba trombocitus produkuojantys) megakariocitai ( vėlyvosios formos) . Subrendusieji megakariocitai išleidžia citoplazminius filamentus į sinusoidalinę erdvę, kur šie atsiskiria ir fragmentuojasi į individualius trombocitus ( Williams et. al., Hematology, 1972).
[0016] Manoma, kad megakariocitopoezės procese dalyvauja daug reguliatorinių faktorių ( Williams et al., Br. J. Haematol., 52:173 [ 1982] ir Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101 [ 1982]). Teigiama, kad ankstyvoji megakariocitopoezės stadija yra mitotinė ir priklauso nuo ląstelių proliferacijos, kolonijų formavimosi iš CFU- MK, bet nepriklauso nuo trombocitų skaičiaus kraujyje ( Burstain et al., J. Cell Physiol., 109:333 [ 1981] ir Kimura et al., Exp., Hematol., 13:1048 [ 1985]). Vėlyvoji brendimo stadija nemitotinė, susijusi su bran-duolių poliploidizacij a ir citoplazmos brendimu ir vei-kiausiai grįžtamai reguliuojama periferinių trombocitų skaičiumi. ( Odeli et al., Blood, 48:765 [ 1976] ir Ebbe et al., Blood, 32: 787 [ 1968]).
[0017] Apie atskiro specifinio megakariocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus ( MK- CSF) egzistavimą buvo diskutuojama literatūroje ( Mazur, Exp. Hematol., 15: 340- 350 [ 1987]). Daugumos autorių nuomone, toks gyvy-biškai svarbus procesas kaip trombocitų produkcija turėtų būti reguliuojamas citokino ( citokinų), atsakin-go būtent už šį procesą. Ši hipotezė paskatino jau 30 metų besitęsiančią tokio specifinio citokino paiešką, tačiau iki šiol nebuvo išskirtas, sekvenuotas ir charakterizuotas joks citokinas, kuris būtų tik MK- CSF
[0018] Nors buvo paskelbti darbai, teigiantys, kad iš dalies pasisekė išgryninti MK-CSF iš kelių šaltinių: iš gyvūnų su eksperimentiškai sukelta trombopenija plazmos (Hil et al., Exp. Hematol., 14:752 [1986]); iš žmogaus embrioninių inkstų ląstelių kultūros kondicionuotos terpės [CM] (McDonald et al. , J. Lab. , Clin. Med., 85:59 [1975]); iš žmonių, sergančių plastine anemija ir idiopatine trombocitopenija purpura, šlapimo ekstraktų (Kawakita et al. , Blood., 6:556 [1983]) ir plazmos (Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75:1174
[0019] [1985]), bet šių faktorių fiziologinė funkcija daugeliu atvejų lieka neišaiškinta.
[0020] Kondicionuotos terpės, kurioje augo Phytolacca americana, mitogenų aktyvuotos blužnies ląstelės (PWM-SpCM) ar pelių mielomonocitų ląstelių linija WEHI-3 (WEHI-3CM), buvo naudojamos kaip megakariocitų stimu-liatoriai. PWM-SpCM sudėtyje yra faktoriai, kurie paskatina CFU-MK augimą (Metcalf et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al. , Blood, 65:214 [1985] ir Iscove, N. N., in Hemato-poietic Cell Differentiation, ICN- UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al. , eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1978]). Vienas iš šių faktorių yra interleukinas 3 (IL-3), daugelio ląstelių tipų kolonijas stimuliuojantis faktorius (multi-CSF) (Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]). Kiti šioje kondicionuotoje terpėje esantys faktoriai dar nebuvo identifikuoti ir išskirti. WEHI-3 yra pelių mielomonocitų linija, kuri sekretuoja palyginti daug IL-3 ir kiek mažiau GM-CSF. Buvo parodyta, kad IL-3 skatina daugelio hemopoetinių ląstelių augimą (Ihle et al., J. Immunol., 13:282 [1983]), taip pat parodyta, kad IL-3 sustiprina kitų žinomų hemopoetinų hormonų arba augimo faktorių efektą (Bartelmez et al., J. Cell Physiol., 122:362-369 [1985] ir Warren et al., Cell, 46:667-674 [1988]), tarp jų ir eritropoetino (EPO) bei interleukino-1 (IL-1) efektą, indukuodamas labai anks-tyvius multipotentinius pirmtakus ir labai didelių mišraus tipo hemopoetinių ląstelių kolonijų formavimą.
[0021] Kiti megakariocitų stimuliatorių šaltiniai buvo rasti terpėse, kurios buvo kondicionuojamos pelių plaučių, kaulų makrofagų ląstelių linijomis, perito-nealinio eksudato ląstelėmis bei žmogaus embrioninių inkstų ląstelėmis. Nors yra prieštaringų duomenų
[0022] (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]), bet yra ir įrodymų (Geissler et al., Br. J. Haematol., 60:233-238
[0023] [1985]), kad ne monocitai, o greičiau aktyvuotos T-ląstelės turi stimuliuojančios įtakos magakariocito-poezei. Šis faktas leidžia manyti, kad aktyvuotų T-limfocitų sekretuojami faktoriai, tokie kaip interleukinai, gali reguliuoti MK vystymąsi (Geissler et al. f Exp. Hematol., 15:845-853 [1987]). Keletas darbų yra skirta išgryninto eritropoetino EPO įtakos megakariocitopoezei tyrinėjimui (Vainchenker et al., Blood, 54:940 [1979]; McLeod et al., Nature, 261:492-4 [1976] ir Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). Šie tyrimai parodė, kad EPO hormonas skatina MK kolonijų formavimąsi. Šis efektas taip pat parodytas ir beseru-minėse kultūrose, ir kultūrose su serumu, net ir be pagalbinių ląstelių (Williams et al., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). Teigiama, kad EPO labiau dalyvauja vienos ir dviejų ląstelių megakariocitopoezės stadijose, tuo tarpu PWM-SpCM, kuris veikia megakariocitų, vystymąsi dalyvauja "keturių ląstelių" stadijose. Visų šių faktorių sąveika ir ankstyvojoje ir vėlyvoje mega-kariocitų vystymosi fazėse dar turi būti išaiškinta.
[0024] Kelių laboratorijų nepriklausomi duomenys rodo,kad vieninteliai multi-potentiniai faktoriai, kurie turi individualų MK-kolonijas stimuliuojantį aktyvumą, yra GM-CSF, IL-3 ir, mažesniu mastu, B-ląsteles stimuliuo - jantis faktorius IL-6 (Ikebuchi et al., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Neseniai keli autoriai paskelbė duomenis, kad IL-11 ir leukemiją inhibuojantis faktorius (LIF), veikdamas kartu su IL-3, padidina megakariocitų dydį ir ploidiškumą (Yonemura et al., British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein et al., J. Cell. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et al., Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et al., Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et al., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991] ir Yonemura et al., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).
[0025] Kitos įdomios publikacijos yra: Eppsten et al., JAV patentas Nr. 4962091; Chong, JAV patentas Nr. 4879111; Fernandes et al., JAV patentas Nr. 4604377; Wissler et al., JAV patentas Nr. 4512971; Gottlieb, JAV patentas Nr. 4468379; Bennett et al., JAV patentas Nr. 5215895; Kogan et al., JAV patentas Nr. 5250732; Kimura et al., Eur. J. Immunol., 20 ( 9) : 1927-1931 [1990]; Secor et al., J. of Immunol., 144( 4) : 1484-1489 [1990]; Warren et al., J. of Immunol., 140( 1) : 94-99 [1988]; Warren et al., Exp. Hematol., 17( 11) : 1095-1099 [1989]; Bruno et al. , Exp. Hematol., 17 ( 10) : 1038-1043 [198 9] ; Tanikawa et al., Exp. Hematol., 17( 8) : 883-888 [198 9]; Koike et al., Blood, 75( 12) : 2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75( 5) : 1545-1551 [1989]; Rennick et al., Blood, 73( 7) : 1828-1835 [1989] ir Clutterbuck et al., Blood, , 73 (6) : 1504-1512 [1989] .
[0026] Trombocitai yra svarbiausias kraujo krešėjimo mechanizmo elementas. Cirkuliuojančių trombocitų kiekio sumažėjimas, vadinamas trombocitopenija, būdingas įvairiems klinikiniams atvejams ir sutrikimams. Pagal viešai priimtą apibūdinimą trombocitopenija yra trombocitų kiekio sumažėjimas iki 150xl09 ląstelių litre ir dar mažiau. Pagal trombocitų gyvavimo trukmę, išskiriamos trys pagrindinės trombocitopenijos kategorijos: (1) nepakankama trombocitų produkcija kaulų čiulpuose, (2) trombocitų kaupimasis blužnyje (splenomegalija) arba (3) padidinta trombocitų destrukcija periferiniame kraujyje (pvz. autoimuninė trombocitopenija, trombocitų pažeidimas radio- arba chemoterapijos metu) . Be to, kai pacientams greitai suleidžiami dideli kiekiai kraujo produktų su sumažintu trombocitų kiekiu, dėl praskiedimo taip pat gali išsivystyti trombocitopenija.
[0027] Klinikiniai trombocitopenijos pasireiškimai, pvz., kraujavimas, priklauso nuo trombocitopenijos prie-žasties, jos sunkumo ir galimų asocijuotų kitų kre-šėjimo sistemos defektų. Kaip taisyklė, pacientai su trombocitų kiekiu nuo 20xl09 iki 100xl09 litre rizikuoja turėti stiprų kraujavimą po traumos, tuo tarpu pacientai, kurių trombocitų kiekis mažesnis, nei 20xl09 litre - gali kraujuoti spontaniškai. Tokie pacientai yra kandidatai trombocitų transfuzij ai, nepaisant šią procedūrą lydinčios imuninės reakcijos ir virusinio užkrato rizikos. Esant vienodam trombocitų skaičiui kraujavimai sunkesni, jei trombocitopenijos priežastis yra nepakankama trombocitų produkcija, o ne jų padidėjusi destrukcija. Pastaruoju atveju dėl pagreitintos trombocitų apykaitos kraujyje cirkuliuoja jaunesni, didesni ir hemostatiškai efektyvesni trombocitai. Trombocitopenija gali atsirasti dėl daugelio priežasčių, trumpai aprašomų žemiau. Detalų aprašymą galima rasti Schafner, A. I., "Trombocitopenija ir trombocitų funkcijos pažeidimai" Internal Medicine, 3rd Ed., John J. Hutton et al., Eds. , Little Brown and Co. , Boston/Toronto/London [1990].
[0028] ( a) Trombocitopenija sukelta nepakankamos trombo-citų produkcijos
[0029] Įgimtos trombocitopenijos priežastimi gali būti aplastinė anemija (Falkonio sindromas) ir įgimta amega-kariocitinė trombocitopenija, kuri gali būti asocijuota su kaulų deformacijomis. Įgytus trombocitų produkcijos sutrikimus gali iššaukti arba megakariocitų hipoplazija arba neefektyvi trombopoezė. Megakariocitų hipopla-zijos priežastys gali būti įvairios, tarp jų kaulų čiulpų aplazija (įskaitant ir idiopatines formas ir chemoterapinių agentų arba radioterapijos iššauktas mielosupresijas), mielofibrozė, leukemija, metastatinių auglių bei granulomų invazija į kaulų čiulpus. Kai kuriais atvejais toksinai, infekcijos agentai, vaistai gali gana selektyviai veikti trombopoezę, pvz., laikiną trombocitopeniją gali sukelti alkoholis ir tam tikros virusinės infekcijos; nežymi trombocitopenija lydi gy-dymą triazidiniais diuretikais. Pabaigai reikia pami-nėti, kad neefektyvi trombopoezė, kaip antrinis mega-blastinių procesų pasireiškimas, dėl folinės rūgšties ar vitamino B12 trūkumo taip pat gali sukelti trombo-citopeniją, tokiais atvejais paprastai lydimą anemijos ir leukopenijos.
[0030] Gydant trombocitopenijas, kilusias dėl sumažintos trombocitų produkcijos, stengiamasi išsiaiškinti prie-žastį, dėl kurios sutriko normali kaulų čiulpų funkcija, ir tą priežastį pašalinti. Trombocitų transfuzija paprastai taikoma tik pacientams su labai rimtais krau-javimais arba tokiems ligoniams atliekant chirurgines operacijas, nes izoimunizacij a gali sukelti nepakantumą pakartotinoms trombocitų trasfuzijoms. Gleivinės krau-javimo dėl sunkios trombocitopenijos atvejais gali padėti peroralinis arba intraveninis antifibrinolitinių agentų panaudojimas. Tačiau ligoniams su išsėtine intravaskuliarine koaguliacija (DIC) antifibrinolitinių agentų naudojimas gali sukelti trombines komplikacijas.
[0031] ( b) Trombocitopenija dėl trombocitų kaupimosi blužnyje
[0032] Splenomegalij a, nepriklausomai nuo ją sukėlusios priežasties, gali būti susijusi su silpna arba vidutine trombocitopenija. Tai didžia dalimi yra pasyvus procesas (hipersplenizmas), kai blužnyje sulaikomi trombocitai ir šis procesas kardinaliai skiriasi nuo akty-viosios trombocitų destrukcijos blužnyje, kuri vyksta imuninių reakcijų sukeltos trombocitopenijos metu (žr. žemiau). Dažniausia hipersplenizmo priežastis yra splenomegalij a, kilusi dėl alkoholinės cirozės, tačiau ir kitos stazinės, infiltracinės ar limfoproliferacinės splenomegalijos formos taip pat susijusios su trombocitopenija. Trombocitų kiekis paprastai būna mažesnis nei 50xl09 litre, jei trombocitopenija kilo dėl hipersplenizmo.
[0033] ( c) Trombocitopenija dėl neimuninės trombocitų destrukcij os.
[0034] Trombocitopenijos priežastimi gali būti pagrei-tinta trombocitų destrukcija, sukelta įvairių neimu-ninių procesų. Tokio tipo sutrikimams priklauso išsė-tinė intravaskulinė koaguliacija, intravaskulinis protezavimas, ekstrakorporinė kraujo cirkuliacija, trombinės mikroangiopatijos, pvz., trombinė trombo-citinė purpura. Visais šiais atvejais cirkuliuojantys trombocitai kontaktuoja su dirbtiniu paviršiumi arba su pažeista kraujagyslių sienele, yra šiose vietose pažei-džiami ir anksčiau laiko pašalinami iš cirkuliacijos retikuloendotelinės sistemos pagalba. Ligos ir sutrikimai, kuriems būdinga išsėtinė intravaskulinė koaguliacija (DIC) detaliai aprašyti Braunwald et al., (eds.), Harrison's Principles of Internal Medicine, llth Ed., p. 1478, McGraw Hill [1987] . Intravaskuliniai protezai, tarp jų širdies vožtuvai ir intraaortiniai pripučiami kateteriai gali sukelti silpną arba destruk-cinę trombocitopeniją. Laikinoji trombocitopenija gali atsirasti pacientams, kuriems atliekama ekstrakorporinė kraujo cirkuliacija arba hemodializė, dėl trombocitų praradimo arba jų pažeidimo ekstrakorporinėje kraujo apytakos ciklo dalyje.
[0035] ( d) Vaistų indukuota imuninė trombocitopenija
[0036] Daugiau kaip 100 medikamentų gali sukelti imuninę trombocitopeniją. Tačiau gerai charakterizuotas tik kelių vaistų poveikis. Tai guanidinas, guaninas, auksas, sulfonilamidai, cefalotinas ir heparinas. Vaistų sukelta trombocitopenija dažnai būna labai ūmi ir paprastai išsivysto greitai, po kelių dienų nuo sensibilizuojančio gydymo pradžios.
[0037] ( e) Imuninė (autoimuninė) trombocitopenija purpura
[0038] (ITP)
[0039] Suaugusiems ITP yra chroniškas susirgimas, charakterizuojamas autoimunine trombocitų destrukcija. Auto-antikūnai paprastai būna IgG klasės, kitų klasių antikūnų buvimas taip pat aprašytas literatūroje. Nors autoantikūnai siejami su trombocitų membranos GPIIblUac tikslus autoantikūnų specifiškumas daugeliu atvejų neidentifikuotas. Ekstravaskulinė sensibilizuotų trombocitų destrukcija vyksta blužnies ir kepenų retikulo-endotelinėj e sistemoje. Nors apie pusė ITP atvejų yra idiopatiniai, daug tokių pacientų serga reumatinėmis, autoimuninėmis ligomis (pvz., sistemine raudonąja vilklige) arba limfoproliferaciniais susirgimais (pvz., lėtine limfocitine leukemija).
[0040] ITP vis dažniau pasireiškia kaip ŽIV infekcijos komplikacija (Morris et al., Ann. Interrn. Med., 96:714-717 [1982]) ir gali atsirasti bet kurioje ligos stadijoje, tiek pacientams su diagnozuotu AIDS, ar AIDS-asocij uotų simptomų kompleksu, tiek ir ŽIV nešio-tojams be AIDS simptomų. ŽIV infekcija sukelia ligą, charakterizuojamą dideliu ląstelinio imuniteto defi-eitu, o taip pat oportunistinių infekcijų bei navikų buvimu. Pirminis imunologinis pažeidimas ŽIV infekcijos metu yra progresuojantis T-limfocitų, ekspresuojančių CD4 glikoproteiną, kiekio bei funkcijos nepakankamumas (Lane et ai., Ann. Rev. Immunol. , 3:447 [1985]). Šis funkcionalių CD4 T-helperių praradimas greičiausiai ir yra ta priežastis, dėl kurios kyla dideli ląstelinio bei humoralinio imuniteto sutrikimai, pasireiškiantys AIDS būdingomis oportunistinėmis infekcijomis ir navikais (H. Lane supra).
[0041] Nors ŽIV-asocijuotos ITP mechanizmas nežinomas, manoma, kad jis skiriasi nuo kitų, nesusijusių su ŽIV infekcija, ITP mechanizmų (Walsh et al. f N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; Ratner, Am J. Med., 86:194-198 [1989]).
[0042] IV Šiuolaikinė trombocitopenijos terapija
[0043] Pacientų su trombocitopenija terapijos būdo pasirinkimą apsprendžia konkreti klinikinė situacija. ŽIV-asocijuotos ir neasocijuotos trombocitopenijos gydymo būdai yra panašūs. Buvo išbandyti keli terapijos būdai, bet gydymo eiga vis dar tebėra ginčytina.
[0044] Trombocitų kiekį pacientams su trombocitopenija pavyksta padidinti, gydant gliukokortikoidais (pvz., prednizolonu) , tačiau daugeliui pacientų trombocitų kiekis visiškai neatsistato. Be to, kai gliukokortikoido dozė sumažinama arba vaistų vartojimas nutrau-kiamas, dažnai stebimas ligos recidyvas. Kai kurie ŽIV-asocijuotų ITP tyrimai leidžia daryti prielaidą, kad gliukokortikoidų terapija gali sukelti predispoziciją AIDS. Paprastai gliukokortikoidai skiriami, kai trombo-citų kiekis sumažėja iki 20xl09 litre, arba kai vyksta spontaninis kraujavimas.
[0045] Keliais sunkios ne ŽIV- asocijuotos ITP atvejais, kai gydymas gliukokortikoidais pasirodė neefektyvus, buvo sėkmingai panaudotas junginys: 4-( 2- chlorfenil)- 9-( metil- 2[ 3-( 4- morfolinil)- 3-propropanon- l- il] 6H- tieno[ 3, 2, f][ l, 2, 4] triazolo [ 4, 3, a][ 1, 4] diazepinas ( WEB 2086).
[0046] Pacientas, kurio trombocitų kiekis gydymo pradžio-je buvo 37000- 58000 ląstelių 1 jil, buvo gydomas WEB 2086. Po vienos - dviejų savaičių gydymo trombocitų kiekis padidėjo iki 14 0000- 190000 ląstelių 1 f* l. ( EP 361, 077 ir Lohman et al., Lancet, 1147 [ 1988]).
[0047] Nors optimali įgytos amegakariocitinės trombocitopenijos purpura ( AATP) gydymo schema dar nesurasta, buvo parodyta, kad antitimocitinis globulinas ATG ( arklio antiserumas prieš žmogaus čiobrialiaukės audinį) sukelia visišką ilgalaikę remisiją. ( Trimble et al., Am. J. Hematol., 37:126- 127 [ 1991]). Nauji tyrimai rodo, kad hemopoetinis ATG efektas priskirtinas mer-tiolatui, kur baltymas veikia kaip gyvsidabrio perne-šėjas ( Panella et al., Cancer Research, 50: 4429- 4435 [ 1990] ) .
[0048] Geri rezultatai buvo pasiekti, atliekant blužnies pašalinimą. Daugumai splenektomija pašalina svarbiausią trombocitų destrukcijos vietą ir svarbiausią autoanti-kūnų produkcijos šaltinį. Dažnaiusias šios procedūros rezultatas yra ilgalaikė remisija, kurios metu pacientams nereikia vartoti jokių medikamentų. Chirurginė intervencija nepageidautina, kai paciento imunitetas yra susilpnėjęs, todėl splenektomija rekomenduojama tik labai sunkais trombocitopenijos atvejais ( pvz., sunki ŽI V- asocijuota ITP) ir tik tokiems pacientams, kuriems 2 -3 savaičių kortikoidų terapija nepadeda arba kurių būklė vėl pablogėja, nutraukus gliukokortikoido vartojimą. Šiuolaikinis mokslinių žinių lygis neleidžia tvirtinti arba paneigti, kad splenektomija turi poveikį AIDS predispozicijai.
[0049] Be prednizolono terapijos ir splenektomijos, gydant ŽIV-asocijuotos ITP, gauti neblogi preliminarūs rezultatai, naudojant kai kuriuos citotoksinius agen-tus, pvz., vinkristiną ir azidotimidiną (AZT, zidovu-diną).
[0050] Vienas perspektyviausių būdų trombocitopenijai gydyti galėtų būti agentas, kuris pagreitintų mega-kariocitų arba jų pirmtakų diferenciaciją ir brendimą. Tokio agento, paprastai vadinamo trombopoetinu (TPO), atradimui skirta nemažai pastangų. Kiti literatūroje sutinkami TPO pavadinimai: trombocitopoezę stimuliuojantis faktorius (TSF), megakariocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (MK-CSF), megakariocitus stimuliuojantis faktorius ir megakariocitų potenciatorius. Pirmą kartą TPO aktyvumas buvo pastebėtas 1959 metais (Rak et al. , Med. Exp., 1:125), bet pastangos šį agenta išgryninti ir charakterizuoti tęsiasi iki šiol. Vienuo-se darbuose skelbiama apie TPO aktyvumą turinčių poli-peptidų dalinį išgryninimą (žiūr., pvz., Tayrien et al. , J. Biol. , Chem., 262: 3262 [1987] ir Hoffman et al., J. Clin. Invest., 75:1174 [1985]), kituose - teigiama, kad TPO nėra atskiras savarankiškas baltymas, o tik vienas iš žinomo polifunkcionalaus hormono (IL-3) aktyvumų (Sparrow et al., Prog. Clin. Biol. Res. , 215:123 [1986]). Nepriklausomai nuo savo formos ar kilmės, molekulė, turinti trombopoetinį aktyvumą, turė-tų didelę terapinę reikšmę. Nors, iki šiol nė vienas baltymas nebuvo tiksliai identifikuotas kaip TPO, dide-lį susidomėjimą sukelia atradimas, kad mpl (hipotetinio citokino receptorius) gali vykdyti trombopoetinio signalo perdavimą.
[0051] V. Mpl yra megakariocitopoetinio citokino receptorius
[0052] Manoma, kad hemapoetinių ląstelių proliferacija ir brendimas griežtai reguliuojami faktoriais, kurie tei-giamai ar neigiamai moduliuoja pliuripotentinės kamie-ninės ląstelės proliferaciją ir diferenciaciją. Šie efektai pasiekiami ekstraląsteliniams baltyminiams fak-toriams susirišus su didelio afiniškumo ląstelių pavir-šiaus receptoriais. Minimi ląstelių paviršiaus receptoriai turi didelę tarpusavio homologiją ir klasifikuojami kaip citokinų receptorių superšeimos nariai. Į šią superšeimą įeina šių citokinų receptoriai: IL-2 (P ir y grandinės) (Hatakeyama et al., Science, 244:551-556
[0053] [1989]; Takeshita et al., Science, 257:379-382 [1991]), IL-3 (Itoh et al., Science, 247:324-328 [1990]; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5459-5463 [1990]; Kitamura et al., Cell, 66:1165-1174 [1991a]; Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et al., Cell, 59: 335-348
[0054] [1989]),IL-5 (Takaki et al., EMBO J., 9: 4367-4374
[0055] [1990]; Tavernier et al., Cell, 66: 1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki et al., Science, 241:825-828 [1988]; Hibi et al., Cell, 63: 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et al., Cell, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5690-5694 [1992]), granu-liocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojančiam faktoriui (GM-CSF) (Gearing et al., EMBO J., 8: 3667-3676 [1991]; Hayashida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 244: 9655-9659 [1990]), granuliocitų kolonijas stimuliuojančiam faktoriui (G-CSF) (Fukunaga et al., Cell, 61: 341-350 [1990a]); Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8702-8706 [1990b]); Larsen et al., J. Exp. Med. , 172: 1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea et al., Cell, 57:277-285 [1989]; Jonės et al., Blood, 76:31-35
[0056] [1990]), leukemijos inhibicijos faktoriui (LIF)
[0057] (Gearing et al., EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), onko-statinui M (OSM) (Rose et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8641-78645 [1991]), o taip pat receptoriams prolaktinui (Boutin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7744-7748 [1988]; Edery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2112-2116 [1989]), augimo hormonui (GH)
[0058] (Leung et al., Nature, 330:537-543 [1987]) ir cilia-riniam neurotropiniam faktoriui (CNTF) (Davis et al., Science, 253:59-63 [1991]).
[0059] Citokinų superšeimos narius galima sugrupuoti į tris funkcines kategorijas (apžvalga pateikta Nicola et al., Cell, 67:1-4 [1991]). Pirmąją klasę sudaro vien-grandžiai receptoriai, pvz. eritropoetino receptorius (EPO-R) ir granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus receptorius (G-CSF-R) ; šie receptoriai apima ligandą su dideliu afiniškumu per savo ekstraląstelinį domeną ir generuoja viduląstelinį signalą. Antroji re-ceptorių klasė, vadinama a-subvienetais, jungia interleukino-6 receptorių (IL6-R), granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus receptorių (GM-GSF-R), interleukino-3 receptorių (IL3-R) ir kitus citokinų receptorių superšeimos narius. a-Subvienetai gali prisijungti ligandą su nedideliu afiniškumu, ta-čiau perduoti viduląstelinio signalo nesugeba. Didelio afiniškumo receptoriai, sugebantys perduoti signalą, atsiranda, kai a-subvienetai susijungia į heterodimerą su trečiosios klasės citokinų receptoriais, vadinamais P-subvienetais; tokio receptoriaus pavyzdys yra pc, kuris sudaro heterodimerus su IL3-Ra ir GM-CSF-R a-subvienetais .
[0060] Įrodymai, kad mpl yra citokinų receptorių super-šeimos narys kyla iš struktūros homologijos (Gearing, EMBO J., 8:3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6834-6938 [1990]; Davis et al., Science,
[0061] 253:59-63 [1991] ir Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644 [1992]) ir iš jo sugebėjimo perduoti proliferacijos signalą.
[0062] Baltymo amino rūgščių liekanų seka, nustatyta iš klonuoto pelių c- mpl geno įrodo,kad šis baltymas homo-logiškas kitiems citokinų receptoriams. Ekstraląste-linis domenas sudarytas iš 465 amino rūgščių liekanų ir susideda iš dviejų subdomenų, kiekvienas subdomenas turi keturias konservatyvias cisteino liekanas ir ypatingą motyvą domeno C ir N galuose. Spėjama, kad ligandą rišantys ekstraląsteliniai domenai turi panašią dvigubą cilindrinę P klosčių erdvinę struktūrą. Šis dublikuotas ekstraląstelinis domenas turi didelę homo-logiją su signalą perduodančią grandinę, bendrą IL-3, IL-5 ir GM-CSF receptoriams, o taip pat su LIF mažo afiniškumo receptoriaus ligandą rišančių domenų (Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Tokiu būdu, mpl gali priklausyti mažo afiniškumo ligandą rišančiai citokinų receptorių klasei.
[0063] Pelių mpl ir žmogaus mpl P palyginimas parodė, kad šios baltymų sekos yra identiškos 81 %. Konkrečiau, N galo ekstraląsteliniai domenai identiški 75 %, o C galo identiškumas yra 80 %. Labiausiai konservatyvi mpl dalis yra citoplazminis domenas, turintis net 91 % identiškų amino rūgščių liekanų, o esantys šalia trans-membraninio domeno 37 amino rūgščių liekanų peptidai yra višiškai identiški. Atitinkamai, mpl yra vienas iš labiausiai konservatyvių citokinų receptorių super-šeimos narių (Vigon, supra).
[0064] Įrodymai, kad mpl yra funkcionalus receptorius, galintis perduoti proliferacijos signalą, buvo gauti tiriant chimerinius receptorius, susidedančius iš žinomo specifiškumo didelio afiniškumo citokino receptoriaus ekstraląstelinio domeno ir mpl citoplazminio domeno. Kadangi tikrasis mpl ligandas nežinomas, rei-
[0065] kėjo sukonstruoti chimerinį didelio afiniškumo ligandui specifišką ekstraląstelini domeną iš pirmosios klasės citokino receptoriaus, tokio kaip IL-4R arba G-CSFR. Vigon et al., supra, suliejo G-CSFR ekstraląste-lini domeną su transmembraniniu ir citoplazminiu c- mpl domenais. IL-3 priklausoma ląstelių linija BAF/B03 (Ba/F3) buvo transfekuota su G-CSFR/jnpl chimera ir, lygiagrečiai, kaip kontrolė, su pilnu G-CSFR genu. Transfekuotos chimerine konstrukcija ląstelės vienodai gerai augo terpėje su IL-3 arba G-CSF. Taip pat elgėsi ir kontrolinės ląstelės, transfekuotos G-CSFR. Visos ląstelės žūdavo be augimo faktorių. Analogiškas ekspe-rimentas buvo atliktas Skoda et ai., EMBO J . , 12( 7) : 2645-2653 [1993], jie sujungė žmogaus IL-4R receptorių
[0066] (hIL-4R) ekstraląstelinį ir transmembraninį domenus su pelių mpl citoplazminiu domenu ir tokia chimerine konstrukcija transformavo pelių nuo IL-3 priklausomą ląstelių liniją Ba/F3. Ba/F3 ląstelės, transfekuotos chimeriniu laukinio tipo hIL-4R genu, normaliai dau-ginosi esant terpėje IL-3 arba IL-4. Ba/F3 ląstelės transfekuotos chimeriniu hIL-4R/mpl, taip pat normaliai proliferavo terpėje, esant hIL-4 (su ir be IL-3). Tai įrodo,kad Ba/F3 ląstelėse mpl citoplazminis domenas turi visus elementus, reikalingus proliferacijos signalo perdavimui.
[0067] Šie eksperimentai su chimeriniais receptoriais įrodo, kad mpl citoplazminis domenas gali perduoti signalą, tačiau jie neatsako į klausimą, ar gali mpl ekstraląstelinis domenas rišti kokį nors Ugandą. Turimi duomenys neprieštarauja dviem galimybėm: 1) mpl yra viengrandis pirmosios klasės receptorius, kaip EPO-R arba G-CSFR; 2) mpl yra signalą perduodantis P sub-vienetas (trečioji klasė), kuriam reikalingas a sub-vienetas panašus į IL-3 (Skoda, supra).
[0068] Buvo manyta(žiūr aukščiau), kad serume yra unikalus faktorius, vadinamas trombopoetinu (TPO), kuris, veikiant sinergetiškai su kitais citokinais, paspartina megakariocitų augimą ir brendimą. Tačiau toks faktorius dar niekad nebuvo išskirtas iš jokio natūralaus šalti-nio, nepaisant didelių daugelio mokslinių grupių pas-tangų. Dar nežinoma, ar mpl gali tiesiogiai rišti megakariocitus stimuliuojantį faktorių; neseniai buvo eks-perimentiškai parodyta, kad mpl dalyvauja perduodant signalą, gautą iš faktoriaus (ar faktorių), rastų paci-entų su aplastiniais kaulų čiulpais serume (Methia et al., Bloodf 82(5): 1395-1401 [1993]).
[0069] Įrodymus, kad serume egzistuoja unikalus kolonijas formuojantis faktorius, skirtingas nuo IL-la, IL-3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF ir GM-CSF, ir perduodantis proliferacijos signalą per mpl, suteikia c- mpl geno ekspresijos primityviuose ir komituotuose hemopoe-tinių ląstelių linijose tyrimai, bei mpl antisensinės DNR poveikio vienai tokių ląstelių linijų tyrimai.
[0070] Naudodami atvirkštinės transkriptazės (RT)-PCR analizę ir imunologiniais metodais frakcionuotas hemopoetinėse ląsteles, Methia ir kt. (cituota aukš-čiau) parodė, kad intensyvi mpl informacinės RNR sin-tezė vyksta tik CD34+ ląstelėse, megakariocituose ir trombocituose. CD34+ ląstelės išskirtos iš kaulų čiulpų, kur jos sudaro apie 1 % visų ląstelių. Tarp CD34+ ląstelių gausu primityvių ir komituotų visų atšakų ląstelių-pirmtakų (pvz., eritroidinės, granulo-makrofaginės bei megakariocitinės atšakų pirmtakų).
[0071] Mpl antisensiniai oligodezoksinukleotidai supre-suoja megakariocitų kolonijų formavimąsi iš pliuripo-tentinių CD34+ ląstelių, auginamų serume, paimtame iš pacientų su aplastiniais kaulų čiulpais, (toks serumas yra turtingas megakariocitų kolonijas stimuliuojačio aktyvumo [MK-CSA] šaltinis) . Tie patys antisensiniai oligodezoksinukleotidai neturi jokio poveikio eritroi-dinių ar granulomakrofaginių kolonijų formavimuisi.
[0072] Dar neišaiškinta, ar mpl tiesiogiai riša ligandą ir ar seruminis faktorius, kuris iššaukia megakario-citopoezę, veikia tiktai per mpl. Buvo spėjama, kad, jei mpl tikrai tiesiogiai riša ligandą, tai jo amino rūgščių liekanų seka turėtų būti labai konservatyvi ir turėtų vykti kryžminė reakcija tarp pelių ir žmogaus mpl dėl jų ekstraląstelinių domenų sekų identiškumo (Vigon, et al. , supra [1993]).
[0073] Įvertinant perspektyvą, šioje mokslo srityje jau-čiamas poreikis išskirti ir identifikuoti molekules, sugebančias stimuliuoti • hemopoetinių ląstelių, ypač megakariocitų ir jų pirmtakų, proliferaciją ir bren-dimą, tam, kad būtų galima naudoti šias medžiagas terapijai, gydant trombocitopeniją. Manoma, kad tokios mo-lekulės yra mpl ligandas ir todėl toliau reikalinga tokį (tokius) ligandą (ligandus) išskirti ir įvertinti jo (jų) vaidmenį ląstelių augime ir diferenciacijoje.
[0074] Taigi, šio išradimo tikslas yra gauti farmaciškai švarias molekules, sugebančias stimuliuoti megakario-citų proliferaciją, diferencijaciją ir/arba brendimą į subrendusią trombocitus produkuojančią formą.
[0075] Kitas išradimo tikslas yra šias molekules pateikti taip, kad juos galima būtų naudoti terapijos tikslams, gydant hemopoetinius sutrikimus, ypač trombocito-peniją .
[0076] Toliau, šio išradimo tikslas yra išskyrimas, išgryninimas ir specifinis identifikavimas baltyminių ligandų, sugebančių in vivo susirišti su citokinų superšeimos receptoriumi, žinomu kaip mpl, ir perduoti per jį proliferacijos signalą.
[0077] Dar vienas išradimo tikslas yra gauti nukleino rūgščių molekules, koduojančias tokius baltyminius ligandus ir jas panaudoti /npl-rišančių ligandų produkcijai rekombinantinių ląstelių kultūroje diagnostikos ir terapijos tikslams.
[0078] Dar vienas išradimo tikslas yra pagaminti šių baltyminių ligandų darinius ir modifikuotas formas, įskaitant ir variantus su amino rūgščių liekanų pakeitimais sekoje, įvairiai glikozilintas ligando formas ir jų kovalentinius darinius.
[0079] Papildomas išradimo tikslas yra paruošti hibridi-nes mpl ligando formas, suliejant. šį polipeptidą su heterologiniu baltymu ir kovalentiniais dariniais.
[0080] Dar vienas išradimo tikslas yra pagaminti pakeistas polipeptido formas, kuriose mpl ligandas būtų pa-pildydtas arba iš dalies pakeistas EPO sekomis, siekiant gauti gauti baltymą, galintį reguliuoti ir trom-bocitų, ir eritocitų pirmtakų proliferaciją ir augimą.
[0081] Dar vienas papildomas išradimo tikslas yra pa-ruošti imunogenišką mpl ligandą arba jo sulietas formas ir gauti antikūnus, specifinius minėtiems ligandams.
[0082] Šie ir kiti išradimo tikslai bus aiškūs specialistui, jei jis laikysis viso išradimo aprašymo.
[0083] IŠRADIMO ESMĖ
[0084] Išradimo tikslai pasiekti, pateikus išskirtą žinduolių megakariocitų proliferaciją ir brendimą skatinantį baltymą, pavadintą " mpl ligandų" (ML) arba "trombopoetinu" (TPO), kuris sugeba stimuliuoti mega-kariocitų proliferaciją, brendimą ir diferenciaciją į subrendusią trombocitus produkuojančią formą.
[0085] Šį homogenišką baltymą galima išgryninti iš natū-ralių šaltinių būdais, susidedančiais iš šių stadijų: (1) Plazmai, turinčiai mpl ligando molekulių, kurias reikia išgryninti, leidžiama sąveikauti su mpl ligandų, imobilizuotu receptoriaus polipeptidu, arba mpl hibridiniu polipeptidu, imobilizuotu ant nešiklio. Sąveikos sąlygos parinktos taip, kad gryninamo mpl ligando mole-kulės selektyviai sorbuojasi ant imobilizuoto receptoriaus polipeptido. (2) Sorbentas su imobilizuotu receptoriumi praplaunamas, siekiant pašalinti visas medžia-gas, kurios nesusirišo su sorbentu. (3) Eliucijos buferiniu tirpalu mpl ligando molekulės eliujuojamos nuo imobiblizuoto receptorinio polipeptido, prie kurio jos buvo prisijungusios. Geriausias natūralus šaltinis yra žinduolių plazma arba šlapimas, turintys mpl ligando. Pageidautina, kad žinduolis būtų aplastinis, o imobili-zuotas receptorius būtų mpl- IqG hibridinis polipeptidas .
[0086] Pirmenybė teikiama megakariocitopoetinę prolife-raciją ir brendimą skatinančiam baltymui, kuris yra išgrynintas, praktiškai homogeniškas mpl ligando polipeptidas, pagamintas sintetiniu arba genoinžinieriniu būdu.
[0087] Šiame išradime aprašytas " mpl ligando" polipeptidas arba "TPO", kurio amino rūgščių liekanų seka yra 70 % homologiška išgrynintam praktiškai homogeniniam kiaulių mpl ligando polipeptido sekai ir mažiausiai 80 % identiška kiaulių mpl ligando polipeptido "EPO-domenui". Šiame išradime pateikiamas mpl ligandas yra subrendęs žmogaus mpl ligandas (hML), kurio seka pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1), arba po transkripcijos modifikuotas šio polipeptido variantas, kurio seka 80 % identiška subrendusiams žmogaus mpl ligandui. Šis mpl ligando variantas yra žmogaus subrendusio mpl ligando (hML) fragmentas, konkrečiai "EPO-domeno N galas". Šis N baltymo gale esantis fragmentas būtinai turi turėti pilną žmogaus ML amino rūgščių liekanų seką nuo 1 iki 4 cisteino, bet už šios srities ribų gali turėti žymius amino rūgščių liekanų pakeitimus, delecijas ir intarpus Pagal šį variantą
[0088] fragmentinis polipeptidas gali būti pavaizduotas formule:
[0089] hML(7-151) atitinka žmogaus TPO (hML) amino rūgščių liekanų seka nuo Cys7 iki Cys151 imtinai; X yra Cys7 amino grupė arba vienos ar kelių N galo amino rūgščių liekanos, prijungtos prie subrendusio hML sekos arba amino rūgščių liekanų papildymas, pvz., Met, Tyr, arba lyderinės sekos, turinčios, pvz., proteolitinio skėlimo vietą (pvz., faktorius Xa ar trombinas); Y - Cys151 galinė karboksilinė grupė arba viena ar kelios C galo amino rūgščių liekanos iš subrendusio hML sekos, arba šios sekos papildymas kitomis amino rūgščių liekanomis.
[0090] Mpl ligandas arba jo fragmentas gali būti suliejami su heterologiniu polipeptidu ir sudaryti hibri-dines (chimerines) molekules. Geriausiai tinkantys heterologiniai polipeptidai yra citokinai, kolonijas stimuliuojantys faktoriai, interleukinai, ar jų fragmentai, ypač kit-ligandas (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF arba LIF. Geriausias heterologinis polipeptidas yra imunoglobulinų grandinė, t. y., žmo-gaus IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM arba jų fragmentai, ypač tie, kurie sudaro IgG sunkiosios grandinės pastoviuosius domenus.
[0091] Kitas šio išradimo aspektas apima kompoziciją, turinčią išskirtą mpl agonistą, kuris yra biologiškai aktyvus ir gali stimuliuoti žymėtų nukleotidų (pvz., 3H-timidino) įsijungimą į IL-3 priklausomų Ba/F3 ląste-lių, transfekuotų žmogaus mpl geno, DNR. Mpl agonistas gali būti ne kas kitas, kaip aktyvus mpl ligandas, sugebantis stimuliuoti 35S įsijungimą į cirkuliuojan-čius trombocitus, kaip nustatyta pelių atsakomosios trombocitozės medodu. Tinkami mpl agonistai : hMLi53, hML(R153A,R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML ir pML2 arba jų fragmentai.
[0092] Kita šio išradimo dalis apima išskirtus antikūnus, surišančius mpl ligandą. Tokie antikūnai arba tokių antikūnų chimeros su kitais polipeptidais gali būti panaudoti mpl ligando išskyrimui bei išgryninimui iš ligando šaltinio, kaip aprašyta aukščiau, su imobilizuotu mpl. Toliau šiame išradime pateiktas mpl ligando nustatymo būdas in vitro ir in vivo. Būdas pagrįs-tas antikūnų sąveika su pavyzdyje, ypač serume, esančiu ligandu ir susidariusio komplekso detekcija.
[0093] Dar kitoje išradimo dalyje pateikta išskirta nukleino rūgšties molekulė, koduojanti mpl ligandą ar jo fragmentą. Ši molekulė gali būti pažymėta detektuo-jama žyme ir panaudota hibridizacijai ( vidutinėse ir griežtose sąlygose) su nukleino rūgšties molekule, turinčia sekas, komplementarias mpl ligandą koduojan-čiai sekai. Pirmiausia tai nukleino rūgščių molekulės, koduojančios žmogaus, kiaulės ir pelės mpl ligandus; tai gali būti RNR ir DNR, tiek genominė DNR, tiek ir kDNR. Tolesnis šios dalies aspektas apima DNR molekulę, koduojančią mpl ligandą ir įkonstruotą į replikacijos vektorių, kuriame šis DNR fragmentas prijungtas prie kontrolinių sekų, kurias atpažįsta vektoriumi transformuotos ląstelės- šeimininkai. Tinkamiausia DNR yra kDNR, kurios seka pateikta Fig. 1 5' - 3' ( SEQ ID Nr. 2), 3'-51 ar jos fragmentas. Toliau į šį aspektą įtraukiamos lastelės- šeimininkai ( geriausiai tinkamos CHO ląstelės, transformuotos minėtu vektoriumi) , o taip pat DNR pa-naudojimo būdas, stimuliuojantis mpl ligando produkci-ją, sukeliant kDNR, koduojančios mpl ligandą, ekspresi-ją transformuotų ląstelių- šeimininkų kultūroje ir iš-skiriant mpl ligandą iš ląstelių šeimininkų arba kultivavimo terpių, kuriose šios ląstelės buvo auginamos.
[0094] Išradimas apima terapiškai efektyvių mpl ligando kiekių panaudojimą žinduolių, turinčių hemopoetinių sutrikimų, ypač trombocitopeniją, terapijai. Pasirin-ktinai mpl ligandas gali būti suleidžiamas kartu su kitais citokinais, ypač su kolonijas stimuliuojančiu faktoriumi ar interleukinu. Geriausi kolonijas stimuliuojantys faktoriai ar interleukinai yra šie: kit-ligandas (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, Mpl-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 ir IL-11.
[0095] Toliau išradime aprašomas TPO (ML) išskyrimo ir gryninimo iš TPO produkuojančių mikroorganizmų būdas, kuriame: (1) ląsteles, turinčias TPO, suardo arba lizuoja; (2) atskyria tirpias ir netirpias medžiagas, turinčias TPO; (3) TPO ištirpina iš netirpios medžiagos soliubilizuoj ančių buferiniu tirpalu; (4) tirpų TPO išskiria iš kitų tirpių ir netirpių medžiagų; (5) TPO natyvią konformaciją atstato red-oks buferiniame tirpale; (6) taisyklingos konformacijos TPO molekules atskiria nuo netaisyklingai susiformavusių molekulių.
[0096] Netirpaus TPO ištirpinimui naudojamas chaotropinis agentas, kuris pasirenkamas iš šių agentų: guanidino druskos, natrio tiocianato arba karbamido. Tolesnis pro- cesas yra soliubilizuoto TPO atskyrimas iš kitų tirpių bei netirpių medžiagų, naudojant vieną ar daugiau etapų, pasirenkamų iš: centrifugavimo, gel-filtra-cijos ir atvirkščių fazių chromatografijos. Natyvios konformacijos atstatymas vykdomas red-oks buferiniame tirpale, kurio sudėtyje yra oksidatorius ir redukto-rius. Dažniausiai oksiduojantis agentas yra deguonis arba junginys, turintis mažiausiai vieną disulfidinę jungtį, o redukuojantis agentas yra junginys, turintis bent vieną laisvą sulfhidrilinę grupę. Oksiduojantis agentas pasirenkamas iš oksiduoto gliutationo (GSSG) ar cistino, redukuojantis - iš redukuoto gliutationo (GSH) ir cisteino. Geriausias oksiduojantis agentas yra oksiduotas gliutationas (GSSG), o geriausias redukuojantis agentas - redukuotas gliutationas (GSH). Patartina, kad oksiduojančio ir redukuojančio agentų molinis santykis būtų lygus ar didesnis už vienetą. Papildomai į red-oks buferinį tirpalą įeina detergentas, pasirenkamas iš CHAPS ir CHAPSO; jo koncentracija turi būti ne mažesnė kaip 1 %. Be to į red-oks buferinio tirpalo sudėtį įeina 0,1 -0,5 M NaCl ir 15 % ar daugiau glicerino. Red-oks buferinio tirpalo pH yra 7.5 - 9.0, konformacijos atstatymo procesas vykdomas 12 - 48 valandas 4°C temperatūroje. Po konformacijos atstatymo etapo gaunamas biologiškai aktyvus TPO, kuriame disulfidinė jungtis yra sudaryta tarp Cys, esančio arčiausiai N baltymo galo ir Cys, esančio arčiausiai EPO domeno C galo.
[0097] Toliau išradimas apima būdą, skirtą biologiškai aktyvaus TPO išgryninimui iš mikroorganizmo. Šį būdą vykdo taip: (1) lizuoja bent ekstraląstelinę mikroorganizmo membraną; (2) lizatą, kuriame yra TPO, apdoroja chaotro-piniu agentu;
[0098] (4) atskiria piemaišas bei netaisyklingos konformacijos TPO molekules.
[0099] Fig. 1 pateikta žmogaus mpl ligando (hML) išvestinė amino rūgščių liekanų seka iš kDNR (SEQ ID Nr. 1) ir koduojančių nukleotidų sekos (SEQ ID Nr. 2) . Nukleotidai sunumeruoti nuo kiekvienos eilutės pradžios. 5' ir 3' netransliuojamos sritys pavaizduotos mažosiomis raidėmis. Amino rūgščių liekanų sekos sunumeruotos vir-šuje, pradedant nuo pirmosios subrendusio mpl ligando
[0100] (ML) amino rūgšties liekanos Ser. Spėjamo egzono 3 ribos pažymėtos rodyklėmis, galimos N-glikozilinimo vietos yra apibrėžtos. Cisteino liekanos yra pažymėtos tašku virš liekanos. Mpl ligando, išskirto iš kiaulės plazmos, nustatytas N galas yra pabrauktas. Fig. 2 pavaizduota mpl ligando nustatymo procedūra pagal 3H-timidino įsijungimą. Nustatant įvairiuose šaltiniuose mpl ligandą, mpl P Ba/F3 ląstelės auginamos be IL-3 24 valandas inkubatoriuje, prisotintame vandens garais, 37°C temeratūroje, paduodant orą su 5% CO2. Po ląstelių auginimo be IL-3 ląstelės pernešamos į 96 šu-linėlių audinių kultūrų plokšteles ir inkubuojamos 24 valandas su praskiestais mėginiais arba be jų. Pasku-tines 6-8 valandas į kiekvieną šulinėlį pridedama 20 jai beseruminės RPMI terpės su 1 p.Ci 3H-timidino. Ląstelės surenkamos 96 šulinėlių filtruojamose plokštelėse ir praplaunamos vandeniu. Įvertinamas filtruose esantis radioaktyvumas. Fig. 3 pavaizduota pronazės, DTT ir temperatūros įtaka APP sugebėjimui stimuliuoti Ba/F3-mpl ląstelių proli-feraciją. Skaldant APP, pronazė (Boehringer Mannheim) arba jaučio serumo albuminas imobilizuojami ant Affi-gellO (Bio-Rad) ir inkubuojami atskirai su APP 18 va-landų 37°C temperatūroje. Pašalinus sorbentus centri-fūguojant, analizuojami supernatantai. APP kaitinamas 80°C temperatūroje 4 minutes arba pridedama 100 |j.M DTT ir dializuojama prieš PBS. Fig. 4 pavaizduota mpl ligando eliucija iš Phenyl-Toyopearl, Blue-Sepharose ir Ultralink-mpI sorbentų. Pažy-mėtos frakcijos F4 -F8 (dižiausio aktyvumo frakcijos) yra surinktos desorbuojant nuo mpl afininės kolonėlės. Fig. 5 pavaizduota frakcijų, desorbuotų nuo Ultralink-mpl, SDS-PAGE elektroforegrama. Į kiekvienos (2-8) frakcijos 200 jj.1 pridedama 1 ml atšaldyto iki -20°C lmM HC1 tirpalo acetone. Išlaikius mėginius tris valandas -20°C temperatūroje, centrifuguojama, nuosėdos praplaunamos du kartus atšaldytu iki -20°C acetonu. Acetoninės nuosėdos ištirpinamos 30 (ii SDS buferiniame tirpale, pridedama iki 100 faM DTT ir kaitinama 90°C temperatū-roje 5 minutes. Atliekama mėginių SDS PAGE elektrofo-rezė 4-20% koncentracijos poliakrilamidiniame gelyje, po elektroforezės geliai dažomi sidabru. Fig. 6 pavaizduotas mpl ligando eliucijos vaizdas iš SDS-PAGE gelio. 6 frakcija nuo mpl-afininio sorbento buvo analizuota 4-20% koncentracijos poliakrilamidiniame gelyje neredukuojančiomis sąlygomis. Po elektro-forezės gelis buvo supjaustytas į 12 lygių dalių, baltymas aprašytu pavyzdžiuose būdu buvo elektroeliu-juojamas. Eliujuoti mėginiai buvo dializuojami prieš PBS ir tiriami praskiedus 20 kartų. Buvo naudojami Novex Mark 12 molekulinės masės standartai. Fig. 7 pavaizduota mpl ligando įtaka žmogaus megaka-riocitopoezės procesui. APP be mpl ligando paruošiama praleidus 1 ml per 1 ml mpl-afininę kolonėlę (700 (J.g mpl-IgG/ml NHS-Superose, Pharmacia) . Į žmogaus peri-ferinių kamieninių ląstelių kultūrą įdedama 10 % APP arba 10 % APP be mpl ligando ir auginamos 12 dienų. Megakariocitopoezės procesas kiekybiškai įvertinamas pavyzdžiuose aprašytu būdu. Fig. 8 pavaizduota mpl-IgG įtaka stimuliuojant žmogaus megakariocitopoezės procesą APP. Į žmogaus periferinių kamieninių ląstelių kultūrą įdedama 10 % APP ir auginamos 12 dienų. Pačioje pradžioje, antrą ir ketvirtą kultivavimo dieną pridedama inpl-IgG (0,5 jig) arba ANP-R-IgG (0,5 jig) . Po 12 dienų megakariocitopoezės procesas kiekybiškai įvertinamas pavyzdžiuose aprašytu būdu. Dviejų analizių vidurkiai pavaizuoti grafiškai, skliaustuose nurodyti abiejų analizių rezultatai. Fig. 9 pavaizduotas dvigrandis 390 bp žmogaus genominės DNR fragmentas, koduojanis mpl ligandą. Taip pat pateiktos išvestinė "egzono 3" amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 3), koduojanti seka (SEQ ID Nr. 4) ir komplementari seka (SEQ ID Nr. 5) . Fig. 10 pavaizduotos išvestinė subrendusio mpl ligando (hML) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 6) ir subrendusio žmogaus eritropoetino (hEPO) išvestinė amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 7). Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibėžtos, tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Potencialios N-glikozilinimo vietos hML sekoje pažymė-tos ištisine linija, o hEPO sekoje - punktyru. Dvi cisteino liekanos, svarbios eritropoetino aktyvumui, pažymėtos tašku. Fig. 11 pavaizduotos išvestinės subrendusių žmogaus mpl ligandų izoformų hML (SEQ ID Nr. 6), hML2 (SEQ ID Nr. 8), hML3 (SEQ ID Nr. 9) ir hML4 (SEQ ID Nr.: 10) amino rūgščių liekanų sekos. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibėžtos, tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Fig. 12A, 12B ir 12C pavaizduotas žmogaus mpl ligando poveikis Ba/F3-znpl ląstelių proliferacijai ( A), žmogaus megakariocitopoezės procesas in vitro kiekybiškai
[0101] įvertintas naudojant žymėtus pelės monokloninius IgG antikūnus, specifinius megakariocitų glikoproteinui GPIIbUIa ( B) i^ pelių trombopoezės procesas įvertintas atsakomosios trombocitozės metodu ( C).
[0102] 293 linijos ląstelės buvo trasfekuotos vien pRK5 vektoriumi, pRK5-hML vektoriumi arba pRK5-MLi53 vektoriumi kalcio fosfatiniu metodu (Gorman, C. in DNA Cloning: A New Approach 2:143-190 [1985]) per naktį
[0103] (pRK5-MLi53 vektorius buvo sukonstruotas įterpiant PCR metodu stop kodoną po 153 hML baltymo amino rūgšties liekanos). Transformantai buvo auginami 36 valandas ir terpė, kurioje jie augo, buvo įvertinama nustatant: sugebėjimą stimuliuoti Ba/F3- mpl ląstelių prolifera-ciją, kaip aprašyta Pavyzdyje 1 (A) arba sugebėjimą stimuliuoti žmogaus megakariocitopozę in vitro, kaip aprašyta Pavyzdyje 1 (B) . Megakariocitopozės procesas kiekybiškai buvo įvertinamas naudojant žymėtus 125J pelės monokloninius IgG antikūnus (HP1-1D), prieš megakariocitų specifinį glikoproteiną GPIIbIIIa Grant et al., Blood 69:1334-1339 [1987] aprašytu būdu. Dalinai išgryninto rekombinantinio ML baltymo (rML) efektas trombocitų susidarymui in vivo ( C) buvo įver-tintas, naudojant atsakomosios trombocitozės metodą, kaip aprašyta McDonald, T.P. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144: 1006-10012 (1973). Dalinai išgrynintas rML buvo paruošiamas iš 200 ml kondicionuotos terpės, turinčios rekombinantinio ML. Terpė buvo gryninama per 2 ml tūrio Blue-Sepharose kolonėlę, nulygsvarintą PBS, kolonėlė praplaunama PBS ir sorbuoti baltymai buvo eliujuojami PBS, pridėjus 2M karbamido ir 2M NaCl. Frakcijos, kuriose buvo nustatytas aktyvumas, buvo dializuojamos PBS ir pridedama iki 1 mg/ml koncentracijos BSA be endotoksinų. Taip paruoštuose preparato mėginiuose endotoksinų koncentracija buvo mažesnė, nei 1 vienetas mililitre. Pelėms buvo suleidžiama 64000, 32000 arba
[0104] 16000 rML vienetai arba vien tirpiklis. Kiekvieną grupę sudarė šešios pelės. Pateikti vidurkiai ir standar-tiniai nukrypimai kiekvienai grupei, p reikšmes buvo nustatytos T-analize, įvertinant reikšmių patikimumą. Fig. 13 palygintas žmogaus mpl ligando izoformų ir variantų poveikis Ba/F3- mpl ląstelių proliferacijai. hML, mock, hML2, hML3, hML (R153A, R154A) ir hMLi53 įtaka buvo įvertinta įvairiuose preparatų praskiedimuose kaip aprašyta Pavyzdyje 1. Fig. 14A, 14B 14C, 14D ir 14E pavaizduotos išvestinė mpl ligando (hML) arba TPO (hTPO) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 1) ir koduojanti žmogaus genominės DNR seka (SEQ ID Nr. 11) . Nukleotidų ir amino rūgščių liekanų numeriai nurodyti-kiekvienos eilutės pradžioje. Fig. 15 pateikta išgrynintų 293-rhML332 ir 293-rhMLi53 baltymų SDS-PAGE elektroforegrama. Fig. 16 pateiktos koduojanti kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 12) ir pelių ML baltymo Izoformos išvestinė amino rūgščių liekanų seka, koduojama atvirame skaitymo rėmelyje, (SEQ ID Nr. 13). Ši subrendusio pelių mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 331 amino rūgščių liekanų, taigi, šis baltymas keturiomis amino rūgščių liekanomis trumpesnis, nei visas mML baltymas, todėl jis žymimas mML2. Nukleotidai sunumeruoti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgščių liekanos sunumeruotos virš liekanų, pradedant nuo Ser 1. Potencialios N-glikozilinimo vietos yra pabrauktos. Cisteino liekanos pažymėtos tašku. Fig. 17 pateiktos kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 14) ir išvestinė pelių ML baltymo izoformos (mML) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 15) . Nukleotidų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgš-čių liekanos sunumeruotos virš liekanų, pradedant nuo Ser 1. Ši subrendusio pelių mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 335 amino rūgščių liekanų, tai yra pilno ilgio mpl ligando baltymas, žymimas mML. Signalinė seka yra pabraukta punktyru, spėjama skėlimo vieta pažymėta rodykle. 51 ir 3' netransliuojamos sritys pažymėtos mažosiomis raidėmis. Dvi delecijos vietos yra pabrauktos, baltymai, turintys šias delecijas, atsiradusias dėl alternatyvaus splaisingo, žymimi mML2 ir mML3. Keturios cisteino liekanos pažymėtos taškais. Septynios potencialios N-glikozilinimo vietos yra apibrauktos. Fig. 18 yra palygintos žmogaus ML baltymo izoformos hML3 (SEQ ID Nr. 9) ir pelės ML baltymo izoformos mML3 (SEQ ID Nr. 16) išvestinės amino rūgščių liekanų sekos. Išvestinė žmogaus mpl ligando baltymo amino rūgščių liekanų seka yra sulyginta su pelių mpl ligando baltymo seka. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibrauktos; tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Amino rūgščių liekanų numeracija yra kiekvienos eilutės pradžioje. Fig. 19 yra palygintos subrendusių ML baltymo izoformos: pelės-ML (SEQ ID Nr. 17), kiaulės-ML (SEQ ID Nr. 18) ir žmogaus-ML (SEQ ID Nr. 6) sekos. Amino rūgščių liekanų sekose tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Amino rūgščių liekanų numeracija yra kiekvienos eilutės pradžioje, identiškos amino rūgščių liekanos yra apibrauktos. Potencialios N-glikozilinimo vietos yra apibrauktos, cisteino liekanos yra pažymėtos taškais. Konservatyvių dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvas, nurodantis galimą proteinazių skėlimo vietą, yra pabrauktas. Aptinkamos keturios delecijos vietos visuose trijuose baltymuose (ML2) yra užtušuo-tos . Fig. 20 pateiktos kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 19) ir išvestinė subrendusio kiaulės ML baltymo izoformos (pML) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 18).Ši kiaulės mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 332 amino rūgščių liekanų, tai yra pilnas subrendęs kiaulės mpl ligando baltymas, žymimas pML. Nukleotidų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgščių liekanos sunumeruotos viršuje, pradedant nuo Ser 1. Fig. 21 pateiktos kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 20) ir išvestinė subrendusio kiaulės ML baltymo izoformos (pML2) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 21) .Ši kiaulės mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 328 amino rūgščių liekanų, tai yra pilnas subrendęs kiaulės mpl ligando baltymas be keturių amino rūgščių liekanų, žymimas pML2. Nukleotidų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgščių liekanos sunumeruotos viršuje, pradedant nuo Ser 1. Fig. 22 yra palygintos subrendusio kiaulės ML baltymo izoformos pML (SEQ ID Nr. 18) ir kiaulės ML baltymo izoformos pML2 (SEQ ID Nr. 21) sekos. Išvestinė pML baltymo amino rūgščių liekanų seka yra sulyginta su pML2 baltymo seka. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibrauktos; lengvesniam palyginimui palikti pažy-mėti punktyru tarpai. Amino rūgščių liekanų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje. Fig. 23 yra pateikta plazmidės pSVI5. ID. LL. MLORF ("pilno ilgio" arba TPO332) konstrukcija, šia plazmide buvo transfekuojamos CH0-DP12 ląstelės CH0-rhTP0332 produkcijai. Fig. 24 yra pateikta plazmidės pSVI5.ID.LL.MLEPO-D ("sutrumpinto" arba TPO153) konstrukcija, šia plazmide buvo transfekuojamos CH0-DP12 ląstelės CHO-rhTPOi53 produkcij ai. Fig. 25A, 25B ir 25C pateiktas E. coli-rhTPO(Met-1,i53) poveikis normalių pelių trombocitams ( A), eritrocitams ( B) ir leukocitams ( C) . Dviems C57 B6 linijos pelių patelių grupėms (po 6 pateles grupėje) buvo kasdien suleidžiama PBS buferinio tirpalo arba 0,3 jig E. coli-rhTPO(Met_1,i53) (100 fil, sc.) Prieš suleidžiant mėginius (diena 0) ir nuo 3 iki 7 dienos kraujas buvo imamas po 40fil iš pelių akiduobės sinuso. Paimtas kraujas buvo iškart praskiedžiamas 10 ml standartiniu skiedikliu ir atliekama pilna kraujo forminių elementų analizė Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 aparatu. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Fig. 26A, 26B ir 26C pateiktas £. coli-rhTPO(Met~1,i53) poveikis subletaliai apšvitintų pelių trombocitams ( A) , eritrocitams ( B) ir leukocitams ( C) . Dviems C57 B6 linijos pelių grupėms (po 10 patelių grupėje), kurios buvo subletaliai apšvitinamos 750 cGy galingumo gama spinduliais iš 137Cs radiacijos šaltinio, kasdien buvo suleidžiama PBS buferinio tirpalo arba 0,3 jig E. coli-rhTPO(Met-1,153) (100 Įil, sc.). Prieš suleidžiant mėginius (diena 0) ir tam tikrais intervalais kraujas po - 40 p.1 buvo imamas iš pelių akiduobės sinuso. Paimtas kraujas buvo iškart praskiedžiamas 10 ml standartiniu skiedikliu ir atliekama pilna kraujo forminių elementų analizė
[0105] Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 aparatu. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Fig. 27A, 27B ir 27C pateiktas CH0-rhTP0332 poveikis normalių pelių trombocitams ( A) , eritrocitams ( B) ir leukocitams ( C) . Dviems C57 B6 linijos pelių grupėms (po 6 pateles grupėje) buvo kasdien suleidžiama PBS buferinio tirpalo arba 0,3 |ig CHO-rhTPC>332 (100 Įil, sc.) Prieš suleidžiant mėginius (diena 0) ir nuo 3 iki 7 dienos kraujas po 40 [0.1 buvo imamas iš pelių akiduobės sinuso. Paimtas kraujas buvo iškart praskiedžiamas 10 ml standartiniu skiedikliu ir atliekama pilna kraujo forminių elementų analizė Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 aparatu. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Fig. 28 pateiktos atsako į dozę kreivės įvairių rhTPO, gautų iš įvairių ląstelių linijų. Pateiktos atsako priklausomybės nuo dozės kreivės rhTPO iš šių ląstelių linijų: I1TPO332 iš CHO (viso ilgio baltymas, išskirtas iš Kinijos žiurkėnų kiaušidžių ląstelių) , hTPO met_ 1 153 ( E. coli produktas sutrumpintas nuo N baltymo galo su Met liekana N baltymo gale) , I1TPO332 (pilnas TPO baltymas, išskirtas iš žmogaus 293 linijos ląstelių), be Met 155 E. coli (sutrumpintas [rhTPOi55] baltymas be pirmos metionino liekanos, išskirtas iš E. coli). Šešioms C57B6 linijos pelių patelių grupėms buvo kasdien 7 dienas suleidžiami rhTPO preparatai. Kiek-vieną dieną buvo paimama po 40 pil kraujo iš pelių akiduobės sinuso pilnai kraujo forminių elementų analizei. Duomenyse, pateiktuose ankščiau, parodytas maksimalus atsakas, kuris visuose bandymuose, išskyrus Metl53 E- Coli, buvo stebimas septintą tyrimų dieną. Minėtoje "Metl53 E- Coli" grupėje maksimalus efektas buvo stebimas penktą tyrimų dieną. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Fig. 29 pateiktos atsako kreivės lyginant pilno baltymo aktyvumą ir "sutrumpintų" rhTPO baltymo formų, išskirtų iš CHO ląstelių, aktyvumą su sutrumpintais baltymais, išskirtais iš E. coli. Šešioms C57B6 linijos pelių patelių grupėms buvo kasdien suleidžiami po 0,3 |ig įvairaus tipo rhTPO preparatai. Nuo 2 iki 7 dienos kas dieną buvo paimama po 40 fil kraujo iš pelių akiduobės sinuso pilnai kraujo forminių elementų analizei. Buvo tirti šie preparatai: sutrumpintas TPO - TPO153, išskirtas iš E. coli; TPO332 (frakcijų mišinys) kuriame yra 80-90% viso ilgio TPO baltymo ir 10-20 % sutrumpintų šio baltymo formų; TPO332 (30K frakcija) - išgrynintos iš "frakcijų mišinio" sutrumpintos formos; TPO332 (70K frakcija) - išgrynintas iš frakcijų mišinio viso ilgio TPO baltymas. Duomenys pateikti kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Fig. 30 pavaizduotas TPO baltymo nustatymas KIRA ELISA analize. Paveikslėlyje pavaizduotos MPL/Rse.gD chime-rinė molekulė ir atitinkamos pradinio receptoriaus dalys, taip pat ir galutinis kompleksas (dešinė pavei-kslėlio dalis) ir analizės diagrama, parodanti tiesio-gines matavimo stadijas (kairė piešinėlio pusė) . Fig. 31 pateikta KIRA ELISA analizės eigos schema etapais. Fig. 32A - 32Z- 5 pateikta ekspresijos vektoriaus pSVI17.1D.LL, panaudoto Pavyzdyje 17 Rse.gD ekspresijai, nukleotidų seka (SEQ ID Nr. 22) . Fig. 33A ir 33B pateikta plazmidės pMPl konstravimo schema. Fig. 34 pateikta plazmidės pMP21 konstravimo schema. Fig. 35 pateikta plazmidės pMP151 konstravimo schema. Fig. 36 pateikta plazmidės pMP202 konstravimo schema. Fig. 37 pateikta plazmidės pMP172 konstravimo schema. Fig. 38 pateikta plazmidės pMP210 konstravimo schema. Fig. 39 pateikti penki geriausiai ekspresuojami TPO klonai, gauti naudojant plazmidės pMP210 banką (SEQ ID NR. 23, 24, 25, 26, 27 ir 28) . Fig. 40 pateikta plazmidės pMP41 konstravimo schema. Fig. 41 pateikta plazmidės pMP57 konstravimo schema. Fig. 42 pateikta plazmidės pMP251 konstravimo schema.
[0106] Žemiau pateikti žodžiai ir frazės turi nurodytą reikšmę, kai jie panaudoti aprašyme, pavyzdžiuose ar išradimo apibrėžtyje.
[0107] "Chaotropinis agentas" - junginys, kuris vandeni-niame tirpale, esant jo pakankamai koncentracijai gali sukelti baltymo konfigūracijos ar konformacijos pasi-keitimus, visiškai ar ne visiškai pašalinant sąveikas, atsakingas už normalios antrinės bei tretinės baltymo struktūros palaikymą. Tokių junginių pavyzdžiai yra: karbamidas, guanidino hidrochloridas ir natrio
[0108] tiocianatas. Paprastai baltymo konformacijai pažeisti reikalingos didelės šių junginių koncentracijos, dažniausiai nuo 4 iki 9 M.
[0109] "Citokinas" - bendras terminas, taikomas baltymams, kurie sekretuojami vienos ląstelių populiacijos ir veikia kitą ląstelių populiaciją kaip tarpląste-liniai mediatoriai. Tokių citokinų pavyzdžiai yra: limfokinai, monokinai ir tradiciniai polipeptidiniai hormonai. Prie citokinų priskiriami: augimo hormonas (somatotropinas), į insuliną panašūs augimo faktoriai, žmogaus augimo hormonas, žmogaus N-metionilsomatotro-pinas, galvijų augimo hormonas, paratiroidinis hormonas, tiroksinas, insulinas, proinsulinas, relaksinas, prorelaksinas, glikoproteininiai hormonai, tokie kaip folikulus stimuliuojantis hormonas (FSH), tiroidus stimuliuojantis hormonas (TSH), liuteinizuojantis hormonas (LH) , hemopoetinis augimo faktorius, hepatocitų augimo faktorius, fibroblastų augimo faktorius, prolaktinas, placentinis laktogenas, a- ir p-auglių nekrozės faktoriai, (TNF-a ir TNF-P), pelių gonadotropin-asocij uotas peptidas, inhibinas, aktivinas, vaskuliarinio endotelio augimo faktorius, integrinas, nervų augimo faktoriai, tokie kaip NGF-p, trombocitų augimo faktorius, trans-formuojantys augimo faktoriai (TGFs), tokie kaip TGF-a ir TGF-p, panašūs į insuliną augimo faktoriai I ir II, eritropoetinas (EPO), osteoinduktyvūs faktoriai, inter-feronai, tokie kaip interferonas a, P ir y, kolonijas stimuliuojantys faktoriai (CSFs), tokie kaip makrofagų CSF (M-CSF), granuliocitų-makrofagų CSF (GM-CSF) ir granuliocitų CSF (G-CSF), interleukinai (ILs), tokie kaip IL-1, IL-lcc, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 ir kiti polipeptidiniai faktoriai, tarp jų ir LIF, SCF ir kit-ligandas. Nurodyti terminai šiame kontekste apima baltymus, išgrynintus iš natūralių šaltinių ir iš rekombinantinių ląstelių
[0110] kultūrų. Analogiškai šie terminai apima ir biologiškai aktyvius jų ekvivalentus, pvz., variantus, kurie skiriasi viena ar daugiau amino rūgščių liekanomis arba glikozilinimo tipu ir laipsniu.
[0111] " mpl ligandas", " mpl ligando polipeptidas", "ML", "trombopoetinas" ar "TPO" yra sinonimai, kuriais vadinamas bet koks polipeptidas, kuris gali jungtis su citokinų receptorių superšeimos narių mpl receptoriumi ir kuris turi ML būdingas biologines savybes, apibrėž-tas žemiau. Charakteringiausia biologinė savybė yra sugebėjimas stimuliuoti žymėtų nukleotidų (pvz., 3H-timidino) įsijungimą į IL-3 priklausomų, transformuotų žmogaus mpl P genu, ląstelių Ba/F3 DNR. Kita charakte-ringa biologinė savybė yra sugebėjimas stimuliuoti 35S įsijungimą į cirkuliuojančius pelių atsakomosios trom-bocitozės inhibicijos metodo pagalba. Šis apibrėžimas apima polipeptidą, išskirtą iš mpl ligando šaltinio, tokio kaip aplastinių kiaulių plazma, kaip aprašyta šiame išradime, arba iš kitų šaltinių, pvz., kitų gyvū-nų rūšių, tarp jų ir žmogaus, arba paruošta genoinži-nieriniu ar sintetiniu būdu, o taip pat šių formų variantus, tarp jų ir funkcionalius darinius, fragmentus, alelinius variantus, izoformas ir analogus.
[0112] " Mpl ligando fragmentas" arba "TPO fragmentas" yra natyvaus pilno ilgio subrendusio mpl ligando ar TPO amino rūgščių liekanų sekos dalis, kurioje trūksta vienos ar daugiau amino rūgščių liekanų ar angliavan-denių. Trūkstamos amino rūgščių liekanos gali būti molekulės N gale, C gale arba viduryje. Fragmentas turi bet kur: turėti bent vieną mpl ligando savybių. Mpl ligando fragmentas paprastai turi 10, 15, 20, 30 ar 40 amino rūgščių liekanų, identiškų mpl ligando, išskirto iš žinduolių, tarp jų ir iš aplastinės kiaulių plazmos, taip pat žmogaus ar pelės ligando, ypač jo EPO domenų, sekai . Charakteringi N galinio fragmento pavyzdžiai yra hMLi53 arba TP0(Met_1 1-153) .
[0113] " Mpl ligando variantas" arba " mpl ligando sekos variantas" čia apibrėžiamas kaip biologiškai aktyvus mpl ligandas, kurio amino rūgščių liekanų seka iden-tiška mažiau nei 100 % mpl ligando, išskirto iš rekom-binantinių ląstelių kultūros arba aplastinės kiaulių plazmos, sekai, arba žmogaus ligando išvestinei amino rūgščių liekanų sekai, pateiktai Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1). Paprastai biologiškai aktyvaus mpl ligando varianto amino rūgščių liekanų seka turi būti ne mažiau kaip 70 % identiška mpl ligando, išskirto iš aplastinės kiaulių plazmos arba subrendusio žmogaus ar pelės mpl ligando ar jų fragmentų, amino rūgščių liekanų sekai (žiūr. Fig. 1 [SEQ ID Nr. 1]); geriau, jei sekų iden-tiškumas siekia bent 75 %, dar geriau - bent 80 %, dar geriau - bent 85 %, dar geriau - bent 90 % ir geriausias variantas - kai yra ne mažesnis kaip 95 % sekų sutapimas.
[0114] "Chimerinis mpl ligandas" yra polipeptidas, kuris sudarytas iš pilno ilgio mpl ligando ar vieno arba kelių ligando fragmentų, kurie sulieti arba sujungti su kitu heterologiniu peptidu arba jo fragmentu (vienu ar keliais). Chimerinis junginys turi turėti bent vieną mpl ligando biologinę savybę. Antras polipeptidas turi būti citokinas, imunoglobulinas arba jų fragmentai.
[0115] "Išskirtas mpl ligandas", "išgrynintas mpl ligandas" ar "homogeniškas mpl ligandas" yra sinonimai. Šiais terminais vadinamas mpl ligandas, išgrynintas iš mpl ligando šaltinio, arba pagamintas genoinžinieriniu ar sintetiniu būdais ir praktiškai neturintis kitų bal-tymų ar peptidų priemaišų. Švarumas nustatomas dviem metodais: (1) sekvenuojant 15, geriau 20 iš N baltymo galo ar molekulės vidurinės dalies amino rūgščių lie-kanų seką, naudojantis geriausiu komerciniu sekvenatoriumi ir geriausiu žinomu šiai datai būdu; (2) homoge-niškumas nustatomas SDS PAGE elektroforeze redukuojan-
[0116] čiomis ir neredukuojančiomis sąlygomis, baltymo dažymui naudojamas Coomasie Blue arba, geriau, kai dažoma sidabru. Homogeniškumas reiškia, kad kitų baltymų prie-maišos neviršija 5 %.
[0117] "Biologinė savybė", kai naudojama kartu su " mpl ligandas" ar "išskirtas mpl ligandas", reiškia turėti trombopoetinį aktyvumą, ar turėti in vivo efektorinę arba antigeninę funkcijas, arba aktyvumą, kuris tiesiogiai ar netiesiogiai sąlygojamas mpl ligando (nesvarbu, natyvaus ar denatūruoto) ar jo fragmento. Efektorinės funkcijos apima mpl surišimą, ar kito nešiklio suriši-mą, agonizmą ar antagonizmą mpl, ypač proliferacijos signalo perdavimą, o taip pat replikaciją, DNR regulia-torinę funkciją, citokinų biologinio aktyvumo modulia-ciją, receptorių (ypač citokinų receptorių) aktyvaciją, inaktyvaciją, kiekio sumažėjimą ar padidėjimą, ląstelių augimą ir diferenciaciją ir panašiai. Antigeninė funkcija reiškia epitopo ar antigeninės determinantės, kuri gali kryžmiškai reaguoti su antikūnais prieš natyvų mpl ligandą, buvimas. Principinė antigeninė mpl ligando polipeptido funkcija yra tai, kad jis jungiasi su anti-kūnais, pagamintais prieš mpl ligandą, išskirtą iš aplastinių kiaulių plazmos; šios sąveikos konstanta turi būti ne mažesnė, nei 106 l/M. Paprastai šios są-veikos surišimo konstanta ne mažesnė, nei 107 l/M. Antigeniškai aktyvus mpl ligando polipeptidas, geriausiai, yra tas polipeptidas, kuris sąveikauja su anti-kūnais, pagamintais prieš mpl ligandą, pasižymintį viena iš aukščiau aprašytų efektorinių funkcijų. Anti-kūnai, taikomi "biologinio aktyvumo" nustatymui, yra triušio poliklonaliniai antikūnai. Šiems antikūnams pagaminti triušiai imunizuojami, suleidžiant po oda mpl ligandą (išskirtą iš rekombinantinių ląstelių kultūros ar aplastinės kiaulių plazmos) su pilnu Freund'o adjuvantu. Pakartotinės imunizacijos tuo pačiu preparatu į
[0118] pilvo ertmę vykdomos tol, kol pasiekiamas reikalingas antikūnų titras.
[0119] Terminas "biologiškai aktyvus", vartojamas kartu su terminu " mpl ligandas" ar " išskirtas mpl ligandas", reiškia mpl ligandą ar polipeptidą, kuris pasižymi trombopoetiniu aktyvumu, ar turi tokią pat efektorinę funkciją, kaip mpl ligandas, išskirtas iš aplastinės kiaulių plazmos arba ekspresuotas rekombinantinių ląstelių kultūroje. Svarbiausia žinoma mpl ligando ar polipeptido efektorinė funkcija yra mpl surišimas ir žymėtų nukleotidų (3H-timidino) įsijungimo į IL-3 pri-klausomų BA/F3 ląstelių, transfekuotų žmogaus mpl P DNR, stimuliacija. Kita žinoma efektorinė mpl ligando ar polipeptido funkcija yra sugebėjimas stimuliuoti 35S įsijungimą į cirkuliuojančius trombocitus, įvertinamas pelių trombocitų inhibicijos metodu. Dar viena žinoma mpl ligando efektorinė funkcija yra jo sugebėjimas stimuliuoti in vitro žmogaus megakariocitopoezę, kurią galima įvertinti, naudojant žymėtus radioaktyvia žyme monokloninius antikūnus prieš megakariociotų glikopro-teiną GPIIbIIIa-
[0120] Sąvoka "amino rūgščių liekanų sekos identiškumo procentas" taikoma, lyginant sekas su mpl ligando seka, pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1) .Ši seka atitinka mpl ligandą, išskirtą iš aplastinės kiaulių plazmos, arba pelių ar žmogaus mpl ligandą. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibėžtos; tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. "Identiškumo procentas" yra sutampančių amino rūgščių liekanų procentas nuo visų amino rūgščių liekanų sekoje. Konserva-tyvių amino rūgščių liekanų pasikeitimai nelaikomi sekos identiškumo dalimi. N ir C baltymo galuose papildomos amino rūgščių liekanos, intarpai ir delecijos mpl ligando amino rūgščių liekanų sekoje nelaikomi identiš-kurną mažinančiais faktoriais. Tokiu būdu, biologiškai aktyvūs mpl ligandai, kurių sekos laikomos identiš-komis, apima: prepro- mpl ligandą, pzo- mpl ligandą ir subrendusi ^apl ligandą.
[0121] " Mpl ligando mikrosekvenavimas" gali būti atliktas bet kokiu tinkamu standartiniu metodu, jei šis metodas yra pakankamai jautrus. Vienas būdas yra, kai išgrynin-tas polipeptidas išskiriamas iš SDS PAGE gelio, ar analizuojama paskutinėje HPLC stadijoje baltymo frakcija ir tiesiogiai sekvenuojama automatizuotu Edmano būdu (fenilizocianatiniu), naudojant Applied Biosystems dujinį sekvenatorių kartu su 120A feniltiohidantioniniu (PTH) amino rūgščių analizatoriumi. Papildomai mpl ligando fragmentai buvo gaunami cheminiu (pvz., skaldant baltymą CNBr, hidroksilaminu, 2-nitro-5-tiocian-benzoatu) ar fermentiniu (pvz., skaldant tripsinu, klostripainu, stafilokokine proteinaze) būdais, po skaldymo fragmentai yra frakcionuojami (pvz. HPLC) ir panašiu būdu sekvenuojami. PTH amino rūgščių dariniai yra analizuojami naudojant ChromPerfect duomenų apdorojimo sistemą (Justice Innovation, Palo Alto, CA). Sekų analizė atliekama kompiuteriu VAX 11/785 Digital Eąuipment Co. kaip aprašyta Henzel et ai., J. Chomato-graphy, 404:41-52 [1987]. Papildomai HPLC frakcijos gali būti elektroforezuojamos 5-20 % SDS PAGE, perne-šamos į PVDF memraną (ProBlott, AIB, Foster City, CA) ir dažomos Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987]). Specifiškai identifikuotos dažu baltymų zonos išpjaunamos ir baltymų N galo seka nustatoma dujiniu sekvenatoriumi, kaip apra-šyta aukščiau. Nustatant vidines baltymų sritis, HPLC frakcijos liofilizuojamos (SpeedVac), suspenduojamos tinkamame buferiniame tirpale, skaldoma cianbromidu, Lys-specifine proteinaze Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA), ar Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis,
[0122] IN) . Po skaldymo gauti peptidai sekvenuojami mišinyje ar po frakcionavimo HPLC C4 chromatografinėj e kolonė-lėje, naudojant propanolio gradientą su 0,1 % TFA.
[0123] "Trombocitopenija" apibrėžiama kaip trombocitų kiekio sumažėjimas iki ar žemiau 150xl09 trombocitų litre kraujo.
[0124] "Trombopoetinis aktyvumas" yra biologinis aktyvumas, pasireiškiantis kaip megakariocitų ar megakario-citų pirmtakų proliferacijos, diferenciacijos ir/arba brendimo skatinimas. Šioms ląstelėms tampant trombocitus produkuojančia forma šis aktyvumas gali būti įver-tintas įvairiais metodais, tarp jų in vivo pelių cirku-liuojančių trombocitų inhibicijos metodu, trombocitų paviršinio antigeno indukcijos metodu, kuris yra anti-trombocitų imuninis metodas (anti-GPIIbIIIa), taikomas žmogaus leukemijos megakariocitų linijai (CMK), o taip pat megakarioblastų ląstelių linijos (DAMI) poliploidizacijos proceso indukcijos metodu.
[0125] "Trombopoetinas" (TPO) apibrėžiamas kaip junginys, turintis trombopoetinį aktyvumą arba sugebantis padidinti trombocitų kiekį žinduolių kraujyje. TPO gali padidinti endogeninį trombocitų kiekį 10%, geriau - 50 %, geriausiai - pakelti trombocitų skaičių žmogaus kraujyje iki 150xl09 trombocitų litre ar daugiau.
[0126] "Išskirta mpl ligando nukleino rūgštis" yra RNR arba DNR, turinti ne mažiau 16, o geriau 20 arba daugiau nukleotidų seką, koduojančią biologiškai aktyvų mpl ligandą ar jo fragmentą; yra komplementari tokiai RNR ar DNR, arba hibridizuo j asi su ja ir išlieka stabiliai prisijungusi esant vidutinėms arba griežtom hibridizacijos sąlygom. Šie RNR ir DNR preparatai neturi nei vieno iš šaltinio nukleino rūgščių priemaišų, su kuriomis jie paprastai yra asocijuoti gamtiniuose šaltiniuose, o taip pat šie preparatai praktiškai neturi kitų žinduolių DNR ar RNR. Frazė "neturi nei vieno
[0127] iš šaltinio nukleino rūgščių priemaišų, su kuriais jie yra paprastai asocijuoti" apima atvejus, kai nukleino rūgštis yra šaltinyje ar ląstelėje, bet yra kitos chro-mosominės lokalizacijos ar flankuojama tokiomis sekomis, kurios paprastai šaltinio ląstelėse neaptinkamos. Išskirtos mpl ligando nukleinio rūgšties pavyzdys yra RNR arba DNR, koduojanti biologiškai aktyvų mpl ligan-dą, kurio amino rūgščių liekanų seka yra identiška žmogaus, pelių ar kiaulės mpl ligando sekai bent 75 %, geriau - 80 %, dar geriau - 85 %, dar geriau - 90 % ir geriausiai - 95 %.
[0128] Terminas "kontrolinės sekos", kai jis susijęs su ekspresija, reiškia DNR sekas, būtinas funkcionaliai prijungtos koduojančios sekos ekspresijai tam tikrame šeimininko organizme. Kontrolonės sekos, tinkančios prokariotams, pvz., apima promotoriaus ir operatoriaus sekas, ribosomų prisijungimo vietą ir, gal būt, kitas sekas, kurių vaidmuo nėra išaiškintas. Žinoma, kad eukariotinės ląstelės naudoja promotorius, poliadenilinimo signalus ir stiprintojus.
[0129] Terminas "funkcionaliai prijungta", kai jis naudojamas nukleino rūgštims, reiškia, kad nukleino rūgštis sujungta su kita nukleino rūgšties seka, su kuria ją sieja funkcionalūs ryšiai. Pavyzdžiui, sekretorinio lyderio DNR funkcionaliai sujungta su polipeptido DNR; tokiu atveju šis polipeptidas ekspresuoj amas kaip pre-baltymas, kuris dalyvauja polipeptido sekrecijoje; promotorius ir sustiprintojas funkcionaliai prijungti prie koduojančios sekos ir reguliuoja šios sekos trans-kripciją; ribosomų prisijungimo vieta, funkcionaliai prijungta prie koduojančios sekos, palengvina translia-ciją. Paprastai "funkcionalus prijungimas" įgyvendina-mas tiesiogiai sujungiant kontrolinę ir koduojančią sekas, o lyderinės sekos atveju šis prijungimas neturi pažeisti atviro skaitymo rėmelio. Tai nebūtina sustip-rintojams. Prijungimas įvykdomas ligavimu tam tikrose restriktazių skėlimo vietose. Jei tokių vietų nėra, naudojami sintetiniai oligonukleotidinai adapteriai arba jungikliai (linkeriai), kaip įprasta klonavimo praktikoje.
[0130] "Egzogeninis" elementas yra nukleino rūgšties seka, svetima ląstelei arba homologiška ląstelei, bet esanti tokioje pozicijoje, kokioje šis elementas ląste-lės-šeimininkės nukleino rūgštyje paprastai neaptin-kamas .
[0131] Terminai "ląstelė", "ląstelių linija" ir "ląstelių kultūra" naudojami kaip sinonimai ir apima visas ląste-les arba ląstelių linijos palikuonys. Pvz., toks termi-minas kaip "transformantai" arba "transformuotos ląste-lės" apima pirminę transformuotą ląstelę ir iš jos iš-augintą kultūrą, nepriklausomai nuo peršėjimų skai-čiaus. Suprantama, kad ne visų palikuonių DNR griežtai identiška, nes ląstelėse vyksta tikslinės arba atsi-tiktinės mutacijos. Tie palikuonys, kuriuose mutacijos nepažeidė norimos funkcijos bei biologinio aktyvumo, ir toliau priskiriami prie transformantų. Iš konteksto pa-aiškės atvejai, kai tokie mutantai specialiai vadinami kitaip, nei pradinis transformantas.
[0132] "Plazmidės" - autonomiškai besireplikuojančios žiedinės DNR molekulės, turinčios nepriklausomą replikacijos iniciacijos vietą; tekste žymimos arba mažąja "p" raide prieš pavadinimą, arba didžiosiomis raidėmis ir/arba numeriais po pavadinimo. Pradinės plazmidės, naudojamos šiame išradime, yra arba perkamos, arba laisvai prieinamos, arba gali būti sukonstruotos minėtų plazmidžių pagrindu, naudojant publikuotus metodus. Kitos ekvivalentiškos plazmidės gerai žinomos ir prieinamos eiliniam šios srities specialistui.
[0133] "Skaldymas restrikcijos fermentais" - kai kalbama apie DNR, reiškia katalitinį vidinių DNR fosfodieste-rinių jungčių skaldymą, naudojant fermentą, kuris veikia tik tam tikrose DNR sekos vietose. Tokie fermentai
[0134] vadinami "restrikcijos endonukleazėmis". Kiekviena restrikcijos endonukleazė atpažįsta specifinę DNR seką, vadinama "restrikcijos vieta", kuri pasižymi antrine simetrija. Skirtingi restrikcijos fermentai, naudojami šiame išradime, yra komerciniai reagentai;reakcijos są-lygos bei kofaktoriai visiškai atitinka fermentų gamin-tojų rekomendacijas. Viešai priimta, kad restrikcijos fermentų pavadinimus sudaro sutrumpintas mikroorganizmo, iš kurio šis fermentas buvo pirmą kartą išskirtas, pavadinimas ir skaičius , žymintis patį fermentą. Paprastai lųg plazmidės arba DNR fragmento suskaldymui naudojami 1-2 vienetai fermento ir apie 20 ųl buferinio tirpalo. Optimalius buferių ir substrato kiekius kiekvienam restrikcijos fermentui nurodo gamintojas. Daž-niausiai reakcija vyksta apie 1 valandą 37°C temperatū-roje, tačiau šitos sąlygos gali skirtis, jeigu tai nurodyta gamintojo specifikacijoje. Po inkubacijos baltymas arba polipeptidas pašalinamas ekstrahuojant fenoliu ir chloroformu, o suskaldyta DNR išskiriama iš vandens fazės išsodinant etilo alkoholiu. Po skaldymo gali būti atliekama 5' galo fosfatinių grupių hidro-lizė, naudojant bakterinę šarminę fosfatazę; tai daroma, kad būtų išvengta DNR fragmentų galų susijungimo, t. y. žiedinės struktūros formavimosi, nes į tokios struktūros restrikcijos vietą nebus galima įterpti kito DNR fragmento. Jeigu tai nėra specialiai pažymėta, 5' galų defosforilinimas po plazmidės suskaldymo nebuvo taikomas. Defosforilinimo procedūra ir jai reikalingi reagentai aprašyti Sambrook, et al. knygos "Molecular cloning" [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 1.56-1.61 skyriuose.
[0135] Tam tikro DNR fragmento "išskyrimas" ar "izolia-cija" iš restrikcijos produktų apima: fragmentų mišinio frakcionavimą elektroforezės būdu poliakrilamidiniame ar agaroziniame gelyje; reikiamo fragmento identifika-vimą pagal jo judrumą elektroforezėj e (palyginama su žinomo molekulinio svorio markerinių DNR fragmentų judrumu); gelio gabaliuko, kuriame yra norimas fragmentas, išpjovimą; gelio ir DNR atskirimą. Ši procedūra yra gerai žinoma(žiūr. Lawn et al., Nucleic Acids Res. r 9:6103-6114 [1981], ir Goeddel et al., Nucleic Acids Res. r8:4057 [1980]).
[0136] "Southern analizė" arba "Southern blotingas" metodas, kurio pagalba nustatomas vienos ar kitos DNR sekos buvimas tiek mišinyje, kuriame yra DNR, tiek ir restrikcijos endonukleazėmis suskaldytoje DNR, hibri-dizuojant su žinomu žymėtu oligonukleotidu arba DNR fragmentu. Southern analizė paprastai apima elektro-foretinį DNR frakcionavimą agaroziniame gelyje, frak-cionuotos DNR denatūraciją ir pernešimą ant nitroceliu-liozinės, nailoninės ar kitos tinkamos membranos ir tolesnę analizę su DNR pavyzdžiu, žymėtu radioaktyvia žyme, biotinu ar fermentu (žiūr. Sambrook et al., supra, skirsniai 9.37-9.52).
[0137] "Northern analizė" arba "Northern blotingas" metodas, kurio pagalba identifikuojamos RNR sekos, besihibridizuojančios su žinomu pavyzdžiu, tokiu kaip oligonukleotidas, DNR fragmentas, kDNR ar jos fragmentas, arba RNR fragmentas. Tokie pavyzdžiai žymimi radioaktyviu izotopu (32P), arba biotinu, arba fermentu. Analizuojama RNR paprastai elektroforetiškai frak-cionuojama agaroziniame arba poliakrilamidiniame gelyje, pernešama ant nitroceliuliozinės, nailoninės ar kitos tinkamos membranos ir hibridizuojama su pavyz-džiu, naudojant standartines procedūras, gerai žinomas šios srities specialistams (žiūr. Sambrook et al., supra, skirsniai 1. 39- 1. 52).
[0138] "Ligavimas" - procesas, kuris formuoja fosfodi-esterinius ryšius tarp dviejų nukleino rūgšties fragmentų. Tam, kad ligavimas galėtų įvykti, fragmentų galai turi vienas kitą atitikti. Kai kuriais atvejais tinkami galai susidaro iš karto po skaldymo endonuklea-
[0139] zėmis. Tačiau dažnai po restrikcijos pirmiausia reikia bukus galus paversti lipniais - tinkamais ligavimui. Tam tikslui, DNR mažiausiai 15 min. inkubuojama 15°C temperatūroje tinkamame buferyje, turinčiame apie 10 vienetų DNR polimerazės I Klenow fragmento arba fago T4 DNR polimerazės ir visus keturis dezoksiribonukleotid-trifosfatus. Po šitos procedūros DNR išgryninama, ekstrahuojant fenolio-chloroformo mišiniu ir išsodinant etilo alkoholiu. DNR fragmentai, kurie turi būti "su-siūti", sumaišomi tam tikrame tirpale ekvimoliariniu santykiu. Į šio tirpalo sudėtį įeina ATP, ligazės buferinis tipalas ir ligazė, pvz.: T4 DNR ligazė, apie 10 vienetų/0,5 pg DNR. Jeigu DNR turi būti įsiūta į vektorių, tai pastarasis pirmiausia suskaldomas tinkama restrikcijos endonukleaze, tam kad vektorius būtų per-vestas iš žiedinės į linijinę formą. Linearizuotas fragmentas toliau veikiamas bakterine ar kitos kilmės šarmine fosfataze, tam, kad ligavimo metu vektoriaus galai vėl nesusijungtų, sudarydami žiedinę molekulę.
[0140] DNR "išskyrimas" iš ląstelių reiškia plazmidės DNR išskyrimą iš ląstelių-šeimininkų kultūros. Dažniausiai taikomi didelių ir mažų DNR kiekių išskyrimo metodai aprašyti (žiūr. Sambrook et al., supra, skirsniai 1.25-1.33). Po DNR išskyrimo ji gali būti toliau išgryninta, naudojant gerai žinomus metodus (žiūr. Sambrook et ai., supra, skirsnis 1.40).
[0141] "Oligonukleotidai" - trumpi, viengrandžiai ar dvi-grandžiai polidezoksinukleotidai, susintetinti cheminės sintezės būdu per dezoksinukleozid-H-fosfonatinius tarpinius junginius (Froehler et al., Nucl. Acids Res. , 14: 5399-5407 [1986]), arba naudojant tokius žinomus metodus kaip fosfotriesterinis, fosfitinis ar fosfor-amiditinis metodas kietoje fazėje (aprašyti EP 266032 publikuotame 1988.05.04). Kiti metodai apima polimera-zinę grandininę reakciją, apibrėžtą žemiau, ir kitus autopradmeninius metodus, o taip pat oligonukleotidų
[0142] sintezę ant kieto nešiklio. Visi šie metodai aprašyti (Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engi., 28:716-734
[0143] [1989]). Šie metodai taikomi tais atvejais , kai žinoma visa geno nukleino rūgšties seka arba seka, komplementari koduojančiai grandinei. Kita vertus, jeigu žinoma taikinio amino rūgščių liekanų seka, nukleino rūgšties seka gali būti išvesta žinant dažniausiai pasitaikan-čius amino rūgštis koduojančius trinukeotidus. Po sin-tezės oligonukleotidai išgryninami elektroforetiškai poliakrilamidiniame gelyje."Polimerazinė grandininė reakcija" arba "PCR" - metodas, kurio pagalba padauginami labai maži specifi-nių nukleino rūgšties, RNR ir/arba DNR fragmentų kiekiai (žiūr.JAV patentas Nr.4,683,195, išleistas 1987.07.28). Taikant šį metodą, reikia žinoti norimo padauginti fragmento galines sekas tam, kad būtų galima susintetinti pradmenis; šie pradmenys turi būti iden-tiški arba labai panašūs į sekas komplementarias daugi-namai matricai. 5'galiniai pradmenų nukleotidai gali sutapti su dauginamo fragmento galais. PCR galima panaudoti dauginant specifines RNR sekas, specifines DNR sekas iš totalinės genominės DNR, kDNR, transkribuotos nuo totalinės ląstelės RNR, taip pat bakteriofago bei plazmidžių sekas ir t.t.(žiūr. Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 [1987]; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)). PCR yra vienas, bet ne vienintelis nukleino rūgščių poli-merazinės reakcijos metodas, pritaikytas nukleino rūgš-ties pavyzdžio dauginimui, naudojant žinomas nukleino rūgštis kaip pradmenis ir polimerazinę reakciją kaip būdą padauginti arba sukurti specifinį nukleininės rūgšties fragmentą."Griežtos sąlygos" - tokios sąlygos, kurioms esant (1) pl ovimams taikomi mažos joninės jėgos ir aukštos temperatūros tirpalai, pvz.: 0,015M NaCl/0', 0015M natrio citratas/0,1% NaDodS04 (SDS) ir 50°C temperatūra; (2) hibridizacijos metu naudojami denatūruojantis agentai, tokie kaip formamidas, pvz.: 50 % (tūris/tūryje) formamidas su 0,1% galvijų serumo albuminu/ 0,1% fiko-lis/0,1% polivinilpirolidonas/50 mM natrio fosfatinis buferis tirpalas (pH 6,5) su 750 mM NaCl, 75 mM natrio citrato ir 42°C temperatūra. Kitame pavyzdyje hibridizacija vykdoma tokiame tirpale: 50 % formamido, 5xSSC (0,75mM NaCl, 0,075M natrio citratas), 50 mM natrio fosfatas (pH 6,8), 0,1% natrio pirofosfatas, 5xDenhar-dto tirpalas, ultragarsu apdorota lašišos spermos DNR (50 }ig/ml), 0,1 % SDS ir 10 % dekstransulfatas; hibridizacija vyksta 42°C temperatūroje, praplovimus atliekant 42°C temperatūroje 0,2xSSC su 0,1% SDS."Vidutiniškai griežtos" sąlygos aprašytos Sambrook et al., supra, kuriose praplovimo bei hibridizacijos sąlygos (temperatūra, joninė jėga ir SDS koncentracija) ne tokios griežtos, kaip aprašyta aukščiau. Vidutiniš-kai griežtų sąlygų pavyzdys pateikiamas žemiau: inkuba-cija pernakt 37°C temperatūroje; į hibridizacijos tirpalo sudėtį ieina 20 % formamidas, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM trinatrio citratas), 50 mM natrio fosfatas (pH 7,6), 5x Denharto tirpalas, 10 % dekstransulfatas ir 20 jil/ml denatūruotos fragmentuotos lašišos spermos DNR; membrana atplaunama lxSSC tirpalu esant 37-50°C temperatūrai. Patyręs specialistas mokės parinkti tinkamas sąlygas kiekvienam konkrečiam atvejui."Antikūnai" (Abs) ir "imunoglobulinai" (Igs) glikoproteinai, turintys vienodas struktūrines charak-teristikas. Antikūnams būdinga specifinė sąveika su tam tikru antigenu, o imunoglobulinai apima ir antikūnus, ir panašios struktūros molekules, nepasižyminčias tokia specifine sąveika. Pastarojo tipo polipeptidus produkuoja mažais kiekiais limfoidinė sistema, o dideliais - mielomos. " Natyvūs antikūnai ir imunoglobulinai" - apie 150 kD molekulinės masės heterotetrameriniai glikoproteinai, susidedantys iš dviejų identiškų lengvųjų ( L) ir dviejų identiškų sunkiųjų ( H) grandinių. Lengvoji ir sunkioji grandinės tarpusavy sujungtos viena kovalentine disulfidine jungtimi, tuo tarpu disulfidi-nių jungčių kiekis tarp sunkiųjų grandinių skiriasi, priklausomai nuo imunoglobulino izotipo. Kiekvienoje sunkiojoje bei lengvojoje grandinėje yra taip pat regu-liariai išdėstyti vidugrandininiai disulfidiniai til-tai. Viename sunkiosios grandinės gale yra variabilus domenas ( VH) , po kurio seka keli pastovieji domenai. Kiekviena lengvoji grandinė viename gale turi variabilų domeną ( VL) , o kitame - pastovųjį ( CL) domeną; pastovusis lengvosios grandinės domenas yra ties pirmuoju pastovaus sunkiosios grandinės domenu, o variabilus lengvosios grandinės domenas yra asocijuotas su varia-biliu sunkiosios grandinės domenu. Žinoma, kad tam tikrose pozicijose esančios amino rūgščių liekanos formuoja lengvosios ir sunkiosios grandinių variabilių domenų tarpą ( Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651- 663 [ 1985] ; Novotny and Haber, Proc. Natl. Sci. USA, 82:4592- 4596 [ 1985] .
[0144] Terminas "variabilus" atspindi tą faktą, kad tam tikrų variabilių domenų dalinių amino rūgščių liekanų sekos yra labai skirtingos ir, būtent, šios dalys dalyvauja formuojant sąveikos su antigenu centrą ir aps-prendžia specifinę antigeno ir antikūno sąveiką. Tačiau sekos variabilumas netolygiai paskirstytas variabiliame domene. Tiek lengvosios, tiek sunkiosios grandinių variabilių domenų skirtumai sukoncentruoti trijuose segmentuose, vadinamuose komplementarumą apsprendžian-čiais regionais (CDRS) arba hipervariabiliais regionais. Labiausiai konservatyvios variabilių domenų dalys vadinamos karkasais (Framework, FR) . Natyvių lengvųjų ir sunkiųjų grandinių variabilus domenai turi keturis FR, turinčius p- klosčių struktūrą, ir sujungtus i kilpą trimis CDRS, kai kuriais atvejais sudarančiais p- klos-čių struktūrų dalį. Kiekvienoje grandinėje CDRS išsi-laiko šalia vienas kito erdvinėje struktūroje FR regio-nų dėka ir kartu su kitos grandinės CDRS regionais sudaro antikūno sąveikos su antigenu centrą ( žiūr. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Inte-rest, National Institute of Health, Bethesda, MD [ 1987]). Pastovieji domenai tiesiogiai nedalyvauja sąveikoje su antigenu, tačiau jie atlieka įvairias efektorines funkcijas, pvz. : apsprendžia antikūnų dalyvavimą nuo antikūnų priklausančioje ląstelių toksiškumo reakcijoje.
[0145] Antikūną suskaldžius papainu, susidaro du iden-tiški antigeną rišantys fragmentai, vadinami " Fab" fragmentais, kurie turi po vieną sąveikos su antigenu centrą, ir " Fc" fragmentas, kurio pavadinimas kilo iš jo savybės lengvai kristalizuotis. Suskaldžius antikūną pepsinu susidaro F( ab') 2 fragmentas, kuris turi 2 są-veikos su antigenu centrus ir todėl gali sujungti dvi antigeno molekules." Fv" yra pats mažiausias antikūno fragmentas, turintis pilną antigeno atpažinimo ir surišimo vietą. Šis fragmentas yra sunkiosios ir lengvosios grandinių variabilių domenų dimeras, išlaikomas stipria nekova-lentine sąveika. Būtent šioje konfigūracijoje , kurioje sąveikauja po tris kiekvieno variabilaus domeno CDRS regionus, susidaro antigeną rišanti vieta VH- VL dimero paviršiuje. 6 CDRS kolektyviai apsprendžia antikūno specifiškumą. Tačiau net ir vienas variabilus domenas ( arba pusė Fv, kuris sudarytas tik iš trijų CDRS) gali atpažinti ir surišti antigeną, nors ir su mažesniu afiniškumu, nei pilnas surišimo centras.Į Fab fragmento sudėtį įeina lengvosios grandinės pastovusis domenas ir pirmasis pastovusis ( CH1) sunkiosios grandinės domenas. Fab' fragmentas skiriasi nuo Fab fragmento tuo, kad prie sunkiosios grandinės CH1 domeno karboksilinio galo yra keletas papildomų amino rūgščių liekanų, tarp jų viena ar daugiau cisteino lie-kanų iš antikūno talijos regiono. Fab', turintys cisteino liekanų su laisva tioline grupe, vadinami Fab'-SH. Antikūnų F(ab') 2 fragmentai gaminami kaip Fab' fragmen-tų poros, sujungtos talijos regiono cisteinais. Taip pat žinomi ir kiti cheminiai antikūnų fragmentų sujungimo būdai.
[0146] Pagal pastovaus domeno amino rūgščių liekanų seką visų stuburinių gyvūnų antikūnų (imunoglobulinų) "lengvosios grandinės" skirstomos į du aiškiai skirtingus tipus, vadinamus kapa ( k) ir lambda ( X ) .
[0147] Priklausomai nuo sunkiosios grandinės pastoviųjų domenų amino rūgščių liekanų sekos, imunoglobulinai skirstomi į kelias klases. Yra 5 pagrindinės imunoglo-bulinų klasės: IgA, IgD, IgE, IgG ir IgM, ir kai kurios iš jų toliau skirstomos į poklasius (izotipus), pvz. : IgGl, IgG2, IgG3, IgG4; IgAl ir IgA2. Sunkiųjų grandi-nių pastoviuosius domenus, atitinkančius šias pagrindines klases, žymime a, 8, e, y ir ji, atitinkamai. Įvai-rių klasių imunoglobulinų subvienetų struktūra ir erd-vinė konfigūracija gerai žinomos.
[0148] Terminas "antikūnas" labai plačiai naudojamas ir taikomas tiek monokloniniams antikūnams (tarp jų ago-nistiniams ir antagonistiniams), tiek ir antikūnų miši-niams su poliepitopiniu specifiškumu bei antikūnų fragmentams (pvz.: Fab, F(ab') 2 ir Fv) , jei pastarieji išlaiko norimą biologinį aktyvumą.
[0149] Terminas "monokloniniai antikūnai" čia naudojamas aprašant antikūnus, gautus iš praktiškai homogeniškos antikūnų populiacijos, kurioje individualios antikūnų molekulės yra visiškai identiškos, išskyrus nedidelius kiekius natūraliu būdu atsirandančias mutantines molekules. Monokloniniai antikūnai yra labai specifiški ir reaguoja tik su viena antigenine determinante. Skirtingai nuo tradicinių (polikloninių) antikūnų preparatų, kuriuos sudaro skirtingi antikūnai prieš skirtingas antigenines determinantes (epitopus), kiekvienas monokloninis antikūnas reaguoja tik su viena antigeno determinante. Be didelio specifiškumo kitas monokloni-nių antikūnų privalumas yra tas, kad jie gaminami hibridominių ląstelių kultūroje ir todėl neužteršti kitais imunoglobulinais. Būdvardis "monokloninis" nurodo, kad antikūnas išskirtas iš praktiškai homo-geninės antikūnų populiacijos ir neapsiriboja vienu konkrečiu antikūnų gavimo būdų. Pvz.: monokloniniai antikūnai , naudojami šiame išradime, gali būti pagaminti tiek hibridominių metodu pagal Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975), tiek genoinžinie-riniu metodu (žiūr. pvz., JAV patentą Nr. 4816567 [Cabilly etai.]).Šiame išradime minimi monokloniniai antikūnai apima "chimerinius" antikūnus (imunoglobulinus), kuriuose dalis sunkiosios ir /arba lengvosios grandinės identiška ar homologiška atitinkamoms sekoms tų anti-kūnų, kurie išskirti iš vienos gyvūnų rūšies arba priklausantys vienai antikūnų klasei ar poklasiui, tuo tarpu kita grandinės (grandinių) dalis identiška ar homologiška sekoms tų antikūnų, kurie išskirti iš kitos gyvūnų rūšies arba priklausantys kitai antikūnų klasei ar poklasiui; čia taip pat įeina ir tokių chimerinių molekulių fragmentai, jeigu jie turi norimą biologinį aktyvumą (JAV patentas Nr. 4816567 (Cabilly et al.); Morrison et alProc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984])."Humanizuoti" ne žmogaus kilmės antikūnai (pvz . : pelių) tai yra chimeriniai imunoglobulinai, arba jų grandinės, arba jų fragmentai (tokie kaip Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 arba kitokios antigeną rišančios sekos, gautos iš antikūnų), kuriuose ne žmogaus kilmės sekų kiekis yra sumažintas iki minimumo. Daugeliu atvejų humanizuoti antikūnai yra žmogaus imunoglobulinai (recipientinis antikūnas), kuriuose komplementarumą apsprendžiančių regionų (CDR) liekanos yra pakeistos CDR liekanomis iš ne žmogaus kilmės, pvz.:pelės, triu-šio ar žiurkės, turinčių norimą specifiškumą ir afiniš-kumą, donorinių antikūnų. Kai kuriais atvejais žmogaus imunoglobulino Fv karkasinės amino rūgščių liekanos gali būti pakeistos atitinkamomis ne žmogaus kilmės sekų liekanomis. Dar daugiau, humanizuotuose antikūnuo-se gali būti amino rūgščių liekanų, kurių nėra nei re-cipientinėse, nei donorinėse CDR ar karkasinėse sekose. Tai daroma tam, kad būtų pagerintas ir optimizuotas antikūnių aktyvumas. Humanizuoti antikūnai susidaro mažiausiai iš vieno ar, dažniausiai, iš dviejų variabi-lių domenų, kuriuose visos arba beveik visos CDR liekanos yra ne žmogaus kilmės, o visos ar beveik visos FR liekanos yra žmogaus. Humanizuotuose antikūnuose taip pat yra bent dalis pastovaus regiono (Fc), paprastai tai žmogaus imunoglobulino regiono dalis. Smulkesnius aprašymus galima rasti (Jonės et al., Nature, 321:522-525 [1986]; Reichmann et al., Nature, 332:323-329
[0150] [1988]; Presta, Curr. Op. Biol., 2:593-596 [1992]).
[0151] "Neimunogeniškas žmogui" reiškia, kad vaistinė polipeptido forma, esant jos atitinkamai terapinei dozei, kontaktuodama su atitinkamais žmogaus audiniais, nesukelia jokios jautrumo ar atsparumo polipeptidui būklės, kuri pasireikštų vartojant polipeptidą antrą kartą, praėjus atitinkamam latentiniam periodui (pvz.: po 8-14 dienų).
[0152] Šiame išradime aprašyti polipeptidai yra praktiš-kai homogeniškas polipeptidas(polipeptidai), vadinamas mpl ligandu(ligandais) arba trombopoetinu (TPO), kuris
[0153] gali jungtis su mpl, citokinų receptorių superšeimos nariu, ir turi biologinę savybę stimuliuoti žymėtų nukleotidų (3H-timidino) įsijungimą į IL-3 priklausomų Ba/F3 ląstelių, transformuotų žmogaus mpl P genu, DNR. Šiame išradime aprašytas mpl ligandas(ligandai) - tai išskirtas žinduolių baltymas(baltymai), turintis hemo-poetinį, ypač megakariocitopoetinį ar trombopoetinį, aktyvumą - būtent, sugebantis stimuliuoti nesubrendusių megakariocitų ar jų pirmtakų proliferaciją, brendimą ir/arba diferenciaciją į subrendusius trombocitus produkuojančią formą. Konkrečiai šiame išradime aprašy-ti polipeptidaitai žmogaus mpl ligandas (ligandai), arba jo fragmentai, turintys hemopoetinį, megakario-citopoetinį ar trombopoetinį aktyvumą. Šie žmogaus mpl ligandai nebūtinai glikozilinti. Kiti pateikiami žmo-gaus mpl ligandai yra hML "EPO-domenas", vadinamas hML153 arba hTPOi53 , sutrumpinta hML forma, vadinama hML245 arba I1TPO245, ir pilno ilgio subrendęs polipeptidas, turintis Fig. 1 (SEQ ID Nr.: 1) parodytą amino rūgščių liekanų seką, vadinamas hML, hML332 arba TP0332, o taip pat biologiškai aktyvus šio polipeptido variantas su pakeistomis amino rūgščių liekanomis hML(R153A, R154A).
[0154] Taip pat šiame išradime aprašyti polipeptidai - biologiškai arba imunologiškai aktyvūs mpl ligando variantai, atrinkti iš hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML ir pML2.
[0155] Taip pat pateikiami šiame išradime polipeptidai - biologiškai aktyvūs mpl ligando variantai, kurių amino rūgščių liekanų sekos mažiausiai 70% identiškos žmogaus mpl ligando sekai (žiūr. Fig. 1 [SEQ ID Nr.:1]), pelės mpl ligando sekai (žiūr. Fig. 16 [SEQ ID Nr.:12 ir 13]), kiaulės rekombinantinio mpl ligando sekai (žiūr. Fig. 19 [SEQ ID Nr.:18]) arba kiaulės mpl ligando, išskirto iš aplastinės kiaulės plazmos, sekai. Pateikiamas identiškumas siekia mažiausiai 75%, o geriausia, jeigu jis siekia 95 % ir daugiau.
[0156] mpl ligandas, išskirtas iš aplastinių kiaulių plazmos, charakterizuojamas taip: (1) Dalinai išgrynintas ligandas eliujuojamas iš gelfiltracinės kolonėlės, atliekant chromatografiją PBS, PBS su 0,1 % SDS ar PBS su 4 M MgCl2, 60-70 kD molekulinių masių srityje.
[0157] (3) Ligandas yra stabilus esant žemam pH (2,5), esant 0,1 % SDS ir 2 M karbamido; (4) Ligandas yra glikoproteinas, nes jis yra sorbuojamas įvairiais lecitino sorbentais; (5) Išgryninto ligando eliuatai iš SDS PAGE gelio, analizę atlikus neredukuojančiomis sąlygomis, yra 25-25 kD molekulinių masių zonoje. Mažesni jo kiekiai aptinkami -18-22 ir 60 kD zonose; (6) Išgrynintas ligandas SDS PAGE analizėje redu-kuojančiomis sąlygomis išsiskiria į dvi juostas - 28 ir 31 kD; (7) Ligando formų, išskirtų iš 18-22, 28 ir 31 KD zonų, N galo amino rūgščių liekanų sekos yra tos pačios -
[0158] (8) Ligandas yra sorbuojamas ir desorbuoj amas nuo šių sorbentų:
[0159] Phenyl 650m Toyopearl ir
[0160] Labiau tinkami mpl ligando polipeptidai yra tie, kurie koduojami žmogaus genomine ar kDNR, kurių amino rūgščių liekanų seka yra pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr . : 1) .
[0161] Kiti gamtiniai biologiškai aktyvūs mpl ligando polipeptidai - šio išradimo objektai - yra prepro- mpl ligandas, pro- mpl ligandas, subrendęs mpl ligandas, mpl ligando fragmentai ir glikozilinti variantai.
[0162] Kiti šiame išradime aprašyti polipeptidai apima mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantus ir chimeras. Kaip įprasta, priimtinais laikomi tie biolo-giškai aktyvūs mpl ligando variantai ir chimeros, kurių amino rūgščių liekanų sekų homologiškūmas žmogaus mpl ligandui ar mpl ligandui, išskirtam iš aplastinių kiau-lių, yra ne mažesnis nei 70 %, geriau, kai homologija yra bent 75 %, dar geriau, kai - bent 80 %, dar geriau, kai - bent 85 %, dar geriau, kai - bent 90 % ir geriausia, kai nemažiau 95 %. Vienas pavyzdinių mpl ligando variantų yra hML N galo domenas (vadinamas "EPO-domenu" dėl amino rūgščių liekanų sekos homologijos su eritropoetinu). Geriausią hML EPO domeną sudaro apie 153 pirmųjų amino rūgščių liekanų iš subrendusio hML ir todėl jis vadinamas hMLi.53. Dar geresnis hML amino rūgš-čių liekanų sekos variantas yra tas, kuriame viena ar kelios bazinės arba dviejų bazinių amino rūgščių lieka-nų poros, esančios C galo domene, pakeistos į nebazines amino rūgščių liekanas (pvz., į hidrofobines, neutra-lias, rūgščias, aromatines, Gly, Pro ar panašias). Geriausia hML C galo domeno seka yra tokia, kur 153 ir 154 Arg liekanos pakeistos Ala liekanomis. Šis variantas vadinamas I1ML332 (R153A, R154A) . Kiti geriausi hML variantai yra arba hML332 , arba hMLi53, kuriuose amino rūgščių liekanos nuo 111 iki 114 (QLPP arba LPPQ) yra pašalintos arba pakeistos kitais tetrapeptidais (pvz., AGAG ar panašiais). Šie deleciniai mutantai vadinami A4hML332 ir A4hMLi53.
[0163] Geriausia chimera yra baltymas, kur mpl ligandas arba jo fragmentas (apibrėžtas žemiau) sulietas su heterologiniu polipeptidu arba jo fragmentu. Pavyz-džiui, hMLis3 gali būti suliejamas su IgG fragmentu, siekiant prailginti preparato cirkuliacijos kraujyje laiką, arba su IL-3, G-CSF ar EPO, siekiant gauti molekulę su didesniu trombopoetiniu aktyvumu ar su chimerinių komponentų aktyvumu.
[0164] Kita geriausia žmogaus mpl ligando chimera yra "ML-EPO domeno chimera", kuri sudaryta iš 153-157 N gale esančių hML amino rūgščių liekanų, kur viena ar kelios, bet ne visos, liekanos pakeistos žmogaus EPO liekanomis, kaip parodyta Fig. 10 (SEQ ID Nr.:7). Šiame išradime hML chimera turi būti apie 153-166 amino rūgš-čių liekanų ilgio ir atskiros amino rūgščių liekanos ar individualūs liekanų blokai yra paimti iš žmogaus EPO sekos ir įterpti į hML baltymo seką, arba pakeista dalis hML sekos, vietose, kurios nurodytos Fig. 10 (SEQ ID Nr.:6). Tokių intarpinių sekų pavyzdžiai apima: vieną ar kelias N-glikozilinimo vietas, esančias EPO amino rūgščių liekanų sekoje pozicijose 24-27, 38-40 ir 83-85; vieną ar kelias iš keturių spėjamų amfipatinių a-spiralių sričių, esančių EPO amino rūgščių liekanų sekoje pozicijose 9-22, 59-76, 90-107 ir 132-152; taip pat kitas konservatyvias sritis, tarp jų EPO molekulės N ir C galų amino rūgščių liekanų sekas, bei liekanas, esančias pozicijoje (epo) 44-52 (žiūr., pvz., Wen et al., Blood, 82:1507-1516 [1993] ir Boissel et al. , J. Biol. Chem., 268(21): 15983-15993 [1993]). Tikimasi, kad ši "ML-EPO domenų chimera" turės mišrų trorabopoe-tinį-eritropoetinį (TEPO) biologinį aktyvumą.
[0165] Kiti šio išradimo polipeptidai apima mpl ligando fragmentus, turinčius nepertraukiamas bent 10, 15, 20, 25, 30 ar 40 amino rūgščių liekanų sekas, identiškas mpl ligando, išskirto iš aplastinių kiaulių plazmos arba čia aprašyto žmogaus mpl ligando ( žiūr. Lente-lę 14, Pavyzdį 24) amino rūgščių liekanų sekoms. Geriausias mpl ligando fragmentas yra žmogaus ML[ 1- X], kur X yra 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 ar 245 ( žiūr. Fig. 1 [ SEQ ID Nr. :l]). Kiti geriausi mpl ligando fragmentai yra tie fragmentai, kurie gauti che-minės ar fermentinės hidrolizės būdu iš išgryninto ligando.
[0166] Kitas išradimo aspektas yra mpl ligando molekulių išgryninimo būdas, kuris apima: mpl ligando šaltinio, turinčio mpl ligando molekulių, sąveiką su imobilizuotu receptoriaus polipeptidu, konkrečiai su mpl ar mpl hibridiniu polipeptidu, tokiomis sąlygomis, kai gryni-namos mpl ligando molekulės selektyviai sorbuojasi ant imobilizuoto receptoriaus polipeptido, sorbento praplo-vimą, pašalinant nesisorbavusius pašalinius baltymus, ir gryninamų molekulių eliuciją nuo imobilizuoto receptoriaus polipeptido eliucijos buferiniu tirpalu, mpl ligando šaltinis gali būti plazma, o geriausias imobi-lizuotas receptorius yra mpl- IgG sulietas polipeptidas.
[0167] Taip pat mpl ligando šaltinis gali būti rekombi-nantinė kultūra, kur mpl ligando koncentracija kultūri-niame skystyje arba ląstelių lizatuose yra žymiai di-desnė, nei plazmoje ar kituose gamtiniuose šaltiniuose. Todėl aukščiau aprašytas mpl- IgG imunoafininis būdas nebūtinai gali būti taikomas, nes gali būti pritaikomi kiti žinomi tradiciniai baltymų gryninimo metodai. Trumpai, geriausias gryninimo būdas, kurio metu gaunamas homogeniškas mpl ligandas, apima šeiminko ląste-lių nuolaužų ar lizavimo fragmentų pašalinimą, pavyz-džiui, centifūguojant ar ultrafiltruoj ant; po to baltymai gali būti sukoncentruojami komerciniais baltymų koncentravimui skirtais filtrais; toliau seka ligando atskyrimas nuo kitų pašalinių medžiagų viena ar kelio-mis stadijomis, pasirenkamomis iš: imunoafininės chromatografijos, jonų mainų chromatografijos (pvz., DEAE ar sorbentai su karboksimetil- ar sulfopropil- grupė-mis) , chromatografijos su Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether-Toyopearl, Butyl Toyopearl, Phenyl Toyopearl, protein-A Sepharose, pre-paratyvinės SDS-PAGE, atvirkščių fazių HPLC (pvz., silikagelis su alifatinėmis grupėmis) ar gelfiltracijos su Sephadex sorbentais, ir išsodinimo etanoliu ar išso-dinimo amonio sulfatu. Proteinazių inhibitorius - me-tilsulfonilfluoridas (PMSE) gali būti naudojamas bet kokioje gryninimo stadijoje, siekiant sumažinti proteo-lizę.
[0168] Kitas šio išradimo objektas yra išskirti antikū-nai, sugebantys jungtis su mpl ligandu. Geriausi anti-kūnai mpl ligandui išskirti yra monokloniniai (Kohler ir Milstein, Nature, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et al. , Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985]; ir Huse et al., Science, 246:1275-1281 [1989]). Geriausi mpl ligando išskyrimui antikūnai yra tie, kurie jungiasi su mpl ligandu ne mažesniu afiniškumu, nei 106 l/moliui. Dar geresni antikūnai, kurių afiniškumas didesnis, nei 107 l/moliui. Geriausia, kai atikūnai yra gaunami prieš mpl ligandą, turintį vieną iš aukščiau aprašytų efekto-rinių funkcijų. Antikūnai, sugebantys jungtis su mpl ligandu, gali būti sulieti su kitu polipeptidu, ir antikūnas ar sulietas baltymas gali būti naudojamas mpl ligando išskyrimui iš šaltinių, kaip aprašyta aukščiau, bei gryninimui. Kitas išradimo objektas yra būdas, kurio pagalba galima nustatyti mpl ligandą in vitro ir in vivo, apimantis antikūnų sąveiką su mėginiu, ypatingai su serumo pavyzdžiais, kuriuose tikimasi rasti ligandą ir susidariusio junginio detekciją, jei toks susidaro.
[0169] Kitas išradimo objektas yra išskirta nukleino rūgšties molekulė, koduojanti mpl ligandą ar jo frag-mentą. Ši nukleino rūgšties molekulė gali būti pažymėta arba nežymėta, ir nukleino rūgšties molekulės seka yra komplementari, galinti hibridizuotis, esant griežtoms arba vidutiniškai griežtoms sąlygomis, su nukleino rūgšties molekule, koduojančia mpl ligandą. Geriausia mpl ligando nukleino rūgštis yra RNR ar DNR, kuri turi bent 75 % homologijos su molekule, koduojančia biolo-giškai aktyvų mpl ligandą, dar geriau, kai homologija yra bent 80 %, dar geriau - 85 %, dar geriau - 90 % ir pats geriausias atvejis, kai homologija žmogaus mpl ligandui yra 95 %. Geriausia išskirta nukleino rūgšties molekulė yra DNR seka, koduojanti biologiškai aktyvų mpl ligandą, atrinkta iš: (a) DNR iš žinduolių mpl ligando geno regiono (pvz., DNR, kurioje yra nukleotidų seka, pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr.:2) ar jos fragmentai) ; (b) DNR, sugebančios hibridizuotis su (a) DNR, esant bent vidutiniškai griežtoms sąlygoms; ir (c) DNR, kuri yra išsigimusi lyginant su DNR apibrėžta (a) ar (b) . Manoma, kad nauji mpl ligandai, aprašyti šiame išradime, gali būti ligandų šeimos nariai ar citokinų šeimos nariai, turintys pakankamai identiškas sekas, kad jų DNR galėtų hibridizuotis su DNR, pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr.:2) (būtų komplementari ji pati arba jos fragmentai), esant nuo silpnų iki vidutiniškai griež-tų, sąlygoms. Taigi, kitas šio išradimo aspektas yra, DNR, kuri hibridizuojasi esant nuo silpnų iki viduti-niškai griežtų, sąlygoms su DNR, koduojančia mpl ligan-dų polipeptidus.
[0170] Kitas šio išradimo objektas yra nukleino rūgšties molekulė - kDNR, koduojanti mpl ligandą, ir joje esantis replikacijos vektorius, kuris kDNR funkcionaliai sujungia su kontroliuojančiomis sekomis, atpažįstamomis transformuoto vektoriumi šeimininko. Šis aspektas apima ląsteles-šeimininkus, transformuotus vektoriumi ir būdą, kurio pagalba kDNR apsprendžia mpl ligando pro-dukciją transformuotų ląstelių kultūroje, o taip pat mpl ligando išskyrimą iš ląstelių kultūros, mpl ligandas, paruoštas tokiu būdu, yra praktiškai homogeninis žmogaus mpl ligandas. Geriausios ląstelės-šeimininkės mpl ligando produkcijai yra Kinietiškų žiurkėnių kiau-šidžių (CHO) ląstelės.
[0171] Išradimas taip pat apima terapiškai efektyvaus mpl ligando kiekio pasirinkimą ir panaudojimą, žinduolių su imunologiniais ar hematopoetiniais susirgimais, ypač trombocitopenija, terapijoje. Mpl ligandas gali būti vartojamas kartu su kitais citokinais, ypač su kolonijas stimuliuojančiu faktoriumi ar interleukinu. Geriausi kolonijas stimuliuojantys faktoriai ar interleukinas yra: kit-ligandas, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 ar
[0172] Daugelis autorių ilgą laiką manė, kad trombocitų produkcija kontroliuojama keliais, įvairioms hemopoeti-nių ląstelių atšakoms specifiniais humoraliniais faktoriais. Buvo teigiama, kad magakariocitopoezė ir trombo-poezė reguliuojama dviem skirtingais citokinų aktyvu-mais, priskiriamais magakariocitų kolonijų stimuliuo-jančiam faktoriui (meg-CSF) ir trombopoetinui (Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982]; (Williams et al., Blood Cells, 15:123-133 [1989]; ir Gordon et al., Blood, 80:302-307 [1992]). Pagal šią hipotezę, meg-CSF stimuliuoja megakariocitų pirmtakų prolifera-ciją, o trombopoetinas pirmiausia įtakoja labiau dife-rencijuotų ląstelių brendimą ir galų gale trombocitų produkciją. Iki 1960 metų tiek meg-CSF, tiek ir trombopoetino indukcija bei aktyvumų pasirodymas gyvūnų ir žmogaus plazmoje, serume ir šlapime,esant trombocitopenijos epizodams, buvo pakankamai gerai aprašyti (Odeli et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431
[0173] [1961]; Nakeff et al., Actą Haematol., 54:340-344
[0174] [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:146-149 [1961]; Schreiner et al., J. Clin. Invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608 [197 4] ; Hoffman et al., N. Engi. J. Med., 305:533 [1981] ; Straneva et al., Exp. Hematol., 17:1122-1127 [1988]; Mazur et al., Exp. Hematol., 13:1164 [1985]; Mazur et al., J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner et al., Blood, 56:183-188 [1980]; Hill et al., Exp. Hematol., 20:354-360 [1992] ir Hegyi et al., Int. J. Cell Cloning, 8:236-244 [1990]). Buvo aprašyta, kad šie aktyvumai yra specifiniai tam tikrai hemopoetinių ląstelių atšakai ir skyrėsi nuo žinomų citokinų akty-vumų (Hill R. J. et al., Blood, 80:346 [1992] ; Erickson-Miller C.L. et al., Brit. J. Haematol., 84:197-203 [1993]; Straneva J. E. et al., Exp. Hematol. 20:4750 [1992] ir Tsukada J. et al., Blood 81:866-867
[0175] [1993]). Bet pastangos išgryninti meg-CSF ar trombopoe-tiną iš trombocitopeninės plazmos ar šlapimo buvo nesėkmingos.
[0176] Remiantis aukščiau minėtais trombocitopeninės plazmos tyrimais, mes nustatėme, kad aplastinių kiaulių plazma (APP), gauta iš apšvitintų kiaulių, stimuliuoja žmogaus megakariocitopoezę in vitro. Mes nustatėme, kad šis stimuliuojantis aktyvumas panaikinamas tirpiu ekstraląsteliniu c- mpl domenu, o tai patvirtina, kad APP yra potencialus ieškomo mpl ligando (ML) šaltinis. Mes sėkmingai išgryninome mpl ligandą iš APP, ir nusta-čius mpl ligando amino rūgščių liekanų seką, buvo galima išskirti pelės, kiaulės ir žmogaus ML baltymo kDNR.
[0177] Šie ML baltymai pasižymi sekų homologija su eritropoetinu ir turi kaip meg-CSF aktyvumą, taip ir į trombo-citopoetiną panašų aktyvumą.
[0178] 1. apl ligando gryninimas iš plazmos ir identifikavimas
[0179] Kaip buvo pažymėta aukščiau, iš įvairių šaltinių gautoje aplastinėje plazmoje buvo aptiktas aktyvumas, stimuliuojantis hematopoezę in vitro, bet nebuvo iš-skirtas iš plazmos joks hemotopoezę stimuliuojantis faktorius. Vienas iš aplastinės plazmos šaltinių yra apšvitintų kiaulių plazma. Ši aplastinių kiaulių plazma (APP) stimuliuoja žmogaus hemopoezę in vitro. Siekiant nustatyti, ar APP yra mpl ligandas, buvo matuojamas 3H-timidino įsijungimas į Ba/F3 ląsteles, transfekuotas žmogaus mpl P (Ba/F3- mpl). Šio metodo eiga pateikta Fig. 2. APP stimuliuoja 3H-timidino įsijun-gimą į Ba/F3- mpl ląsteles, bet ne į kontrolines Ba/F3 ląsteles (t.y., netransfekuotas žmogaus mpl P). Papildant, jokio aktyvumo nebuvo pastebėta, tyrimus atliekant su normalių kiaulių plazma. Šie rezultatai parodo, kad APP yra faktorius arba faktoriai, kurie perduoda proliferacijos signalą per mpl receptorių ir tai gali būti natūralus ligandas šiam receptoriui. Tai buvo patvirtinta apdorojus APP tirpiu mpl-IgG, kuris blokuo-davo stimuliuojantį APP efektą ląstelėms Ba/F3-mpl.
[0180] Šis APP faktorius yra baltymas, nes paveikus APP pronaze, DTT ar pakaitinus, buvo prarandamas APP stimuliuojantis aktyvumas (Fig. 3). Aktyvumas nebuvo prarandamas, dializuojant APP. Šis faktorius stabilus, esant žemoms pH reikšmėms (2 valandas pH 2,5), buvo parodyta, kad šis faktorius yra sorbuojamas keliais lectin-afini-niais sorbentais, o tai reiškia, kad šis baltymas yra glikozilintas. Sekantis etapas, nustatant šio fakto-
[0181] riaus struktūrą ir identiškumą, buvo afininis šio faktoriaus išgryninimas iš APP, naudojant mpl- IgG chimerą.
[0182] APP buvo apdorojama taip, kaip aprašyta Pavyz-džiuose 1 ir 2. Trumpai, mpl ligandas buvo gryninamas naudojant hidrofobinės sąveikos chromatografiją ( HIC), chromatografiją su imobilizuotais dažais ir mpi- afininę chromatografiją. Aktyvumo išeiga kiekvienoje chromatografijos stadijoje pateikta Fig. 4, o kiekvienos stadijos išgryninimo faktoriai ( kartais) pateikti Lentelėje 1. Bendra faktoriaus išeiga po mpl- afininės chromatografijos buvo apie 10 %. Aktyvumo pikas ( F6) po mpl-afininės chromatografijos turėjo 9, 8xl06 V/ mg specifinį aktyvumą. Gryninant 5 litrus APP, gryninimo faktorius buvo 4xl06 kartai ( nuo 0, 8 V/ mg iki 3, 3xl06 V/ mg), bal-tymų kiekis sumažėjo 83xl06 kartų ( nuo 250 g iki 3 p. g) . Mūsų nustatytas ligando specifinis aktyvumas po mpl-afininės chromatografijos buvo ~ 3xl06 V/ mg.
[0183] Baltymo koncentracija buvo nustatoma Bradford metodu. Baltymo koncentracijos frakcijose ( 5- 7) nuo mpl- kolonėlės buvo nustatoma pagal dėmių intensyvumą, dažant SDS PAGE gelį sidabru. Vienas aktyvumo vienetas lygus koncentracijai, kuriai esant pasiekiama 50 % maksimalaus Ba/ F3- mpl ląstelių proliferacijos stimuliavimo.
[0184] Eliujuotos nuo mpl afininės kolonėlės frakcijos buvo analizuojamos SDS PAGE (4-20 %, Novex gel) redu-kuojančiomis sąlygomis. Buvo nustatyta, kad mėginiuose yra keletas baltymų (Fig. 5) . Intensyvesnės baltymų juostos dažytuose sidabru SDS PAGE geliuose buvo ties molekulinėmis masėmis 66000, 55000, 30000, 28000 ir 18000- 22000D. Siekiant nustatyti, kuris iš šių baltymų stimuliuoja Ba/ F3- mpl ląstelių proliferaciją, baltymai buvo eliujuojami iš gelio, kaip aprašyta Pavyzdyje 2.
[0185] Šiuo eksperimentu buvo nustatyta, kad didesniu aktyvumu pasižymėjo eliujuoti iš gelio baltymai iš molekulinių masių juostos 28 - 32 kD, mažesniu aktyvumu pasižymėjo baltymai iš molekulinių masių juostos 18 - 22 kD ( Fig. 6) . Vieninteliai šiuose molekulinių masių intervaluose matomi baltymai turėjo 30, 28, ir 18- 22 kD molekulines mases. Siekiant nustatyti " šių baltymų
[0186] ( t. y., juostos 30, 28, ir 18- 22 kD) amino rūgščių liekanų seką, šie baltymai buvo pernešami blotuojant ant PVDF membranos ir sekvenuojami, kaip aprašyta Pavyzdyje 3. Baltymų N galo amino rūgščių liekanų seka pateikta Lentelėje 2.
[0187]
[0188] Kompiuterine analize buvo nustatyta, kad tokių N galo baltymo sekų neturi jokie žinomi baltymai. Kadangi visos trys N galų sekos yra tos pačios, tai tikėtina, kad 30 kD, 28 kD ir 18-22 kD molekulinių masių baltymai gali būti vieno naujo baltymo skirtingos formos. Šis baltymas (baltymai) kaip tik gali būti natūralus mpl ligandas, nes aktyvumas buvo nustatytas toje pačioje SDS PAGE gėlio (4-20 %) srityje (28-32 kD) . Be to, dalinai išgrynintas ligandas eliujuojamas 17-30 kD srityje nuo gelfiltracinės Superose 12 (Pharmacia) kolonėlės. Tikėtina, kad skirtingų molekulinių masių ligando formos gali būti proteinolizės, skirtingo glikozilinimo ar kitų post- arba prieštransliacinių modifikacijų rezultatas.
[0189] Kaip buvo aprašyta ankščiau, antisensinė žmogaus mpl RNR panaikina megakariocitopoezę žmogaus kaulų čiulpų kultūroje, praturtintoje CD 34 + ląstelėmis-pirm-takais, ir neturi jokios įtakos kitų hemopoetinių ląstelių linijų diferenciacijai (Methia et ai., supra). Šie rezultatai leidžia daryti prielaidą, kad mpl receptorius gali įtakoti megakariocitų diferenciaciją ir proliferaciją in vitro. Tolesniam išsiaiškinimui apie mpl ligando įtaką megakariocitopoezei buvo sulyginama APP ir APP be mpl ligando įtaka žmogaus megakariocitopoezei in vitro. APP įtaka žmogaus megakariocitopoezei buvo įvertinama, naudojant modifikuotus suspensinius megakariocitopoezės tyrimus, aprašytus Pavyzdyje 4. Šiuose tyrimuose žmogaus periferinės kamieninės ląste-lės (PSC) buvo paveikiamos APP prieš ir po gryninimo mpl-IgG afinine chromatografija. GPIIbIIIa megakario-citopoezės stimuliacija buvo kiekybiškai įvertinama su 125J-anti-IIbIIIa antikūnais (Fig. 7). Kaip parodyta Fig. 7, 10 % APP sukelia apie tris kartus didesnę stimuliaciją, tuo metu, kai APP be mpl ligando neturi jokios įtakos. Svarbu, kad APP be mpl ligando neindu-kuoja ląstelių Ba/F3- mpl proliferacijos.
[0190] Kitame tyrime tirpus žmogaus mpl-IgG buvo pridedamas 0, 2 ir 4 dieną į kultūras, kuriose buvo 10 % APP, kad neutralizuotų APP stimuliacijos efektą žmogaus megakariocitopoezei (Fig. 8). Šie rezultatai įrodo, kad mpl ligandas dalyvauja žmogaus megakariocitopoezės reguliavime, todėl mpl ligandas gali būti naudingas, gydant trombocitopeniją. 2. mpl ligando molekulinis klonavimas Remiantis galine amino rūgščių seka, gauta iš 30 kD, 28 kD ir 18-22 kD baltymų (žr. Lentelę 2), du išsigimę oligonukleotidai buvo panaudoti kiaulių geno-minės DNR amplifikuoti PCR būdu. Tai buvo atlikta remiantis tuo, jog, jeigu galinė amino rūgščių seka yra koduojama vienintelio egzono, tada teisingas PCR produktas turėtų būti 69 bp ilgio. Tokio ilgio DNR fragmentas buvo gautas ir klonuotas į pGEMT. Oligonukleo-tidinės PCR pradmenų sekos ir trys gauti klonai yra parodyti Pvz. 5. Peptido amino rūgščių seka (PRLLNKLLR [SEQ ID Nr.: 33]), koduojama tarp PCR pradmenų, buvo identiška galinei baltymo amino sekai gautai, sekvenuojant kiaulių ligandą (žiūrėti 9-17 amino rūgščių liekanas 28 ir 30 kD kiaulių baltymo sekas, pateiktas aukščiau).
[0191] Sintetinis oligonukleotidas, paremtas PCR fragmento seka, buvo panaudotas žmogaus genominės DNR bibliotekos skryningui. 45 bazių oligonukleotidas, pavadintas pR45, buvo susintetintas, remiantis PCR fragmento seka. Šis oligonukleotidas turi tokią seką:
[0192] TTT ATT TAG GAG TCG 3' (SEQ ID Nr.: 34)
[0193] Šis dezoksioligonukleotidas buvo panaudotas žmo-gaus genominės DNR bibliotekos skryningui Xgem 12, esant negriežtoms hibridizacijos ir atplovimo sąlygoms, pagal Pavyzdį.6. Buvo atrinkti teigiami klonai, jie išgryninti ir analizuoti restriktuoj ant bei naudojant Southern blotingą. 390 bp EcoRI-XbaI fragmentas, kuris hibridizuojasi su 45 bazių porų ilgio fragmentu, buvo klonuotas į pBluescript SK-. Šio klono DNR sekos nustatymas patvirtino, jog buvo išskirta DNR seka, koduojanti žmogaus homologą kiaulių mpl ligando dalį. Žmogaus DNR seka ir ją atitinkanti amino rūgšių seka yra parodyta Pieš.9 (SEQ ID Nr.: 3 ir 4). Numatomos intronų po-
[0194] zicijos genominėje sekoje taip pat yra pažymėtos rodyk-lėmis, ir nustatytas numanomas egzonas (" egzonas 3").
[0195] Remiantis žmogaus " egzono 3" seka ( Pavyzdys. 6) buvo susintetinti oligonukleotidai, atitinkantys 3' ir 5' egzono sekos galus. Šie du pradmenys buvo naudojami PCR reakcijose, kaip matricą naudojant kDNR, gautą iš ivairių žmogaus audinių. Teisingo PCR produkto laukiamas ilgis buvo 140 bp. Išanalizavus PCR produktus 12% poliakrilamidiniame gelyje, laukiamo dydžio DNR fragmentas buvo nustatytas kDNR bibliotekose, paruoštose iš suaugusio žmogaus inkstų, embriono inkstų 293 ląstelių ir kDNR paruoštose iš žmogaus embriono kepenų.
[0196] Embriono kepenų kDNR biblioteka ( 7xl06 klonų) A. DR2 toliau buvo analizuojama su tuo pačiu 45 bazių oligonukleotidu, kuris buvo naudotas žmogaus genominės bibliotekos ir embriono kepenų kDNR bibliotekos skryninge, esant negriežtoms hibridizacijos sąlygoms. Buvo atrinkti teigiami klonai, trombocitai išgryninti ir įterptos sekos dydis buvo analizuojamas PCR būdu. Vienas klonas su 1. 8 kbp intarpu buvo atrinktas tolesnei analizei. Naudojant procedūras, aprašytas Pavyzdyje. 7, buvo gauta žmogaus mpl ligando ( hML) nukleotidų seka bei iš jos išvestinė amino rūgščių liekanų seka. Šios sekos yra pateiktos Fig. 1 ( SEQ ID Nr. : 1 ir 2).
[0197] Žmogaus mpl ligando (hML) kDNR seka (Fig. l.[SEQ ID Nr.: 2]) turi 1774 nukleotidus ir poli(A)uodegą. Tai sudaro 215 nukleotidų nuo netransliuojamos sekos 5' galo ir 498 nukleotidus nuo 3' netransliuo j amos srities. Tikėtinas iniciacijos kodonas, esantis 216-218 nukleotidų srityje yra konsensinė seka, tinkama eukariotinei transliacijos iniciacijai. Atviras skaitymo rėmelis yra 1059 nukleotidų ilgio ir koduoja 353 amino rūgščių polipeptidą, pradedant 220-tu nukleotidu. Iš-vestinės amino rūgščių sekos N-galas yra labai hidro-
[0198] fobinis ir turbūt atitinka signalinį peptidą. Kompiu-terinė amino rūgščių sekos analizė (von Heijne et.aJ., Eur. J. Biochem., 133:17-21[1983]) nurodo potencialią skėlimo vietą signalinei peptidazei tarp 21 ir 22 amino rūgščių liekanų. Perskėlus šioje pozicijoje, susidarytų subrendęs 332 amino rūgščių liekanų polipeptidas, pra-sidedantis N galine seka, kurią turi mpl ligandas, iš-grynintas iš kiaulių plazmos. Išvestinis neglikozilinto 332 amino rūgščių liekanų ligando molekulinis svoris yra apie 38 kD. Yra 6 potencialios N-glikozilinimo vietos ir 4 cisteino liekanos.
[0199] mpl ligando sekos palyginimas su Genų banko sekų duomenų baze parodė 23% identiškumą tarp subrendusio žmogaus mpl ligando 153 amino galinių liekanų ir žmo-gaus eritropoetino (Fig. 10 [SEQ ID Nr.: 6 ir 7]). Turint galvoje konservatyvius pakeitimus, šis hML regionas parodo 50% panašumą su žmogaus eritropoetinu (hEPO). Ir hEPO, ir hML turi keturis cisteinus. Trys iš keturių cisteinų yra konservatyvūs hML, įskaitant pir-mąjį ir paskutinįjį cisteinus. Kryptingosios mutagene-zės eksperimentai parodė, kad pirmas ir paskutinis eritropoetino cisteinai formuoja disulfidinę jungtį, kuri yra funkciškai reikalinga (Wang, F.F., et.al., Endocrinology 116: 22 86-2292 [1983]) . Analogiškai pirmas ir paskutinis hML cisteinai taip pat gali formuoti kritinį disulfidinį ryšį. hML neturi konservuatyvių glikozilinimo vietų. Visos potencialios hML N- susijusios glikozilinimo vietos yra lokalizuotos hML polipeptido C galo pusėje.
[0200] Kaip ir hEPO, hML iRNR neturi konsensinės poliadenilinimo sekos AAUAAA, nei reguliatorinio elemento AUUUA, kuris yra daugelio citokinų 3'netransliuojamoje srityje ir kuris, manoma, turi įtakos mRNR stabilumui (Shawet al., Cell, 46:659-667 [1986]). Northern blota-vimo analizė rodo nedidelį kiekį vienintelio 1.8 kbp hML RNR transkripto tiek embriono, tiek suaugusių žmo-nių kepenyse. Po ilgo ekspozicijos laiko silpna tokio pat dydžio juostelė gali būti nustatyta suaugusių žmo-nių kepenyse. Analogiškai žmogaus eritropoetinas yra ekspresuojamas embriono kepenyse, o taip pat suaugusio žmogaus inkstuose ir kepenyse, atsakant į hipoksiją
[0201] (Jacobs et. al., Nature, 313: 804-809 [1985] and Bondurant et. al., Molec. Cell. Biol., 6:2731-2733
[0202] [1986]).
[0203] HML C-galinio rajono svarba tebėra aiškinama. Remiantis šešių potencialių N-susieto glikozilinimo vietų buvimu ir ligando sugebėjimu rištis prie lectin-afininių kolonų, panašu, jog šis hML rajonas yra glikozilintas. Kai kuriuose eliucijos iš gelio eksperimen-tuose mes pastebėjome, jog aktyvumas yra aptinkamas ties molekuline mase 60000 D, o tai gali būti pilna glikozilinta molekulė. Tuo būdu C-galinė sritis gali stabilizuoti ir padidinti cirkuliuojančio hML gyvavimo pusperiodį. Eritropoetino atveju neglikozilinta forma turi pilną biologinį aktyvumą in vitro, bet turi žymiai sumažintą plazmos gyvavimo pusperiodį, lyginant su glikozllintu eritropoetinu (Takeuchi et. al., J. Biol. Chem., 265: 12127-12130 [1990]; Narhi et. al., J. Biol. Chem., 266: 23022-23026 [1991] ir Spivack et al., Blood, 7:90-99 [1989]). hML C-galinis domenas turi dvi bazines amino rūgščių liekanų sekas [Arg-Arg motyvai 153-154 ir 245-246 pozicijose], kurios gali tarnauti kaip potencialios procesingo vietos. Skeliant šiose vietose gali susidaryti 30, 28, ir 18-22kD ML, išskirto iš APP, formos. Arg153~Arg154 sekos yra iš karto po domeno, panašaus į erltropoetiną, kuris yra ML. Remiantis šiais pastebėjimais, galima pasakyti, kad pilnas ML gali būti signalinis peptidas, kuris patiria ribotą proteolizę, tam kad susidarytų subrendęs ligandas. 4. Žmogaus apl ligando izof ormos ir variantai Izoformos arba alternatyviai sujungtos žmogaus mpl ligando formos buvo nustatytos PCR būdu suaugusio žmo-gaus kepenyse. Trumpai tariant, pradmenys buvo susintetinti atitinkamai kiekvienam galui, taip pat ir pasirinktiems vidiniams hML koduojančios sekos regionams. Šie pradmenys buvo naudojami RT-PCR, norint padauginti suaugusio žmogaus kepenų RNR, kaip aprašyta Pavyzdyje 10, Be pilno ilgio formos, priskiriamos hML, trys kitos formos, hML2, hML3 ir hML4 buvo pastebėtos arba išves-tos. Išvestinės visų keturių subrendusių izoformų amino rūgščių sekos yra parodytos Fig. 11 (SEQ ID Nr.: 6,8,9 ir 10) . hML3 turi 116 nukleotidų deleciją 700-toje pozicijoje, o tai duoda amino rūgščių deleciją ir rėmelio poslinkį. kDNR dabar koduoja subrendusį polipeptidą, kuris turi 265 amino rūgštis ir skiriasi nuo hML sekos ties 139 amino rūgšties liekana. Galiausiai, hML4 turi 12 nukleotidų deleciją po 618-tos nukleotido pozicijos (taip pat randama pelės ir kiaulės sekose [žiūr. že-miau]) ir 116 bazių porų deleciją, randamą hML3. Nors nebuvo išskirtų iš žmogaus klonų tik su 12 bazių porų deleciją (po 619 nukleotido) (priskiriama hML2), pana-šu, jog ši -forma egzistuoja, kadangi tokia izoforma buvo identifikuota pelėje ir kiaulėje (žr.žemiau), ir kadangi tai buvo identifikuota kartu su 116 nukleotidų deleciją hML4 .
[0204] Kartu ir pakaitinis hML variantas, kuriame dviejų bazinių amino rūgščių liekanų Arg153~Arg154 seka buvo pakeista į dvi alanino liekanas, ir "EPO-domenas", sutrumpinta hML forma, buvo sukonstruotos, norint nustatyti, ar pilno ilgio ML yra būtinas biologiniam' aktyvumui. Arg153-Arg154 dviejų bazinių amino rūgščių liekanų sekos pakaitinis variantas, vadinamas hML(R153A, R154A), buvo sukonstruotas PCR būdu, kaip aprašyta Pvz.10. "EPO-domeno" sutrumpinta forma, hMLi53, taip pat buvo gauta PCR būdu, įvedant stop kodoną po Argi53.
[0205] 5. Žmogaus rekombinantinio mpl ligando ( rhML) ekspresija laikinai transfekuotuose žmogaus embriono inkstų ( 293) ląstelėse
[0206] Norint patvirtinti, kad klonuota žmogaus kDNR koduoja mpl ligandą, ligandas buvo ekspresuotas žinduo-lių 293 ląstelėse, naudojant ekspresijos vektorius pRK5-hML ar pRK5-hMLi53, kuriuose mpl ligando kDNR ekspresiją kontroliuoja ankstyviausias citomegalo viruso promotorius. Buvo parodyta, kad supernatantai, kuriuose augo laikinai transfekuotos žmogaus embriono 293 ląstelės, stimuliuoja 3H-timidino įsijungimą į Ba/F3- mpl ląsteles, bet ne į motinines Ba/F3 ląsteles (Fig. 12A) . Terpė, kondicionuota 293 ląstelėmis, transfekuotomis vien pRK vektoriumi, tokiu aktyvumu nepasižymėjo. Pridėjus į terpę mpl-IgG, ląstelių stimuliacija inhibuojama (duomenys nepateikti). Šie rezultai įrodo, kad klonuota kDNR koduoja funkcionalų žmogaus ML (hML).
[0207] Siekiant išaiškinti, ar "EPO-domenas" vienas gali sąveikauti su mpl ir jį aktyvuoti, sutrumpinta hML forma - rhMLi.53 - buvo ekspresuota 293 linijos ląstelėse. Transfekuotų ląstelių kondicionuota terpė pasižymėjo tokiu pat aktyvumu, kaip ir terpė nuo ląstelių, trans-fekuotų pilno ilgio hML genu (Fig. 12A) . Tai parodo, kad ML domenas, esantis baltymo C gale, nereikalingas sąveikai su c- mpl bei jo aktyvacijai. 6. mpl ligandas stimuliuoja megakariocitopoezę ir trombopoezę.
[0208] Abi - pilno ilgio rhML ir sutrumpinta rhMLxs3 - rekombinantinio hML baltymo formos stimuliuoja megakario-citopoezę in vitro (Fig. 12B) . Šis efektas stebimas nesant jokių kitų egzogeninių hemopoetinių augimo fak-torių. Išskyrus IL-3, ML buvo vienintelis hemopoetinis augimo faktorius, pasižymintis tokiu aktyvumu. Testuojant atskirai IL-11, IL-6, IL-1, eritropoetinas, G-CSF, IL-9, LIF, kit-ligandas (KL) , M-CSF, OSM ir GM-CSF neturėjo įtakos megakariocitopoezei (duomenys nepateikti) . Šie rezultatai rodo, kad ML pasižymi megakariocitus stimuliuojančiu aktyvumu ir pabrėžia jo vaidmenį megakariocitopoezės reguliacij oj e.
[0209] Pelių atsakomosios trombocitozės metodu parodyta, kad trombocitopeniškų gyvūnų plazmoje esantys trombo-poetiškai aktyvūs faktoriai stimuliuoja trombocitų pro-dukciją (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973] ir McDonald, et al., Scand. J. Haematol. , 16:326-334 [1976]). Šiame modelyje pelėms suleidus spe-cifinį antitrombocitinį antiserumą, sukeliama ūmi trombocitopenija, kuri savo ruožtu iššaukia nuspėjamą atsa-komąją trombocitozę. Tokios pelės daug geriau, nei nomalios reaguoja į egzogeninį trombopoetinį aktyvumą
[0210] (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001
[0211] [1973]), lygiai taip, kaip pelės po hipoksijos daug geriau reaguoja į eritropoetiną, nei sveikos (McDonald, et al., J. Lab. Clin. Med., 77:134-143 [1971]). Norint išaiškinti ar rML gali stimuliuoti trombocitų produk-ciją in vivo, pelėms, kurioms buvo sukelta atsakomoji trombocitozė, buvo suleistas nevisiškai išgrynintas rhML. Po to buvo įvertintas trombocitų skaičius ir 35S įsijungimas į trombocitus. Suleidus pelėms 64000 arba 32000 vienetų rML, pasiektas žymus trombocitų produkcijos padidėjimas, kuris pasireiškia trombocitų skai-čiaus padidėjimu -20 %, lyginant su kontroline' grupe (p = 0, 0005 ir 0, 0001, atitinkamai) ir 35S įsijungimo į trombocitus padidėjimu -40 % (p = 0,003); kontrolinėms pelėms buvo suleidžiamas vien tirpiklis (Fig. 12C) . Gautas stimuliacijos lygis panašus į stimuliacijos lygį, kurį šioje sistemoje rodo IL-6 (duomenys nepateikti) . Leidžiant 16000 vienetų rML, žymios trom-bocitų stimuliacijos nebuvo. Šie rezultatai rodo, kad ML stimuliuoja trombocitų produkciją ir preparato efektas priklauso nuo jo dozės. Tokiu būdu, ML aktyvumas atitinka trombopoetino aktyvumą. 293 linijos ląsteles buvo taip pat transfekuotos kitų hML izoformų konstruktais, aprašytais aukščiau, ir transformantų kondicionuotų terpių aktyvumas buvo ana-lizuotas Ba/F3- mpl proliferacijos metodu (žiūr. Fig. 13) . hML2 ir hML3, tiriant šiuo nietodu, buvo neaktyvus, tačiau hML(R153A, R154A) aktyvumas buvo panašus į hML ir hMLi53 aktyvumus. Tai rodo, kad Arg153-Argi54 dviejų bazinių amino rūgščių liekanų vieta neturi nei teigiamos, nei neigiamos įtakos ML aktyvumui.
[0212] Manoma, kad megakariocitopoezė reguliuojama įvai-riose ląstelių vystymosi stadijose (Williams et al., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982] ir Williams et al., Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Šis požiūris remiasi žinomu faktu, kad vieni hemopoetiniai faktoriai stimuliuoja megakariocitų pirmtakų proliferaciją, tuo tarpu kiti, matyt, įtakoja jų brendimą. Išradime pateikti rezultatai rodo, kad ML veikia ir proliferaciją, ir brendimą. Yra eksperimentinių duomenų, kad ML stimuliuoja megakariocitų pirmtakų proliferaciją. Pirma, APP gali stimuliuoti megakariocitų proliferaciją ir bren-dimą in vitro, ir abu efektai visiškai inhibuojami pri-dėjus mpl-IgG (Fig. 7 ir 8). Antra, c- mpl antisensiniai oligonukleotidai inhibuoja megakariocitų kolonijų for-mavimąsi (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) . Tas efektas, kad c- mpl gali perduoti proliferacijos signalą į ląsteles, kurias jis transfekavo, taip pat įrodo, kad ML stimuliuoja proliferaciją (Skoda et al., EMBO, 12:2645-2653 [1993] ir Vigon et al., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Akyvaizdi c- mpl ekspresija visose megakariocitų diferencijacijos stadijose (Methia et al., Blood, 82:1395-1401 [1993]) ir rekombinantinio ML sugebėjimas greitai stimuliuoti trombocitų produkciją in vivo nurodo, kad ML taip pat įtakoja megakariocitų brendimą. Rekombinantinis ML atveria galimybę tiksliai įvertinti jo vaidmenį megakariocitopoezės ir trombo-citopoezės reguliacijoje, o taip pat galimą jo įtaką kitų atšakų hemopoetinėms ląstelems. 8. Žmogaus mpl ligando ( TPO) geno išskyrimas TPO geno žmogaus genominės DNR klonai buvo išskir-ti, atliekant žmogaus genominės bibliotekos, esančios XGeml2 su pR45, skryningą, kai yra negriežtos sąlygos arba, esant griežtoms sąlygoms su fragmentu, atitinkan-čiu žmogaus kDNR 3'dalį, koduojančią mpl ligandą. Buvo išskirti du persidengiantys lambda klonai, turintys 35kb. Du persidengiatys fragmentai (BamHI ir EcoRI), turintys pilną TPO geną, buvo klonuoti ir sekvenuoti (žr. Fig. 14A, 14B ir 14C).
[0213] Žmogaus genas turi 6 egzonus 7 kbp ilgio genomi-nėje DNR. Jungtys visose egzono/introno susijungimo vietose atitinka konsensinį motyvą, nustatytą žinduolių genams (Shapiro, M.B., et. al., Nucl. Acids Res. 15:7155
[0214] [1987]). Egzonas 1 ir egzonas 2 turi 5' netransliuojamą seką ir signalinio peptido pirmas keturias amino rūgš-tis. Sekrecinio signalo liekana ir pirmos 26 subrendusio baltymo amino rūgštys yra koduojamos egzone 3. Pilnas C-galinis domenas, 31netransliuoj amas domenas, o taip pat ir apie 50 amino rūgščių iš domeno, panašaus į eritropoetiną, yra koduojami egzone 6. Keturios amino rūgštys, dalyvaujančios delecijoje, stebimoje hML-2 (hTPO-2), yra koduojamos 6 egzono 5'gale. Žmogaus genominės DNR analizė, naudojant Sautherno blotavimą, nurodo, jog TPO genas yra vienintelėje kopi-joje. Geno chromosominė lokalizacija yra nustatoma fluorescentine in situ hibridizacija (FISH), naudojama 3q27-28 chromosomai. 9. TPO ekspresija ir gryninimas iš 293 ląstelių ML arba TPO paruošimas ir gryninimas iš 293 ląste-lių yra detaliai aprašytas Pavyzdyje 19. Trumpai tariant, kDNR, atitinkanti TPO pilną atvirą skaitymo rėmelį, buvo gauta PCR būdu, naudojant pRK5-h mpl I. PCR produktas buvo išvalytas ir klonuotas į plazmidę pRK5tkneo, kuri suskaldyta restrikazėmis Clal ir Xbal (pRK5 vektorius yra modifikuotas ekspresuoti atsparumo neomicinui geną, esant timidin-kinazės promotoriaus kontrolei), norint gauti vektorių pRK5tkneo.ORF (vekto-rių, koduojantį pilną atvirą skaitymo rėmelį). Antrasis vektorius EPO homologiniam domenui buvo gautas tokiu pat būdu, bet naudojant skirtingus PCR pradmenis, norint gauti galutinę konstrukciją, vadinamą pRK5-tkneoEP0-D.Šios dvi konstrukcijos buvo transfekuotos į žmo-gaus embrionines inkstų ląsteles kalcio fosfatiniu metodu ir buvo atrinkti neomicinui atsparūs klonai, kurie buvo auginami. ML153 arba ML332 ekspresija kondicionuotoje terpėje nuo šių klonų buvo nustatyta, naudojant Ba/F3-mpi proliferacijos bandymą. rhML332 gryninimas buvo atliekamas, kaip aprašyta Pavyzdyje 19. Trumpai tariant, terpė su 239-rhML322 buvo naudojama Blue-Sepharose (Pharmacia) kolonoje, kuri buvo vėliau plaunama buferiniu tirpalu, turinčiu 2M karbamido. Baltymai buvo eliujuoti buferiniu tirpalu, turinčiu 2M karbamido ir 1M NaCl. Po Blue-Sepharose apjungtos eliujuotos frakcijos buvo tiesiogiai užnešamos ant WGA-Sepharose kolonos, praplautos su 10 kolonos tūrių buferinio tirpalo, turinčio 2M karbamido ir 1 M NaCl ir eliujuota su tuo pačiu buferiniu tirpalu, turinčiu 0,5 M N-acetil-D-glukozamino. WGA-Sepharose eliuatas buvo užneštas ant C4-HPLC kolonos (Synchrom, Inc.) ir eliujuotas propanolio gradientu. Išvalytas 293-rhML332 SDS-PAGE juda kaip plati juosta 68-80 kD srityje (žr.
[0215] rhMLi53 gryninimas gali taip pat būti atliktas kaip aprašyta Pavyzdyje 19. Trumpai tariant, terpė su 293-rhML153 buvo chromatografuojama ant Blue-Sepharose, kaip aprašyta rhML332 # Blue Sepharose eliuatas iškart buvo perneštas ant mpl afininės kolonėlės, kaip aprašyta aukščiau. RhML153 , eliujuotas nuo mpl afininės kolonė-lės buvo išgrynintas iki homogeniškumo, naudojant C4-HPLC koloną tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir buvo nau-dota rhML332 valyme. Išgrynintas rhML153 SDS-PAGE išsis-kiria į dvi pagrindines ir dvi minorines juostas, kurių molekulinė masė 18 -22 kD (žr. Fig. 15).
[0216] DNR fragmentas, atitinkantis žmogaus mpl ligando koduojančią sritį, buvo gautas PCR būdu, išgrynintas iš gelio ir pažymėtas radioaktyvia žyme, naudojant 32 32
[0217] P-dATP ir P-dCTP. Sis mėginys buvo panaudotas atrinkti 10® klonų -iš pelės kepenų kDNR bibliotekos, esan-čių A.GT10. Buvo išskirtas ir sekvenuotas pelės klonas (Fig. 16 [SEQ ID Nr: 12 ir 13]), turintis 1443 bazių porų intarpą. Numanomas iniciacijos kodonas, esantis 138-141 nukleotidų srityje, buvo konsensinėje sekoje, tinkamoje eukariotinei transliacijos iniciacijai (Kozak, M. J. Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Ši seka sudaro atvirą skaitymo rėmelį iš 1056 nukleotidų, kuris apsprendžia pirminį transliacijos produktą iš 352 amino rūgščių. Šį atvirą skaitymo rėmelį supa 137 nukleotldai nuo netransliuojamos sekos 5'galo ir 247 nukleotidai nuo netransliuojamos sekos 3' galo. Nėra poli(A) uodegos, einančios po 3' netransliuojamos srities, o tai reiškia, jog klonas tikriausiai nėra pilnas. Numanomos amino rūgščių sekos N galas yra ypač hidrofobinis ir tai, turbūt, yra signalinis peptidas. Kompiuterine analize (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133:17-21 [1983]) buvo nustatyta potenciali skėlimo signalinei peptidazei vieta tarp 21 ir 22 liekanų. Perskėlus šioje vietoje, susidaro 331 amino rūgšties subrendęs polipeptidas (35kD), žymimas kaip mML331 (arba mML2, dėl priežasčių aprašytų žemiau). Seka turi keturis cisteinus, visus konservatyvius žmogaus baltymo sekoje, ir septynias potencialias N-glikozilinimo vietas, 5 iš kurių yra konservatyvios žmogaus baltymo sekoje. Vėl, kaip su hML, visos septynios potencialios N-glikozilinimo vietos yra baltymo C galo pusėje.
[0218] - Lyginant su žmogaus ML, buvo stebimas abiejų ML nukleotidų sekų ir išvestinių amino rūgščių sekų žymus panašumas "EPO-domenuose". Tačiau palyginus žmogaus ir pelės ML išvestines amino rūgščių sekas, pasirodė, jog pelės ML seka turi tetrapeptidinę deleciją tarp 111-114 liekanos, atitinkančią 12 nukleotidų deleciją po 618 nukleotido, kuri yra matoma žmogaus (žr.aukščiau) ir kiaulės (žr.žemiau) kDNR. Atitinkamai, buvo išanali-zuoti papildomi klonai galimų pelės ML izoformų nustatymui. Vienas klonas, koduojantis 335 amino rūgščių polipeptidą turi "praleistą" tetrapeptidą LPLQ. Tikimasi, jog ši forma yra pilnas pelės ML ir jis vadinamas mML arba mML335 . mML nukleotidinė ir išvestinė amino rūgščių sekos yra pateiktos Fig. 17 (SEQ ID Nr.:- 14 ir 15) . Šis kDNR klonas turi 1443 bazių poras, kurios yra iki poli(A) uodegos. Tai apima atvirą skaitymo rėmelį iš 1068 bp', apsuptą 134 bazių nuo netransliuojamos sekos 5'galo ir 241 bazės nuo netransliuojamos sekos 3' galo. Numanomas iniciacijos kodonas yra tarp 138-140
[0219] nukleotidų. Atviras skaitymo rėmelis koduoja išvestinį 356 amino rūgščių liekanų baltymą, kurio pirmosios 21 amino rūgščių liekanos yra ypač hidrofobinės ir, panašu, jog jos yra sekrecijos signalas.
[0220] Galų gale, buvo išskirtas trečias pelės baltymo klonas, nustatyta seka ir parodyta, kad jis turi 116 nukleotidų deleciją, atitinkančią hML3. Ši pelės baltymo izoforma pavadinta mML3. Šių dviejų izoformų išves-tinių amino rūgščių sekų palyginimas yra pateiktas
[0221] Žmogaus ir pelės ML amino rūgščių sekos panašumas (Fig. 19 [SEQ ID Nr.: 6 ir 17]) yra 72%, bet ši homologija nėra vienodai paskirstyta. Sritis, vadinama "EPO-domenu" (žmogaus sekos amino rūgštys 1-153 ir 1-149 pelės sekos) yra labiau konservatyvi (86% homologijos) , negu baltymo C-galo sritis (62% homologijos). Tai gali reikšti, kad tiktai "EPO-domenas" yra svarbus baltymo biologiniam aktyvumui. Įdomu, kad iš dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvų, randamų hML, tiktai dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvas, esantis iškart po "EPO-domeno" (153-154 liekanos) žmogaus ML sekoje, yra pelės ML sekoje. Tai atitinka prielaidą, kad pilno ilgio ML gali turėti signalinę seką, kuri atskeliama ir susidaro subrendęs ligandas. Proteolizė tarp Argi53-Arg154 gali palengvinti hML išskyrimą.
[0222] Ekspresijos vektorius, turintis pilną mML koduo-jančią seką, buvo laikinai transfekuotas į 293 ląstelių liniją, kaip aprašyta Pavyzdyje 1. Šių ląstelių kondicionuota terpė stimuliuoja 3H-timidino įsijungimą į Ba/F3 lątesles, ekspresuojančias arba pelės arba žmo-gaus mpl, bet neturi įtakos motininei (be mpl) ląstelių linijai. Tai rodo, jog klonuota pelės ML kDNR koduoja funkcionuojantį ligandą, kuris gali aktyvuoti ir pelės, ir žmogaus ML receptorių ( mpl).
[0223] Kiaulės ML (pML) kDNR buvo išskirta RACE PCR būdu, kaip aprašyta Pvz. 13.PCR produktas, 1342 bp kDNR, buvo rastas inkstuose ir klonuotas. Buvo nustatyta kelių klonų seka ir rastas 332 amino rūgščių liekanų kiaulės mpl ligandas, pavadintas pML (arba pML332), kurio nuk-leotidų ir išvestinė amino rūgščių seka yra parodyta
[0224] Po to, buvo nustatyta antra forma, pavadinta pML2 (žr. Fig. 21 [SEQ ID Nr.: 21]), koduojanti baltymą su 4 amino rūgščių liekanų delecija (228 amino rūgščių liekanos) . pML ir pML2 amino rūgščių sekų palyginimas parodė, kad pastaroji forma yra identiška, išskyrus tai, kad tetrapeptido QLPP, atitinkančio 111-114 liekanas trūksta (žr. Fig. 22 [SEQ ID Nr.: 18 ir 21]). Keturios amino rūgščių liekanų delecijos, esančios pelės ir kiaulės ML kDNR, yra toje pačioje išvestinių baltymų sekų vietoje.
[0225] Palyginus žmogaus, pelės ir kiaulės (Fig. 19 [SEQ ID Nr.: 6, 17 ir 18]) subrendusio ML išvestines amino rūgščių liekanų sekas, pasirodo, jog tarp pelės ir žmogaus ML visos sekos identiškumas yra 72 %, 68 % - tarp pelės ir kiaulės ir 73 % - tarp kiaulės ir žmogaus ML. Homologija yra žymiai didesnė ML N-galo pusėje (EPO homologinis domenas) . Šis domenas yra nuo 80 iki 84 % identiškas tarp bet kurių rūšių, tuo tarpu kai baltymo C-galas (karbohidratinis domenas) yra identiškas tiktai nuo 57 iki 67 %. Dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvas, kuris gali būti proteazės skėlimo vieta, yra eritropoetino homologo domeno C-gale. Šis motyvas yra konservatyvus šioje pozicijoje trijose rūšyse (Fig. 19 [SEQ ID Nr.: 6, 17 ir 18]). Antros vietos, kur yra dvi bazinės amino rūgščių liekanos, žmogaus ML sekoje tarp 245 ir 246 nuk-leotidų, nėra pelės ir kiaulės ML sekose. Pelės ir kiaulės ML seka turi 4 cisteinuš, visus konservatyvius žmogaus ML sekoje. Yra septynios potencialios glikozilinimo vietos pelės ligande ir šešios kiaulės ML, 5 iš kurių yra konservatyvios žmogaus ML sekoje. Vėl, visos potencialios N- glikozilinimo vietos yra baltymo C- gale. 12. TPO ekspresija ir gryninimas iš Kinietiškų žiurkėnių kiaušdžių ( CHO) ląstelių
[0226] CHO ląstelių transfekcij ai panaudoti vektoriai buvo pažymėti: pSVI5.ID.LL.MLORF (pilno ilgio arba TPO332) ir pSVl5.ID.LL.MLEP0-D (sutrumpintas arba TPO153) . Šių plazmidžių savybės yra pateiktos Fig. 23 ir 24 .
[0227] Transfekcijos procesas yra aprašytas Pavyzdyje 20. Trumpai, kDNR, atitinkanti pilną TPO skaitymo rėmelį, buvo gauta PCR pagalba. PCR produktas buvo išgrynintas ir klonuotas į restrikcijos (Clal ir Salį) sritį plaz-midėje pSVI5.ID.LL, taip buvo gautas vektorius pSVI5.ID.LL.MLORF. Kitas konstruktas, atitinkantis EPO homologo domeną, buvo gautas tuo pačiu būdu, bet naudojant skirtingą atvirkštinį pradmenį (EPOD.Sal). Galutinis konstruktas, atitinkantis TPO baltymo EPO homologinį domeną, buvo pavadintas pSVI5.ID.LL.MLEPO-D.
[0228] Šie konstruktai buvo linearizuoj ami su NotI ir transfekuoti elektroporacij a į Kinietiškų Žiurkėnių Kiaušidžių Ląsteles (CH0-DP12 ląstelės, EP 307247, publikuotas 1989.03.15). 107 ląstelių buvo elektroporuojamos BRL elektroporacijos aparate (350 V, 330 mF, esant mažai talpuminei varžai), pridėjus 10, 25 arba 50 mg DNR, kaip aprašyta (Anderson, G. L. J. Tissue Cult. Meth., 15,56 [1993]). Praėjus dienai po transfekcijos, ląstelės buvo perkeltos į DHFR selektyvią terpę
[0229] (DMEM-F12 su didele koncentracija gliukozės 50:50 be glicino, su 2 mM glutamino, 2 - 5 % dializuoto embrioninio galvijų 'serumo) . Po 10 - 15 dienų atskiri klonai buvvo perkeliami į 96 šulinėlių plokšteles arba palie-kami augti iki monosluoksnio susidarymo. Šių klonų ML153
[0230] arba ML332 ekspresija kondicionuotoje terpėje buvo įver-tinama Ba/ F3- mpl proliferacijos analize ( aprašyta Pavyzdyje 1).
[0231] TPO išskyrimas ir gryninimas iš CHO ląstelių auginimo terpės aprašytas Pavyzdyje 20. Trumpai, surinkta ląstelių auginimo terpė ( HCCF) buvo sorbuojama Bue-Sepharose kolonoje ( Pharmacia) ( 100 1 HCCF 1 litrui sorbento) . Kolona po to buvo praplaunama nuo 3 iki 5 kolonos tūrių buferinio tirpalo, po to praplaunama nuo 3 iki 5 kolonos tūrių to paties buferinio tirpalo su 2, 0 M karbamido. TPO baltymas buvo eliujuojamas 3- 5 kolonos tūriais buferinio tirpalo su 2, 0 M karbamido ir 1, 0 m NaCl.
[0232] Surinktos po Blue Sepharose kolonos frakcijos, kuriose buvo TPO, buvo sorbuotos ant Wheat Germ Lectin Sepharose kolonos ( Pharmacia), nulygsvarintos Blue Sepharose kolonėlės eliucijos buferiniu tirpalu, parin-kus tokį santykį: nuo 8 iki 16 ml eliuato 1 ml sorbento. TPO buvo eliujuojamas 2- 5 kolonos tūriais buferinio tirpalo su 2, 0 M karbamido ir 0, 5 M N- acetil- D-gliukozamino.
[0233] Eliuatas iš Wheat Germ Lectin, kuriame buvo TPO, buvo parūgštinamas ir pridedama C12E8 iki galutinės jo koncentracijos 0, 04 %. Toks tirpalas buvo sorbuojamas ant atvirkščių fazių kolonėlės C4, nulygsvarintos 0, 1 % TFA, 0, 04 % C12E8, sorbuojant nuo 0, 2 iki 0, 5 mg baltymo vienam ml sorbento.
[0234] Baltymas buvo eliujuojamas dvifaziu linijiniu acetonitrilo gradientu su 0, 1 % TFA ir 0, 04 % C^ Ea; eliujuotos frakcijos buvo apjungiamos po SDS PAGE analizės.
[0235] Po C4 kolonėlės apjungtos frakcijos buvo praskie-džiamos ir diafiltruojamos prieš apytikriai 6 tūrius buferinio tirpalo Amicon YM aparatu arba naudojant kitas panašias ultrafiltracines membranas, kurių pra-laidumo riba yra molekulinės masės nuo 10 iki 30 kD. Gautas diafiltratas gali būti tiesiogiai naudojamas arba toliau sukoncentruojamas ultrafiltruojant. Į dia-filtratą/koncentratą buvo pridedama Tween-80 iki galu-tinės jo koncentracijos 0,01 %.
[0236] Visas diafiltratas/koncentratas arba jo dalis, atitinkanti 2 - 5 % apskaičiuoto kolonos tūrio, buvo chromatografuojama Sephacryl S-300 HR kolonėlėje (Pharmacia) , nulysvarintoje buferiniu tirpalu, kuriame buvo 0,01 % Tween-80. Frakcijos, kuriose buvo, SDS PAGE analizės duomenimis, neagregavęs ir proteoliškai nede-gradavęs, TPO baltymas, buvo apjungiamos. Šios apjungtos frakcijos buvo perfiltruotos ir saugomos 2 - 8°C temperatūroje.
[0237] 13. Transformavimo, TPO sintezės indukcijos mikroorganizmuose, išskyrimo, gryninimo ir TPO struktūros atstatymo būdai
[0238] E. coli TPO ekspresijos vektorių konstrukcija yra detaliai aprašyta Pvz. 21. Plazmidės pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 ir pMP202 buvo sukonstruotos ekspresuoti pirmąsias 155 TPO amino rūgštis po trumpos lyderinės sekos, kuri yra skirtinga skirtingose konstrukcijose. Lyderinė seka pirmiausia reikalinga efektyviai transliacijos iniciacijai ir greitam išvalymui. Plazmidės pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 yra sukurtos ekspresuoti pirmąsias 153 TPO amino rūgštis po iniciacijos metionino ir skiriasi tiktai kodonų panaudojime pirmoms šešioms TPO amino rūgštims, nors pMP251 plazmidė yra sukonstruota iš pMP210-l plazmidės, kur TPO C-galas yra prailgintas dviem amino rūgštimis. Visos aukščiau pateiktos plazmidės užtikrina didelį TPO viduląstelinės ekspresijos lygį E. coli, indukuojant triptofaninį pro-motorių. (Yansura, D.G.et.ai., Methods in Enzymology (Goeddel,' D.V.Ed. } 185:54-60, Academic Press, San Diego
[0239] [1990]). Plazmidės pMPl ir pMP172 yra tarpinės, konstruojant aukščiau aprašytas viduląstelinės ekspresijos plazmides.
[0240] Aukščiau aprašytos TPO. ekspresijos plazmidės buvo naudotos E.coli transformacijoje, atliekant ją CaCl2 temperatūrinio šoko metodu (Mandel, M. et. al. J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970]) ir kitas procedūras, apra-šytas Pavyzdyje 21. Transformuotos ląstelės buvo auginamos pirmiausia 37°C, kol kultūros optinis tankis (600 nm) pasiekia apie 2-3. Kultūra buvo skiedžiama ir, po auginimo aeruojant, buvo pridėta rūgšties. Tada kultūra vėl buvo auginama aeruojant dar 15 valandų, po to ląstelės buvo surenkamos centrifūguojant.
[0241] Pateiktos žemiau biologiškai aktyvaus, atstatytos struktūros žmogaus TPO ar jo fragmentų išskyrimo, gryninimo ir struktūros atstatymo procedūros yra aprašytos Pavyzdžiuose 22 ir 23 ir gali būti panaudotos bet kokio TPO varianto gavimui, įskaitant praplėstas N ir C galines formas. Kitos procedūros, tinkamos rekombinantinio ar sintetinio TPO struktūros atstatymui, gali būti randamos šiuose patentuose; Builder et al., JAV patentas 4511502 ; Jonės et. al., JAV patentas 4512922; Olson JAV patentas 4518526 ir Builder et.al., JAV patentas 4620948; aprašančiuose įvairių rekombinantinių baltymų, ekspresuojamų E. coli netirpioje formoje, gavimo ir struktūros atstatymo procesą.
[0242] Mikroorganizmas, toks kaip E. coli, ekspresuojan-tis TPO, koduojamą bet kokia tinkama plazmide, kultivuojamas sąlygomis, kai TPO produkuojamas netirpus "intarpiniuose kūneliuose". Ląstelės iš pradžių praplaunamos ląstelių ardymo buferiniu tirpalu. Paprastai apie 100 g ląstelių suspenduojama 10 kartų didesniame, nei ląstelių tūris, ardymo buferiniame tirpale (pvz., 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) su, pavyzdžiui, Polytron homogenizatoriumi, ir ląstelės nucentrifūguojamos esant 5000xg 30 min. Po to ląstelės ardomos, naudojant įpras-tą tam techniką: osmotinis šokas, apdorojimas ultragarsu, ciklinis slėgio sudarymas ar fermentiniais ir che-miniais būdais. Pavyzdžiui, praplautos, kaip aprašyta aukščiau, ląstelės gali būti suspenduojamos su homogenizatoriumi 10 tūriuose ląstelių ardymo buferiniame tirpale, ląstelių suspensija praleidžiama per LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Ine) ląstelių ardymo aparatą ar per Microfluidizer (Microfluidics International) aparatą, pagal gamintojų pateikiamas rekomendacijas. Nuosėdos, kuriose yra TPO, atskiriamos nuo skysčio ir praplaunamos tam tinkamu tirpalu. Pavyzdžiui, ląstelių lizato suspensija centrifūguojma 5000xg 30 min., suspenduojama ir vėl centrifūguojama, taip gaunamos at-plautų intarpinių kūnelių.nuosėdos. Taip atplautos nuo-sėdos gali būti panauddotos nebedelsiant arba laikomos užšaldytos (pvz., -70°C).
[0243] Netirpūs TPO intarpinai kūneliai soliubilizuojami buferiniame tirpale. Šio tirpalo sudėtyje yra chaotropinis agentas, paprastai šio tirpalo sudėtyje yra buferinis tirpalas, palaikantis šarminį pH, ir redukuojantis agentas padidinti monomerinio TPO išeigą. Chaotro-piniai agentai gali būti karbamidas, guanidino HC1, natrio tiocianatas. Geriausias chaotrotropinis agentas yra guanidino HC1. Chaotropinio agento koncentracija paprastai gali būti nuo 4 iki 9 M, geriausia, kai 6 - 8 M. Tirpalo, naudojamo soliubilizavimui, pH palaikomas nuo 7,5 iki 9,5, geriau, kai pH yra 8,0-9,0 ir geriausia, kai pH 8,0. Geriau, kai buferiniame tirpale yra redukuojantis agentas, kuris padeda formuotis monome-riniam TPO. Tinkamas redukuojantis agentas yra organinė medžiaga, kurioje yra laisvos tiolinės grupės (RSH). Tokie redukuojantys agentai gali būti: ditiotreitolis
[0244] (DTT), ditioeritritolis (DTE), merkaptoetanolis, gliutationas (GSH), cisteaminas ir cisteinas. Geriausiai tinkamas redukuojantis agentas yra ditiotreitolis (DDT) . Papildomai soliubilizacijos buferiniame tirpale gali būti silpnas oksiduojantis agentas (pvz., molekulinis deguonis) ir sulfito druska, kad susidarytų sulfitolizės metu monomerinis TPO. Šiame aprašyme gauto TPO-S-sulfonato struktūra vėliau atstatoma redoks buferiniame tirpale (pvz., GSH/GSSG), ir susidaro taisyklingos struktūros TPO.
[0245] TPO baltymas toliau gryninamas, naudojant, pavyz-džiui, centrifugavimą, gelfiltracinę chromatografiją ir atvirkščių fazių chromatografiją.
[0246] Iliustracijai pateikiamas pakankamos išeigos monomerinio TPO gryninimo pavyzdys. Intarpinių kūnelių nuo-sėdos suspenduojamos penkis kartus didesniame, nei
[0247] O
[0248] nuosėdos, soliubilizacijos buferiniame tirpale (20 mM Tris, pH 8, 'su 6-8 M guanidino ir 25 mM DTT) ir maišoma 1-3 valandas ar per naktį 4°C temperatūroje; taip gaunamas ištirpęs TPO baltymas. Galima naudoti ir dideles karbamido koncentracijas (6-8 M), bet šiuo atveju gaunamos mažesnės išeigos, lyginant su guanidinu. Po so-liubilizaci j os tirpalas nuskaidrinamas centrifūguoj ant 30000xg 30 min., surenkamas supernatantas, kuriame yra denatūruotas monomerinis TPO baltymas. Supernatantas chromatografuojamas (pratekėjimo greitis 2 ml/min.) Superdex 200 gelfiltracinėj e kolonėlėje (Pharmacia, 2,6x60 cm), baltymai eliujuojami su 20 mM Na fosfatiniu buferiniu tirpalu, pH 6,0, su 10 mM DTT. Surenkamos frakcijos, tarp 160 ir 200 ml, kuriose yra monomerinis denatūruotas TPO baltymas. Toliau TPO baltymas chromatografuoj amas pusiau preparatyvinėj e C4 atvirkščių fazių kolonėlėje (2x20 cm, VYDAC). Baltymų tirpalas užnešamas 5 ml/min greičiu ant nulygsvarintos 0,1 % TFA (trifluoracto rūgštimi) 30 % acetonitrile. Baltymai eliujuojami linijiniu acetonitrilo gradientu (30-60 %
[0249] per 60 min.). Išgrynintas redukuotas baltymas eliujuojamas, esant acetonitrilo koncentracijai ~50 %. Po to vykdomas taip išgryninto baltymo struktūros atstatymas ir gaunamas biologiškai aktyvus TPO baltymo variantas. C. TPO baltymo struktūros atstatymas, gaunant biologiškai aktyvią formą.
[0250] Po soliubilizacijos ir gryninimo biologiškai akty-vi TPO baltymo forma gaunama atstatant denatūruoto monomerinio TPO baltymo struktūrą redoks buferiniame tirpale. Didelio biologinio aktyvumo (pusė maksimalios Ba/F3 ląstelių stimuliacijos analizėje koncentracijos pasiekiama, esant koncentracijai iki ~3 pg/ml) TPO baltymą galima gauti, naudojant daug įvairių buferinių tirpalų, detergentų ir redoks sistemų. Bet daugeliu atvejų taisyklingos struktūros baltymo išeiga yra maža (<10 %). Gamybiniam procesui reikalinga, kad struktūros atstatymo išeiga būtų nemažesnė 10 %, geriau kad būtų 30-50 %, dar geriau - daugiau 50 %. Gali būti naudojama daugelis paviršiaus aktyvių medžiagų: Triton X-100, dodecil-p-maltozidas, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozilas, Tween 20 ir Tween 80, Zwitergent 3-14 ir kiti. Naudojant šias paviršiaus aktyvias medžiagas, gaunamas bent mažas kiekis taisyklingai atstatytos struktūros TPO baltymo. Iš šių paviršiaus aktyvių medžiagų geriausios yra CHAPS grupės (CHAPS ir CHAPSO). Jos yra geriausios struktūros atstatymo procesui, kadangi naudojant jas išvengiama baltymų agregacijos ir- netaisyklingų disul-fidinių tiltelių susidarymo. Geriausia naudoti didesnes, ■ nei 1 % CHAPS koncentracijas. Norint gauti didesnes proceso išeigas, reikalingas natrio chloridas, jo optimali koncentracija yr tarp 0,1 ir 0,5 M. EDTA (1-5 mM) reikalingas struktūros atstatymo buferiniame tirpale metalų jonais katalizuojamų oksidacijos procesų pašalinimui (ir baltymų agregacijos išvengimui), šie procesai stebimi kai kuriems preparatams. Didesnės, nei 15 % glicerino koncentracijos sudaro optimalias struk-tūros atstatymo sąlygas. Norint pasiekti didesnes proceso išeigas, labai svarbu, kad tirpale būtų ir oksiduotas ir redukuoti organiniai tioliniai junginiai (RSH) . Tinkamos redoks poros yra: merkaptoetanolis, gliutationas (GSH), cisteamidas, cisteinas ir šiuos junginius atitinkačios oksiduotos formos. Geriausios redoks poros yra gliutationas (GSH) - oksiduotas gliutationas (GSSG) arba cisteinas - cistinas. Pati geriausia pora yra gliutationas (GSH) - oksiduotas gliutationas (GSSG). Paprastai gaunamos didesnės proceso išei-gos, kai oksiduotos ir redukuotos formos molinis santykis yra lygus ar didesnis, nei vienetas. TPO preparatų struktūros atstatymui optimalus tirpalo pH yra nuo 7,5 iki ~9. Organinių tirpiklių (pvz., etanolio, acetonitrilo, metanolio) toleruojama koncentracija yra 10-15 %, arba mažesnė. Didinant organinių tirpiklių koncentra-ciją, didėja baltymo formų su netaisyklingais disulfidiniais tilteliais. Geriausia naudoti TRIS arba fosfatinius buferinius tirpalus. Struktūros atstatymo procesą atliekant 4°C temperatūroje, gaunama didesnė taisyklingos struktūros baltymo išeiga.
[0251] TPO preparatams, grynintiems per pirmąją C4 kolo-nėlę, struktūros atstatymo proceso tipiška išeiga yra 40-60 % (skaičiuojant nuo redukuoto ir denatūruoto TPO baltymo kiekio). Biologiškai aktyvūs preparatai gali būti gaunami, kai struktūros atstatymo procese naudojami mažiau išgryninti preparatai (pvz., po Superdex 200 gelfiltracijos ar po intarpinių kūnelių ekstrak-cijos), nors šiais atvejais šio proceso išeiga būna mažesnė dėl didelio baltymo išsėdimo į nuosėdas ir dėl priemaišinių baltymų trukdymo.
[0252] Kadangi TPO baltymo sudėtyje yra keturios cisteino liekanos, tai galimi trys skirtingi disulfidinių tilte-
[0253] 1 variantas: disulfidinis ryšys tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanos 2 variantas: disulfidinis ryšys tarp 1-2 ir 3-4 cisteino liekanos 3 variantas: disulfidinis ryšys tarp 1-3 ir 2-4 cisteino liekanos
[0254] Pradinių struktūros atstatymo sąlygų tyrimuose buvo naudojama keletas frakcijų TPO baltymo po chromatografijos atvirkštinių fazių kolonėlėje C4. Tik viena frakcija pasižymėjo žymesniu biologiniu aktyvumu, tiriant su BA/F3 ląstelėmis. Vėliau struktūros atstatymo sąlygos buvo optimizuojamos. Šiomis sąlygomis neteisingos struktūros baltymo kiekis buvo mažesnis, nei 10-20 % nuo bendro gauto monomerinio TPO kiekio.
[0255] Biologiškai aktyvaus TPO baltymo disulfidinių tiltelių vietos yra tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanos (liekanų numeravimas pateiktas pradedant nuo baltymo N galo), tai buvo nustatyta remiantis biologiniu aktyvumu, masspektroskopij a ir analizuojant baltymo amino rūgščių liekanų seką baltymo N gale. Tai sutampa su žinomomis disulfidinių jungčių vietomis eritropoetino molekulėje.
[0256] D. Rekombinantinio atstatytos struktūros TPO biologinis aktyvumas
[0257] Atstatytos struktūros išgrynintas TPO pasižymėjo aktyvumu kaip in vitro, taip ir in vivo tyrimuose. Pavyzdžiui, tiriant BA/F3 ląstelėse buvo nustatyta, kad pusė maksimalios timidino įsijungimo į BA/F3 ląsteles stimuliacijos buvo pasiekiama su 3,3 pg/ml(0,3 pM) TPO (Met-1 1-153). Mėginius tiriant ELISA, pagrįsta sąveika su mpl receptoriumi, pusė maksimalaus aktyvumo pasiekiama esant 1,9 ng/ml (120 pM) TPO koncentracijai. Normaliuose ir mielosupresuotuose gyvūnuose, apšvitin-tuose beveik letalia Rentgeno spindulių doze, TPO(Met-1 1- 153) labai efektyviai stimuliavo naujų trombocitų susidarymą ( aktyvumas buvo pastebimas net esant dozei - 30 ng/ pelei) . Panašūs biologiniai aktyvumai buvo nustatyti ir kitiems, atstatytos struktūros pagal aprašytas procedūras ( žiūr. Fig. 25, 26 ir 28), TPO variantams.
[0258] 14. Trombopoetino aktyvumo matavimo metodai Trombopoetinis aktyvumas gali būti išmatuotas įvairiais metodais, tarp jų: Ba/F3 rapl ligando metodu, aprašytu Pavyzdyje 1, in vivo pelių atsakomosios trom-, bocitozės metodu, trombocitų paviršiaus antigeno indukcijos metodu, kuriame šis antigenas imunologinės ana-lizės būdu (anti-GPIIbUIa) matuojamas žmogaus leukemijos megakarioblastinės linijos (CMK) ląstelių pavir-šiuje (žiūr. Sato et al., Brit. J. Heamatol., 72:184-190 [1989])(taip pat žiūr. suspensinės megakariopoezės metodą, aprašytą Pavyzdyje 4) ir poliploidizacijos indukcijos metodu, naudojant megakarioblastų ląstelių liniją (DAMI) (žiūr. Ogura et ai., Blood, 72( l):49-60
[0259] [1988]). Megakariocitų brendimas iš nesubrendusių
[0260] ląstelių, kurių dauguma nesintetina DNR, į morfolo-giškai identifikuojamus megakariocitus yra procesas, apimantis citoplazminių organelių ir membraninių antigenų (GPIIbIIIa) atsiradimą, endoreplikaciją ir trombocitų formavimąsi, kaip aprašyta išradimo pagrin-dime. Faktorius, specifiškai skatinantis megakariocitų atšakos ląstelių brendimą (pvz., mpl ligandas), turėtų sukelti nesubrendusiuose megakariocituose bent keletą iš paminėtų pasikeitimų, kurių pasekmė yra trombocitų formavimasis ir trombocitopenijos palengvėjimas. Tokiu būdu, buvo paruošti metodai, įgalinantys matuoti šių parametrų pasirodymą nesubrendusių megakariocitų ląste-lių linijose, pvz., CMK ir DAMI ląstelėse. CMK analizės metodas (Pavyzdys 4) nustato specifinio trombocitų markerio GPIIbIIIa atsiradimą ir trombocitų atskilimą. DAMI analizės metodas (Pavyzdys 15) matuoja endorepli-
[0261] kaciją, kadangi padidėjęs ploidiškumas yra būdingas subrendusių megakariocitų bruožas. Atpažįstamų mega-kariocitų ploidiškumo skaičiai yra 2N, 4N, 8N, 16N, 32N etc. In vivo pelių atsakomosios trombocitozės metodu (Pavyzdys 16) galima parodyti, kad testuojamojo junginio (čia mpl ligando) vartojimas sukelia trombocitų skaičiaus padidėjimą.
[0262] TPO aktyvumui matuoti buvo paruošti dar du in vitro metodai. Pirmasis metodas yra kinazės receptoriaus aktyvacijos (KIRA) ĖLISA. Šiame metode CHO ląste-lės transfekuojamos mpl-Rse chimera ir ELISA pagalba matuojamas Rse tirozino liekanų fosforilinimas po mpl ligando sąveikos su chimerinės molekulės mpl dalimi (žiūr. Pavyzdį 17). Antrasis metodas yra ELISA, pagrįs-ta mpl ligando sąveika su receptoriumi. ELISA plokšte-lėje imobilizuoti triušio antikūnai prieš žmogaus IgG sąveikauja su žmogaus chimeriniu receptoriumi mpl- IgG, kuris savo ruožtu prijungia mpl ligandą, esantį analizuojamame mėginyje. Prisijungusiam mpl ligandui nustatyti naudojami triušio polikloniniai antikūnai prieš mpl ligandą (TPO155) , žymėti biotinu ir streptavidin-peroksidazė, kaip aprašyta Pavyzdyje 18. 15. Normalių ir subletaliai apšvitintų pelių invivo biologinis atsakas į gydymą ^ PO Normalioms ir subletaliai apšvitintoms pelėms buvo leidžiamas sutrumpintas ir pilno ilgio TPO, išskirtas iš kinietiškų žiurkėnių kiaušidžių ląstelių (CHO,) , E. coli ir žmogaus embrioninių inkstų ląstelių (293). Abi TPO formos, produkuotos visuose trijose šeimininkuose, stimuliavo trombocitų produkciją pelėse, tačiau geriau-sią in vitro atsaką sukelia pilno ilgio TPO, išskirtas iš CHO ląstelių. Šie rezultatai rodo, kad teisingas C galo domeno glikozilinimas gali būti svarbus veiksnys, siekiant optimalaus aktyvumo in vivo.
[0263] EPO domeno "Met" forma (Met -1 padėtyje ir pirmosios 153 žmogaus TPO amino rūgščių liekanos), produkuo-jama E . coli (žiūr. Pavyzdį 23), buvo leidžiama kasdien normalioms C57 B6 pelių patelėms, kaip pateikta Fig. 25A, 25B ir 25C aprašymuose. Šie piešinėliai rodo, kad neglikozilinta sutrumpinta TPO forma, pagaminta E. coli ir turinti atstatytą, kaip aprašyta aukščiau, baltymo struktūrą, stimuliuoja trombocitų produkciją normaliose pelėse apie du kartus ir neturi įtakos raudonųjų bei baltųjų kraujo ląstelių populiacijoms. ,
[0264] Ta pati TPO forma, kasdien leista subletaliai apšvitintoms (137Cs) C57 B6 pelių linijos patelėms, kaip pateikta Fig. 26A, 26B ir 26C aprašymuose, stimuliavo trombocitų kiekio atstatymą ir sumažindavo kritinį lygį, bet neturėjo jokio efekto eritrocitų ir leukocitų populiacij oms.
[0265] Pilno ilgio TPO forma, pagaminta CHO ląstelėse ir leista normalioms C57 B6 pelių linijos patelėms, kaip pateikta Fig. 27A, 27B ir 27C aprašymuose, sukėlė normaliose pelėse trombocitų produkcijos padidėjimą penkis kartus,neveikiant eritrocitų ir leukocitų populiacijas.
[0266] (c) CH0-rhTP0332; E . coli—rhTPO(Met-1,153) / 293-rhTP0332 ir E. coli-rhTPOi55
[0267] Buvo sudarytos priklausomybės nuo dozės kreivės, leidžiant normalioms pelėms rhTPO, pagamintą skirtingose CHO ląstelių linijose (CH0-rhTP0332; E.coli-rhTPO(Met 1, 153) } 2 93-rhTP0332 ir E. coli—rhTPOiss) 1 kaip pateikta Fig. 28 aprašyme. Šis piešinėlis rodo, kad visos analizuotos molekulių formos stimuliavo trom-bocitų produkciją, tačiau pilno ilgio forma, pagaminta CHO ląstelėse, turėjo dižiausią aktyvumą in vivo. (d) CHO-rhTPOi53, CHO-rhTPO sutrumpintas" ir CHO-rhTPOs32 Priklausomybės nuo dozės kreivės buvo taip pat sudarytos, leidžiant normalioms pelėms įvairias rhTPO formas, pagamintas CHO ląstelėse (CH0-rhTP0i53, CHO-rhTPO- sutrumpintas" ir CH0-rhTP0332) , kaip pateikta Fig. 29 aprašyme. Šis piešinėlis rodo, kad visos analizuotos molekulės formos stimuliuoja trombocitų produkciją, bet pilno ilgio 70 kD forma pasižymi didžiausiu aktyvumu in vi vo.
[0268] 16. mpl ligando ir jo variantų rekombinantinės gamybos pagrindai
[0269] Geriausia, kai mpl ligandas yra gaminamas standar-tinėmis rekombinantinėmis procedūromis, kurios apima mpl ligando polipeptido produkciją, kultivuojant ląste-les, transfekuotas taip,' kad galėtų ekspresuoti mpl ligandą, koduojamą nukleino rūgštimi (paprastai ląste-lės transformuojamos ekspresijos vektoriumi), ir polipeptido išskyrimą iš ląstelių. Tačiau, galima įsivaiz-duoti kitus mpl ligando gamybos būdus, naudojant homo-loginės rekombinacijos metodą arba įterpiant kontro-liuojančius elementus į ląsteles, turinčias mpl ligandą koduojančią DNR. Pavyzdžiui, stiprus promotorius/sustiprintojas arba supresorius, arba egzogeninis trans-kripciją moduliuojantis elementas gali būti įterpti į norimos ląstelės-šeimininkės genomą tokiame atstume nuo DNR, koduojančios mpl ligando polipeptidą, sekos ir tokioje orientacijoje, kad galėtų įtakoti šios DNR transkripciją. Kontroliuojantis elementas nekoduoja mpl ligando; šį polipeptidą koduoja DNR, priklausanti ląstelei-šeimininkei. Toliau ląstelės tikrinamos, siekiant atrinkti, priklausomai nuo tikslo, ląsteles, gaminančias receptorinį polipeptidą, aprašomą šiame išradime, arba ląsteles, kuriose ekspresijos lygis yra padidintas arba sumažintas.
[0270] Taigi, šiame išradime pateikiamas mpl ligando gamybos būdas, kuriame: į ląstelių, turinčių mpl ligandą koduojančią nukleino rūgšties molekulę, genomą, įterpia transkripciją moduliuojantį elementą, tokiu atstumu ir tokioje orientacijoje, kad galėtų įtakoti transkripci-ją; toliau ląsteles, turinčias transkripcijos modu-liuojantį elementą ir nukleino rūgšties molekulę, kul-tivuoja. Išradime taip pat aprašoma ląstelė-šeimininkė, turinti endogeninę, mpl ligandą koduojančią nukleino rūgšties molekulę, funkcionaliai sujungtą su egzogeni-nėmis reguliuojančiomis sekomis, kurias gali atpažinti ląstelė-šeimininkė.
[0271] A. mpl ligando polipeptidą koduojančios DNR išskyrimas
[0272] DNR, koduojančią mpl ligando polipeptidą, galima išskirti iš bet kurios kDNR bibliotekos, paruoštos iš audinių, kuriuose, kaip tikimasi, vyksta pakankama mpl ligando iRNR ekspresija, mpl ligando geną galima iš-skirti iš genominės DNR bibliotekos, o taip pat sintetinant in vitro oligonukleotidų seką, pagal pilną nukleotidų ar amino rūgščių liekanų seką.
[0273] Bibliotekos tikrinamos naudojant pavyzdžius, suge-bančius identifikuoti norimą geną ar to geno koduojamą baltymą. Tikrinant kDNR ekspresijos bibliotekas, tinkami pavyzdžiai yra monokloniniai ar polikloniniai antikūnai, kurie atpažįsta ir specifiškai sąveikauja su mpl ligandu. Tikrinant kDNR bibliotekas, tinkami pavyz-džiai yra 20-80 bazių ilgio oligonukleotidai, koduojantys žinomas ar spėjamas mpl ligando kDNR dalis, pri-klausančias tai pačiai ar skirtingoms rūšims; ir/arba komplementarios arba homologinės kDNR arba jų fragmentai, koduojantys tą patį arba panašų geną. Tinkami pavyzdžiai genominės DNR bibliotekos tikrinimui apima, bet tuo neapsiriboja: oligonukleotidus, kDNR ar jų fragmentus, kurie koduoja tą patį ar panašų geną, ir/arba homologines genomines DNR ar jų fragmentus. kDNR ar genominės bibliotekos tikrinamos, naudojant pasirinktą pavyzdį pagal standartines procedūras, aprašytas Sambrook et al., supra, skyriuose 10-12.
[0274] Kitas būdas išskirti mpl ligandą koduojantį geną yra PCR metodas, aprašytas Sambrook et al., supra, skyriuje 14. Šis metodas reikalauja, kad būtų naudojami oligonukleotidiniai pavyzdžiai, kurie hibridizuojasi su DNR, koduojančia mpl ligandą. Oligonukleotidų pasirin-kimo strategijos aprašytos žemiau.
[0275] Geriausias šio išradimo įgyvendinimo būdas yra panaudoti kruopščiai pasirinktas oligonukleotidines sekas kDNR bibliotekų, pagamintų iš įvairių audinių, geriau žmogaus ar kiaulės inkstų (embrionų ar suau-gusių) ar kepenų ląstelių, tikrinimui. Pavyzdžiui, žmogaus embriono kepenų ląstelių linijos kDNR bibliotekos tikrinamos, naudojant oligonukleotidinį pavyzdį. Taip pat ir žmogaus genominės bibliotekos gali būti tikrinamos oligonukleotidiniu pavyzdžiu.
[0276] Oligonukleotidų sekos, pasirinktos kaip pavyz-džiai, turi būti pakankamo ilgio ir pakankamai spe-cifinės, siekiant sumažinti iki minimumo tariamai teigiamų signalų atsiradimą. Paprastai nukleotidinė seka (sekos) yra parenkamos iš tokių mpl ligandą koduojačios sekos regionų, kur kodonų įvairovė yra mažiausia. Oligonukleotidai gali skirtis nuo pradinės sekos vienoje ar keliose pozicijose. Naudoti išsigi-musius oligonukleotidus yra labai svarbu, kai tikrinamos kitų rūšių bibliotekos, kur kodonų naudojimas nežinomas.
[0277] Oligonukleotidai turi būti pažymimi, kad. būtų galima po DNR hibridizacijos, tikrinant bibliotekas, juos detektuoti. Geriausias žymėjimo būdas yra panaudoti ATP (pvz., y32P) ir polinukleotidkinazę oligonukleotido 5' galo žymėjimui. Tačiau oligonukleotidų
[0278] žymėjimui galima naudoti ir kitus metodus, tarp jų ir žymėjimą biotinu ar fermentu ir kitus.
[0279] Svarbiausia mpl ligandą koduojanti nukleino rūgš-tis yra ta, kuri koduoja pilno ilgio mpl ligando poli-peptidą. Keliuose šio išradimo palankiausiuose variantuose naudojama nukleino rūgšties seka, apimanti ir natyvaus mpl ligando signalinę seką. Nukleino rūgštis, turinti visą baltymą koduojančią seką, yra gaunama tikrinant pasirinktą kDNR genominę biblioteką, naudojant išvestines amino rūgščių liekanų sekas.
[0280] B. Natyvaus mpl ligando amino rūgščių liekanų sekų variantai
[0281] mpl ligando variantai su skirtingomis amino rūgš-čių liekanų sekomis buvo gaunami, įterpiant reikalingus nukleotidus į mpl ligandą koduojančią DNR arba sintetinant in vitro norimą mpl ligando polipeptidą. Tokie variantai, pavyzdžiui, yra formos su delecijomis ar intarpais kiaulės mpl ligando amino rūgščių liekanų sekoje. Pavyzdžiui, N gale subrendusio viso ilgio mpl ligando dalis yra pašalinama proteolize, kaip in vivo, taip ir in vitro arba klonuojant ir ekspresuojant fragmentą DNR, koduojančios viso ilgio mpl ligandą, siekiant gauti biologiškai aktyvų variantą. Bet kokios delecijų, intarpų ar pakeitimų kombinacijos yra padaromos tam, kad būtų galima gauti galutinę konstrukciją, kuri pasižymėtų norimu biologiniu aktyvumu. Amino rūgščių liekanų pakeitimai gali būti padaromi mpl ligando postransliacijos procese, kaip antai, pakei-čiant glikozilinimo skaičių ir vietą. Konstruojant mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantus, taškinės mutacijos vieta ir mutacijos pobūdis priklauso nuo norimų pakeisti mpl ligando charakteristikų (charakte-ristikos). Taškinės mutacijos gali būti daromos atskirai arba kelios kartu, pavyzdžiui, (1) pirmiausia pa-
[0282] keičiant konservatyvia amino rūgščių liekana, o po to padaromas radikalesnis pakeitimas, kuris priklauso nuo pasirinkto tikslo, (2) pašalinant proteinazės skėlimo vietą ar (3) įterpiant panašias amino rūgščių liekanas ar skirtingas intarpo kaimyninėms liekanoms arba atliekant 1-3 punkto kombinacijas.
[0283] Metodas identifikuoti tam tikrų mpl ligando polipeptido amino rūgščių liekanų ar jų regionų geriausioms mutagenezės vietoms yra vadinamas "alanino skanavimo mutageneze", aprašyta Cunningham ir Wells, Science, 244:1081-1085 [1989]. Šiame metode taikinio amino rūgš-čių liekana ar jų grupė yra identifikuojama (t.y., amino rūgščių liekana, kuri turi krūvį: Arg, Asp, His, Lys ir Glu) ir pakeičiama bet kokia, bet geriau netu-rinčia krūvio arba turinčia neigiamą krūvį amino rūgš-čių liekana (geriausiai alaninu ar polialaninu), siekiant pakeisti sąveiką tarp amino rūgščių liekanų ir vandens molekulių, esančių aplink baltymą, ląstelės viduje ar ląstelės išorėje. Domenai, kurie pasižymi funkcionaliu jautrumu pakeitimams, yra tobulinami, įterpiant papildomus ar kitus variantus prie pakeitimo vietos arba pakeitimo vietoje. Taigi, kai amino rūgščių liekanų variantų intarpų vieta nustatyta, mutacijos pobūdis iš esmės gali būti neapibrėžtas. Pavyzdžiui, siekiant optimizuoti mutaciją pasirinktoje vietoje, alanino skanavimas ar atsitiktinė mutageneze vykdoma pasirinktame kodone ar regione ir atliekamas ekspre-suotų mpl ligando variantų tikrinimas, atrenkant optimalias kombinacijas su norimu aktyvumu.
[0284] Yra du pagrindiniai kintamieji, konstruojant amino rūgščių liekanų sekų variantus: mutacijos vieta sekoje ir mutacijos prigimtis. Pavyzdžiui, mpl ligando polipeptido variantai apima amino rūgščių liekanų sekos mpl ligando variantus, kurie gali būti gamtinio mpl ligando
[0285] t
[0286] aleliniai variantai (jiems nereikalingi pakeitimai DNR, koduojančiai mpl ligandą) arba mutantinės formos, pada-
[0287] rytos mutuojant DNR. Šie variantai gali būti aleliniais ar variantais, kurie neaptinkami gamtoje. Paprastai mutagenezės vieta ir pobūdis priklauso nuo mpl ligando norimų modifikuoti charakteristikų.
[0288] Amino rūgščių liekanų sekoje delecijos paprastai atliekamos nuo 1 iki 30 liekanos, geriausia, kai jos atliekamos nuo 1 iki 10 amino rūgščių liekanos, ir paprastai atliekamos šalia esančių liekanų delecijos. Be to, amino rūgščių liekanų sekos delecijos mpl ligande gali būti dalis ar visas glikoproteino C galo domenas. Amino rūgščių liekanų sekos delecijos gali apimti - vieną ar kelias pirmųjų 6 amino rūgščių liekanas iš subrendusio baltymo C galo. Amino rūgščių liekanų delecijos gali apimti vieną ar kelias amino rūgščių liekanas, esančias viename ar keliuose kilpos regione, kuris yra tarp "spiralinių klosčių". Gretimos delecijos paprastai daromos su lyginiu amino rūgščių liekanų skaičiumi, bet, priklausomai nuo tikslo, galimos ir vienos ar nelyginio skaičiaus amino rūgščių liekanų skaičiaus delecijos. Delecijos gali būti padaromos tose mažai homologiškų mpl ligandų vietose, kurios pasižymi didžiausiu sekos identiškumu, tokiu būdu modifikuojant žmogaus mpl ligando aktyvumą. Labiau tikėtina, kad delecijos žinduolių mpl ligando polipeptide, padarytos tose srityse, kurios yra homologiškos kitoms žinduolių mpl ligandų sekoms, žymiau pakeis mpl ligando biolo-ginį aktyvumą. Nuoseklių delecijų skaičius gali būti pasirenkamas taip, kad nebūtų suardyta mpl ligando baltymo tretinė struktūra, pvz., p-klostė ar a-spiralės.
[0289] Amino rūgščių liekanų intarpai, įskaitant prijun-gimą prie N ir/arba C baltymo galo, gali būti nuo vienos amino rūgščių liekanos iki kelių šimtų amino rūgš-čių liekanų. Intarpų dydis sekos viduje (t.y., intarpai subrendusio mpl ligando amino rūgščių liekanų sekoje); gali būti apie 1-10 amino rūgščių liekanų, geriau, kai 1- 5, geriausiai - nuo 1 iki 3 liekanų. Geriausias pavyzdinis mpl ligando ar jo fragmento suliejimas yra su kitu citokinu ar jo fragmentu. Intarpų prie N baltymo galo pavyzdžiai apima subrendusį mpl ligandą su N gale esančia metionino liekana, tiesioginės subrendusio mpl ligando ekspresijos rekombinantinėse kultūrose artefaktus, baltymus, kai prie subrendusio mpl ligando N galo prijungiamos baltymo N gale esančios heterolo-ginės signalinės sekos, kurios įgalina rekombinantinius producentus sekretuoti subrendusį mpl ligandą. Šios signalinės sekos gali būti gaunamos iš ląstelių- šei-mininkų, taigi, naudojamos signalinės sekos yra homo-logiškos ląstelės- šeimininko sekoms. Tinkamos signa-linės sekos yra STII ar lpp iš E. coli, alfa faktorius iš mielių ir virusiniai signalai, tokie kaip žinduolių ląstelių herpes gD.
[0290] Kiti intarpų variantai, kai prie mpl ligando N arba C galo prijungiami imunogeniški polipeptidai ( t. y., svetimi ląstelei- šeimininkui) yra šie: bakteriniai polipeptidai, tokie kaip beta- laktamazė arba fermentas, koduojamas E. coli trp lokuse, ar mielių baltymai; suliejant su mpl ligando C galu baltymus, turinčius ilgą gyvavimo pusperiodį, tokius kaip imuno-globulinų pastovūs regionai ( arba kiti imunoglobulinų regionai), albuminas ar feritinas, kaip aprašyta patente W0 89/ 02922, publikuotame 1989. 04. 06.
[0291] Trečia variantų grupė yra amino rūgščių liekanų pakeitimo variantai. Šiuose variantuose bent viena amino rūgščių liekanų mpl ligando molekulėje yra pakei-čiama skirtinga amino rūgščių liekana. Įdomiausios mutagenezės vietos yra mpl ligando aktyvusis centras ( centrai) ir vietos, kur amino rūgščių liekanos, kurios aptinkamos ir kituose analoguose, yra labai skirtingos pagal šoninės grandinės tūrį, krūvį ar hidrofobiškumą, bet tose srityse yra didelė homologija tarp įvairių mpl ligandų ir/ arba tarp įvairių gyvūnų rūšių mpl ligandų analogų.
[0292] Kitos įdomios vietos yra tos, kuriose randamos identiškos tam tikros ypatingos mpl ligando amino rūgščių liekanos įvairiuose mpl ligando šeimos atsto-vuose ir/ arba viename ligande įvairiose gyvūnų rūšyse. Šios vietos, ypatingai tos, kurios pakliūva mažiausiai į trijų kitų identiškų konservatyvių vietų sekas, yra pakeičiamos santykinai konservatyviomis amino rūgščių liekanomis. Tokie konservatyvūs pakeitimai yra pateikti Lentelėje 3. Jei šie pakeitimai turi įtakos biologiniam aktyvumui, tai padaromi dar žymesni pakeitimai, pava-dinti pavyzdiniais pakeitimais Lentelėje 3, arba padaromi pakeitimai, aprašyti žemiau, nurodant amino rūgš-čių klases, ir gauti produktai patikrinami.
[0293] Žymios mpl ligando funkcijos ar imunogeniškumo modifikacijos atliekamos, atrenkant pakeitimus, kurie turi didžiausią įtaką (a) polipetido grandinės struk-
[0294] tūrai pakeitimo vietoje, pavyzdžiui, p- klosčių ar a-spiralių konforraacij ai, ( b) krūviui ar hidrofobiškumui pakeitimo vietoje ar ( c) šoninės grandinės užimamam tūriui. Gamtinės amino rūgščių liekanos yra suskirs-tomos į grupes pagal bendras šoninių radikalų savybes: ( 1) hidrofobinės: norleucinas, Met, Ala, Vai,
[0295] Leu, Ile;
[0296] ( 2) neutralios hidrofilinės: Cys, Ser, Thr;
[0297] ( 3) rūgštinės: Asp, Glu;
[0298] ( 4) bazinės: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
[0299] ( 5) liekanos, turinčios įtakos grandinės
[0300] Atlikus pakeitimą nekonservatyvoje sekos vietoje, gali prireikti pakeisti vienos klasės narį kitos klasės nariu. Tokios pakeistos liekanos gali būti įterptos konservatyviose sekos pakeitimo vietose arba, dar geriau, nekonservatyviose vietose.
[0301] Viename išradimo variante siekiama inaktyvuoti vieną ar kelias proteinazių skėlimo vietas, esanačias molekulėje. Šios vietos nustatomos, peržiūrint baltymo amino rūgščių liekanų seką, pvz., nustatant tripsino skėlimo vietas, ieškoma arginino ar lizino liekanų. Kai proteinazių skėlimo vietos yra nustatomos, jos padaromos nejautriomis proteolitiniam skėlimui, pakeičiant atitinkamą amino rūgščių liekaną į kitą, geriausiai į bazinę, pvz., glutaminą arba į hidrofobinę, pvz., seri-ną; taip amino rūgščių liekana gali būti pašalinta iš sekos arba greta skėlimo vietos gali būti įterpiama prolino liekana.
[0302] Kitame išradimo variante visos metionino liekanos, išskyrus pirmąją metionino lekaną signalinėje sekoje, arba bet kuri iš trijų amino rūgščių liekanų, esančių prieš arba po tokios metionino liekanos, pakei-čiamos į kitas liekanas (pagal Lentelę 3) arba pašali-narnos. Taip pat i tokias vietas gali būti įterpiama 1 - 3 papildomos amino rūgščių liekanos.
[0303] Bet kokia cisteino liekana, kuri neturi įtakos taisyklingai mpl ligando konformacijai, gali būti pakeičiama, dažniausiai serinu, tam, kad būtų pagerintas molekulės atsparumas oksidacijai ir taip pat iš-vengta netaisyklingų disulfidinių tiltelių susidarymo. Buvo nustatyta, kad 1 ir 4 EPO domeno cisteino liekanos, skaičiuojant nuo N baltymo galo, būtinos taisyklingos konformacijos susidarymui, o 2 ir 3 - šiam procesui neturi įtakos. Taigi 2 ir 3 EPO domeno cisteino liekanos gali būti pakeistos.
[0304] Nukleino rūgščių molekulės, koduojančios mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantus, gali būti pagamintos įvairiais žinomais metodais. Šie metodai apima, bet tuo neapsiriboja, nukleino rūgšties išskyrimą iš gamtinių šaltinių (natūralių amino rūgščių liekanų sekos varianto atvejais) arba nukleotidų sąly-gojamos (arba kryptingos) mutagenezės, PCR mutagenezės ir kasečių mutagenezės būdais gautus mutantinius variantus, paruoštus iš anksčiau pagamintų variantinių arba laukinio tipo mpl ligando polipeptidų.
[0305] Oligonukleotidų sąlygojama mutagenezė yra geriausias būdas gauti mpl ligando DNR variantus su amino rūgščių liekanų pakeitimais, delecijomis ar intarpais. Šis metodas plačiai žinomas ir aprašytas (Adelman et al., DNR, 2:183 [1983]. Reziumuojant, mpl ligando DNR pakeičiama, hibridinant oligonukleotidus, koduojančius norimą mutaciją, su matrica, kuri yra plazmidės arba bakteriofago, turinčio nepakeistą ar natyvią mpl ligando DNR seką, viengrandė forma. Po hibridizacijos DNR polimerazės pagalba sintetinama visa antroji komplementari grandinė, kurioje yra ir oligonukleotinis pradmuo, koduojantis norimus mpl ligando DNR pakeitimus.
[0306] Paprastai naudojami ne trumpesni nei 25 bazių ilgio oligonukleotidai. Optimaliame nukleotide abiejuose galuose turi būti 12 - 15 nukleotidų, visiškai komple-mentarių matricai, o mutaciją koduojantys nukleotidai lieka sekos vidury. Tai užtikrina teisingą oligonukleotido hibridizaciją su viengrande DNR matrica. Oligonukleotidai sintetinami žinomais būdais, kurie aprašyti Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:57 65 [ 1978].
[0307] DNR matricos gali būti pagamintos iš vektorių, sukonstruotų bakteriofago M13 pagrindu, ( tinkami komerciniai vektoriai yra M13mpl8, M13mpl9) arba tokių vek-torių, kurie turi viengrandžio fago replikacijos iniciacijos vietą, kaip aprašyta Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 [ 1987]. DNR, kurioje norima padaryti mutaciją, įterpiama į vieną tokį vektorių ir tokiu būdu pagaminama viengrande matrica. Viengrandžių matricų paruošimas aprašytas Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( Cold Sring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) skyriai 4. 21 - 4. 41.
[0308] Kitas būdas pagaminti viengrandę DNR matricą yra dvigrandės plazmidės ar kitos dvigrandės DNR denatū-racija standartiniais metodais.
[0309] Siekiant pakeisti natyvią DNR seką (pvz., tam, kad pagaminti amino rūgščių liekanų sekos variantus), oligonukleotidas hibridinamas su viengrande matrica, esant tinkamoms hibridizacijos sąlygoms. Po to pridedamas DNR polimerizaciją katalizuoj antis fermentas, paprastai DNR polimerazė I, Klenow fragmentas, siekiant susintetinti matricai komplementarią grandinę, naudojant oligonukle-otidą, kaip pradmenį. Tokiu būdu susidaro heterodup- . leksas, kuriame viena grandinė koduoja mutantinę mpl ligando formą, o kita (matrica) koduoja natyvią nepa-žeistą mpl ligando seką. Šis heterodupleksas toliau transformuojamas į tinkamą šeimininką, dažniausiai į prokariotinę ląstelę, pvz., E coli JM101. Kai ląstelės paauga, jos išsėjamos į Petri lėkšteles su agarizuota terpe ir išaugusios kolonijos tikrinamos, naudojant 32P žymėtą oligonukleotidinį pradmenį, siekiant identifikuoti bakterijų kolonijas, turinčias mutuotą DNR. Mutuota sritis toliau išskiriama ir įterpiama į vek-torių, tinkamą baltymo produkcijai, paprastai tai būna ekspresijos vektorius, dažniausiai naudojamas pasirinkto šeimininko transformacijai.
[0310] Aukščiau aprašytas metodas gali būti modifikuo-jamas taip, kad susidarytų homodupleksinė molekulė, kurioje abi grandinės turi mutaciją (mutacijas). Šios metodo modifikacijos tokios: Viengrandis oligonukleotidas hibridinamas su viengrande matrica, kaip aprašyta aukščiau. Į trijų dezoksiribonukleotidtrifosfatų: dezoksiriboadenozintrifosfato (dATP), dezoksiriboguano-zintrifosfato (dGTP) ir dezoksiribotimidlntrifosfato (dTTP) mišinį įdedamas modifikuotas tiodezoksiribocito-zintrifosfatas (dCTP-[aS]) (Amersham Corparation) . Šis mišinys pridedamas prie matricos ir oligonukleotido komplekso. Įdėjus į tokį mišinį DNR polimerazę, sintetinama antroji DNR grandinė, komplementari matricai, išskyrus mutuotus nukleotidus. Be to naujai susintetin-toje grandinėje vietoj dCTP bus dCTP-(aS), kuris apsau-go nuo skėlimo restrikcijos endonukleazėmis.
[0311] Po to matrica, esanti dvigrandžio heteroduplekso sudėtyje, skeliama tinkamu restrikcijos fermentu ir matricos dalis, atitinkanti norimos mutacijos vietą, yra suskaldoma ExoIII nukleaze arba kita tinkama nukleaze. Reakcija sustabdoma ir tokiu būdu susidaro dalinai viengrande molekulė. Toliau, pridėjus DNR polimerazę, visus keturis dezoksiribonukleotidtri-fosfatus, ATP ir DNR ligazę, formuojamas dvigrandis DNR homodupleksas. Šis homodupleksas toliau transformuojamas į tinkamą šeimininką, pvz., E. coli JM101, kaip aprašyta aukščiau.
[0312] DNR, koduojanti mpl ligando mutantus su vienos ar kelių amino rūgščių liekanų pakeitimais, gali būti sukonstruota vienu iš keleto būdu. Jei norimos pakeisti amino rūgščių liekanos yra greta polipeptidinėj e gran-dinėje, tai jas galima pakeisti kartu, naudojant vieną oligonukleotidą, koduojantį visus amino rūgščių liekanų pakeitimus. Tačiau, jei tarp šių amino rūgščių liekanų yra didesnis nei 10 amino rūgščių liekanų tarpas, tai pagaminti vieną oligonukleotidą, koduojantį visus pakeitimus, tampa labai sudėtingu uždaviniu. Tokiais atvejais reikia pasirinkti vieną iš dviejų galimų būdų.
[0313] Pirmuoju būdu pagaminami keli oligonukleotidai, koduojantys po vieną amino rūgščių liekanų pakeitimą. Šių oligonukleotidų mišinys hibridinamas su matrica ir sintetinama antroji grandinė, kurioje bus užkoduoti visi norimi pakeitimai.
[0314] Antras būdas apima du ar kelis mutagenezės ciklus, jei norima pagaminti norimą mutantą. Pirmame cikle, naudojant laukinio tipo DNR matricą ir oligonukleotidą, koduojantį pirmą iš norimų pakeitimų, pagaminamas heterodupleksas. Antrame mutagenezės cikle kaip matrica naudojama mutantinė DNR, pagaminta pirmame cikle. Taigi, ši matrica jau turi vieną ar kelias mutacijas. Oligonukleotidas, koduojantis papildomų norimų amino rūgščių liekanų pakeitimus, hibridinamas su minėta matrica ir vykdoma DNR polimerizacijos reakcija. Susintetinta antroji grandinė koduoja mutacijas, įvestas į DNR pirmame ir antrame mutagenezės cikluose. Ši DNR gali būti panaudojama kaip matrica trečiam mutagenezės ciklui ir taip toliau.
[0315] PCR mutagenezė taip pat yra tinkamas būdas pagaminti mpl ligando polipeptido mutantinius variantus su amino rūgščių liekanų pakeitimais. Nors žemiau aptaria-mas metodas taikomas DNR, reikia turėti omeny, kad jis gali būti taikomas ir RNR molekulėms. PCR metodas apima šias procedūras (žiūr. Erlich, supra, skyrius, parašy-tas R. Higuchi, p. 61-70): Naudojant nedidelius DNR matricos kiekius ir pradmenis, kurių sekos truputį skiriasi nuo matricos DNR sekos, galima pagaminti palyginti didelius kiekius DNR fragmentų, kurie skiriasi nuo matricos sekos tik tose vietose, kuriose skyrėsi pradmenys. Norint įterpti mutaciją į plazmidės
[0316] DNR, vienas iš pradmenų turi persidengti su vieta, kurioje norima padaryti mutaciją ir turi šią mutaciją
[0317] koduoti; kito pradmens seka turi būti identiška sekai, esančiai bet kurioje komplementarios DNR grandinės vietoje. Geriau, kad antrąjį pradmenį atitinkanti seka
[0318] būtų ne toliau, kaip 200 bazių atstumu nuo mutuojamos i vietos, tam kad amplifikuotą fragmentą būtų lengva sekvenuoti. Naudojant tokias poras pradmenų, PCR pagalba pagaminama DNR fragmentų populiacija, kuri skiriasi nuo pradinės DNR mutacijomis, įvestomis pirmuoju prad-menimi. Amplifikuotas fragmentas gali turėti ir kitų mutacijų, nes kopijuojant matricą, gali įsivelti klai-dos .
[0319] Jei matricos ir reakcijos produktų santykis yra ypatingai mažas, tai didžioji dauguma pagamintų frag-mentų turės norimą mutaciją (mutacijas). Ši medžiaga toliau naudojama pakeisti atitinkamą plazmidės vietą,
[0320] taikant standartinius DNR konstravimo metodus. Mutacijas skirtingose pozicijose galima padaryti, naudojant antrą mutantinį pradmenį arba padarant antrą PCR su kitais pradmenimis; abiejų PCR produktai lygiagrečiai įsiuvami į vektorių, naudojant tris (ar kelis) ligavimo etapus.
[0321] Konkrečiame PCR mutagenezės pavyzdyje plazmidinė DNR matrica (1 j^g) linearizuojama, naudojant restrikcijos endonukleazę, turinčią tik vieną atpažinimo vietą plazmidėje. Ši atpažinama vieta neturi būti amplifikuo-jamoje DNR dalyje. 100 ng tokios medžiagos įdedama į PCR mišinį, susidedantį iš PCR buferinio tirpalo, keturių dezoksiribonukleotidtrifosfatų (GeneAMP® rinkinys, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emery-ville, CA) ir 25 pM kiekvieno oligonukleotidinio pradmens; galutinis reakcijos mišinio tūris yra 50 pi. Reakcijos mišinio viršuje užsluoksniuojama 35 | il mine-ralinės alyvos. Reakcijos mišinys denatūruojamas 5 minutes 100°C temperatūroje, atšaldomas, trumpam padė-jus pavyzdžius į ledą, ir į mišinius po alyvą įdedama po 1 fil Thermus aquaticus ( Taq) DNR polimerazės (5 V/ jil, Perkin- Elmer Cetus) . Reakcijos mišinys perkeliamas i DNA Thermal Cycler aparatą ( Perkin-Elmer Cetus). Aparatas programuo}aiaas toau režimu:
[0322] Pasibaigus programai, mėgintuvėliai išimami iš aparato, vandeninė fazė pernešama į naujus mėgintu-vėlius, ekstrahuojama fenolio/chloroformo mišiniu (50:50, t/t), DNR išsodinama etanoliu ir išskiriama standartiniais metodais. Ši medžiaga toliau apdorojama taip, kad būtų galima įterpti į vektorių.
[0323] Kitas mutagenezės variantas - kasečių mutagenezė - pagrįstas metodu, aprašytu Wells et al. , Gene, 34:315
[0324] [1985]. Pradinė medžiaga yra plazmidė (ar kiti vektoriai) , turinti norimą pakeisti mpl ligando DNR. Mpl ligando DNR kodonas (kodonai), kurį norima pakeisti, identifikuojamas. Abejose būsimos mutacijos vietos galuose turi būti unikalios restrikcijos vietos. Jei tokių vietų nėra, tai jos turi būti įterptos į mpl ligando DNR, naudojant aukščiau aprašytą oligonukleo-tidų sąlygojamą mutagenezę. Įvedus restrikcijos vietas, plazmidė linearizuojama, skaldant atitinkama restrikcijos endonukleaze. Standartiniais metodais sintetinamas dvigrandis oligonukleotidas, koduojantis seką, esančią tarp restrikcijos vietų ir turintis norimas mutacijas. 01igonukleotidų grandinės sintetinamos atskirai ir hibridinamos pagal standartinius metodus. Toks dvigrandis oligonukleotidas vadinamas kasete. Kasetės sudarytos taip, kad jų 3' ir 5' galai atitiktų linearizuotos plazmidės galus ir kad būtų galima juos sujungti liguojant. Po ligavimo plazmidė turės mutantinę mpl ligando DNR seką. C. Nukleino rūgšties įterpimas į replikuojamą vektorių Nukleino rūgštis (pvz., kDNR ar genominė DNR), koduojanti natyvų ar mutantinį mpl ligando polipeptidą, įterpiama į replikuojamą vektorių tolesniam klonavimui (DNR amplifikacijai) arba ekspresijai. Yra daug vekto-rių, todėl tinkamo vektoriaus pasirinkimas priklauso nuo: (1) ar jis bus panaudotas DNR amplifikacijai ar DNR ekspresijai; (2) įterpiamos nukleino rūgšties dy-džio; (3) ląstelės-šeimininkės, į kurią vektorius bus įvedamas. Kiekviename vektoriuje yra įvairūs komponentai, kurie priklauso nuo jo funkcijos (DNR amplifika-cija ar DNR ekspresija) ir nuo ląstelės-šeimininkės, kurioje jis bus pavartotas. Vektoriaus komponentai paprastai apima, bet tuo neapsiribojama, vieną ar kelis iš šių elementų: signalinę seką, replikacijos iniciacijos vietą, vieną ar kelis markerinius genus, sustiprin-toją, promotorių ir transkripcijos terminacijos seką.
[0325] Šiame išradime aprašomas mpl ligandas gali būti ekspresuojamas ne tik tiesiogiai, bet ir kaip hibridinis polipeptidas, kuriame mpl ligandas yra sulietas su heterologiniu polipeptidu, geriau su signaline seka arba su kitu polipeptidu, turinčiu specifinę skėlimo vietą subrendusio baltymo ar polipeptico N gale. Signa-linė seka gali būti vektoriaus komponentu arba mpl ligando DNR - dalimi ir kartu su šia DNR įterpiama į vektorių. Reikia pasirinkti tokią signalinę seką, kurią
[0326] ląstelė-šeimininkas gali atpažinti ir paveikti (pvz., nuskelti signaline peptidaze). Prokariotinėse ląste-lėse-šeimininkuose, kurie negali atpažinti ir nuskelti natyvios mpl ligando signalinės sekos, pastaroji pakei-čiama į kokią nors prokariotinę signalinę seką, pvz., į šarminės fosfatazės, penicilinazės, lpp arba aukštai temperatūrai atsparaus endotoksino II signalinę seką. Siekiant sekrecijos mielėse, natyvią signalinę seką galima pakeisti, pvz., invertazės, alfa faktoriaus arba rūgštinės fosfatazės lyderinėmis sekomis, C. albicans gliukoamilazės lyderine seka (EP 362179, publikuotas 1990.04.04) arba siganaline seka, aprašyta WO 90/13646, publikuotame 1990.11.15. Žinduolių ląstelėse gerai veikia natyvi signalinė seka (pvz., mpl ligando prebal-tymas, įvykdantis mpl ligando sekreciją natyviose žin-duolių ląstelėse in vivo), galima naudotis ir kitomis žinduolių signalinėmis sekomis, pvz., kitų mpl ligando polipeptidų signalinėmis sekomis ar kitų rūšių gyvūnų mpl ligando signalinėmis sekomis, tos pačios ar kitos rūšies gyvūnų sekretuojamų polipeptidų signalinėmis sekomis, o taip pat virusinių baltymų sekretoriniais lyderiais, pvz., Herpes siplex viruso gD baltymo signaline seka.
[0327] Abu, ekspresijos ir klonavimo, vektoriai turi nukleino rūgšties sekas, kurios įgalina vektoriaus rep-likaciją vienoje ar keliose ląstelėse-šeimininkuose. Paprastai klonavimo vektoriuose ši seka leidžia vekto-riui replikuotis nepriklausomai nuo šeimininko chromo-sominės DNR ir turi replikacijos iniciacijos vietą arba autonomiškai bes ireplikuojančias sekas. Tokios sekos gerai žinomos daugelyje bakterijų, mielių bei virusų. Plazmidės pBR322 replikacijos iniciacijos vieta tinkama daugumai Gram-nei giamų bakterijų, 2 (.i plazmidės replikacijos iniciacijos vieta tinkama mielėms, o įvairios virusinės kilmės ( SV40, poliomos, adenovirusų, VSV ar BPV) replikacijos iniciacijos vietos naudojamos žinduo-lių ląstelių klonavimo vektoriuose. Paprastai žinduolių ekspresijos vektoriams replikacijos iniciacijos vieta nereikalinga ( SV40 replikacijos iniciacijos vieta daž-nai naudojama ekspresijos vektoriuose tik todėl, kad joje yra ankstyvasis promotorius).
[0328] Dauguma ekspresijos vektorių yra " šaudyklės" tipo vektoriai, tai yra tie, kurie gali replikuotis bent vienos organizmų klasės ląstelėse ir gali būti trans-fekuojami į kitas ląsteles, kuriose gali ekspresuotis. Pavyzdžiui, vektorius klonuojamas E. coli ląstelėse, o po to tuo pačiu vektoriumi transfekuoj amas mielių arba žinduolių ląstelės, kuriose šis vektorius ekspresuo-jasi, nors ir negali replikuotis nepriklausomai nuo ląstelės- šeimininko chromosomos.
[0329] DNR galima taip pat amplifikuoti, įterpiant ją į šeimininko genomą. Tai nesunku padaryti, panaudojant, pvz. , Bacillus genties bakteriją kaip šeimininką ir įterpiant į vektorių DNR seką, komplementarią Bacillus genominės DNR sekai. Įvedus tokį vektorių į Bacillus bakteriją, vyksta homologinė rekombinacija ir mpl ligando DNR įsiterpia į Bacillus genomą. Tačiau išskir-ti mpl ligando DNR iš genominės DNR sudėtingiau, nei iš automiškai besireplikuojančio vektoriaus, nes pirmuoju atveju mpl ligando DNR reikia pirma iškirpti iš genominės DNR restrikcijos fermentu.
[0330] Ekspresijos ir klonavimo vektoriai turi turėti selekcijos geną, kitaip vadinamą selekcijos markeriu, toks genas koduoja baltymą, reikalingą transformuotų ląstelių išgyvenimui ar augimui selektyvioje augimo terpėje. Ląstelės-šeimininkai, netransformuotos vektoriumi, kuriame yra selekcijos genas, tokioje terpėje neišgyvena. Tipiški selekcijos genai koduoja baltymus, kurie: (a) suteikia atsparumą antibiotikams arba kitiems toksinams, pvz., ampicilinui, neomicinui, meto-treksatui ar tetraciklinui; (b) atstato autotrofinį fenotipą; arba (c) produkuoja būtinus mitybinius komponentus, kurių terpėje nėra, pvz., genas, koduojantis D-alaninracemazę Bacillus genties bakterijose.
[0331] Viename selekcijos pavyzdyje naudojamas reagentas., sustabdantis ląstelių-šeimininkų augimą. LąsteL. -, kurios buvo sėkmingai transformuotos heterologiniu genu, ekspresuoja baltymą, suteikiantį atsparumą šiam reagentui ir tokiu būdu išgyvena selektyviomis sąly-gomis. Tokios teigiamos selekcijos pavyzdžiuose naudojami reagentai yra neomicinas (Southern et al. , J. Molec. Appl. Genet., 1:327 [1982]), mikofenolio rūgštis (Mulligan et al., Science, 209:1422 [1980]) arba higro-micinas (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413
[0332] [1985]) . Trijuose aukščiau pateiktuose pavyzdžiuose naudojami bakteriniai genai, kontroliuojami eukario-tiniais elementais ir suteikiantys atsparumą atitinkamai G418 ar neomicinui (geneticinui) , xgpt (mikofenolio rūgščiai), arba higromicinui.
[0333] Kitų žinduolių ląstelėms tinkamų selekcijos mar-kerių, įgalinančių identifikuoti transformuotas ląste-les, pavyzdžiai yra: dihidrofolatreduktazė (DHFR) ir timidinkinazė. Žinduolių ląstelių transformantai auginami tokiomis selektyviomis sąlygomis, kai adaptuo-tis ir išgyventi gali tik markerį turinčios ląstelės. Palaipsniui didinant selektyvaus agento koncentraciją, transformantai verčiami amplifikuoti selekcijos geną, o kartu ir DNR, koduojančią mpl ligando polipeptidą. Amplifikacij a yra procesas, kai per keletą rekombinan-tinių ląstelių generacijų chromosomoje padidėja geno kopijų skaičius, ir tos kopijos išdėstomos viena paskui kitą. Atitinkamai padidėja ligando sintezė.
[0334] Pavyzdžiui, ląstelės, transformuotos DHFR selekcijos genu, identifikuojamos auginant visus transformantus su metotreksatu (Mtx), kuris yra konkurentinis DHFR antagonistas. Tinkamos ląstelės-šeimininkai yra Kinietiškų žiurkėnų kiaušidžių (CHO) ląstelių linija, neturinti DHFR aktyvumo. Ši ląstelių linija paruošiama ir auginama kaip aprašyta (Urlaub ir Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]). Trasformantai auginami terpėje su vis oi. desue Mtx koncentracija. Tai verčia ląstelę sintetinti vis daugiau DHFR geno kopijų ir lygiagrečiai daugiau visų kitų ekspresijos vektoriaus elementų, tarp jų ir DNR, koduojančios mpl ligan-dą, kopijų. Šį amplifikacijos metodą galima taikyti ir kitiems tinkamiems šeimininkams, pvz., ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, kuris neperneša egzogeninio DHFR, ypač, jei naudojamas mutantinis DHFR genas, atsparus dideliems Mtx kiekiams (EP 117060). Kitas būdas yra ląsteles-šeimininkus (ypač laukinio tipo ląsteles, turinčias endogeninę DHFR) transformuoti ar kotransformuoti DNR sekomis, koduojančiomis mpl ligandą, laukinio tipo DHFR baltymą ir kitą selekcijos markeri, pvz., aminogliuko-zid-3'-fosfotransferazę (APH), ir po to atrinkti transformantus terpėje su selektyviu agentu tokiu, kaip aminogliukozidinis antibiotikas, kanomicinas, neomicinas ar G418. (Žiūr. JAV patentą Nr.: 4965199).
[0335] Mielėse naudojamas selekcijos genas trpl, koduojamas mielių plazmidės YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman et al., Gene, 7:141 [1979]; ir Tschemper et al., Gene, 10:157 [1980]). trpl genas suteikia selekcijos markerį mielių mutantams, nesuge-bantiems augti terpėje be triptofano, pvz., ATCC Nr. 44076 arba PEP4-1 (Jonės, Genetics, 85:12 [1977]). Trpl geno defektas mielių ląstelėse-šeimininkuose suteikia galimybę atrinkti transformantus, kurie skirtingai nei šeiminkai gali augti terpėje be triptofano. Analogiš-kai, Leu2 defektyvius mielių ląstelių kamienus (ATCC Nr. 20622 arba 38626) galima transformuoti žinomomis plazmidėmis, turinčiomis Leu2 geną.
[0336] Ekspresijos ir klonavimo vektoriai paprastai turi promotorių, kurį gali atpažinti šeimininko organizmas, ir kuris funkcionaliai sujungtas su mpl ligando nukleino rūgštimi. Promotoriai yra netransliuojamos sekos, lokalizuotos prieš struktūrinio geno pirmąjį kodoną (iš 5' galo, 100 - 1000 bp atstumu) ir funkcionaliai sujungtos su tam tikra nukleino rūgšties seka, pvz., mpl ligando nukleino rūgšties seka, ir reguliuoja jos transkripciją ir transliaciją. Promotoriai suskirstomi į dvi pagrindines klases: indukuojami promotoriai ir konstitutyvūs promotoriai. Indukuojami promotoriai yra tokie promotoriai, kurie inicijuoja kontroliuojamos DNR transkripciją, kai tam tikru būdu pasikeičia augimo sąlygos, pvz., kai terpėje atsiranda ar išnyksta koks nors mitybinis komponentas, ar pasikeičia temperatūra. Žinoma daug promotorių, kuriuos atpažįsta įvairūs potencialūs šeimininkai. Šie promotoriai funkcionaliai sujungiami su mpl ligandą koduojančia DNR, pašalinant restrikcijos fermentais natūralų šaltinio promotorių ir įterpiant į vektorių norimą išskirtą promotorinę seką. Kaip natūralius mpl ligando promotorius, taip ir dau-gumą heterologinių promotorių galima panaudoti mpl ligando DNR amplifikacijai ir/arba ekspresijai. Geriau naudoti heterologinius promotorius, nes jie paprastai suteikia galimybę pasiekti didesnį transkripcijos lygį ir didesnes ekspresuoj amo mpl ligando išeigas, lyginant su natūraliu mpl ligando promotoriumi.
[0337] Promotoriai, tinkami naudoti prokariotinėse ląste-lėse apima p-laktamazės ir laktozės promotorines sistemas (Chang et ai., Nature, 275:615 [1978]; Goedael et al., Nature, 281:544 [1979]), šarminės fosfatazės ir triptofano (trp) promotorines sistemas (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] ir EP 36776) ir hibridinius promotorius, pvz., tac promotorių (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 [1983]). Tinka ir kiti žinomi bakterijų promotoriai. Jų nukleo-tidinės sekos publikuotos ir patyręs specialistas gali juos funkcionaliai sujungti su mpl ligandą koduojančia DNR (Siebenlist et al. , Cell, 20:269 [1980]), naudoda-masis linkeriais ir adapteriais norimoms restrikcijos vietoms sukonstruoti. Promotoriai, naudojami bakterijose, turi turėti Shine-Dalgarno (S.D.) seką, funkcionaliai sujungtą su DNR, koduojančią mpl ligandą.
[0338] Žinomi ir eukariotams tinkami promotoriai. Prak-tiškai visi eukariotų genai turi AT-turtingas sritis, lokalizuotas 25 - 30 bazių atstumu į 5' galą nuo transkripcijos iniciacijos vietos. Kita seka, randama 70 - 80 bazių atstumu į 5' galą nuo daugumos genų transkripcijos iniciacijos vietos, yra CXCAAT seka, kur X gali būti bet koks nukleotidas. Daugumos eukariotų genų 3' gale yra seka AATAAA, kuri, matyt, gali būti signalu, reguliuojančiu poli-A uodegos prijungimą prie koduojan-čios sekos 3' galo. Visos šios sekos įterpiamos į tinkamas eukariotų ekspresijos vektorių vietas.
[0339] Promotoriai, tinkami naudoti mielėse, apima promotorius 3-fosfogliceratkinazei (Hitzeman et al., J. Biol., Chem., 255:2073 [1980]) ar kitiems glikoliti-niams fermentams (Hess et al., J. Adv. , Enzyme Reg. , 7:149 [1968] ir Holland, Biochemistry, 17:4900 [1978]), tokiems kaip enolazė, gliceraldehid-3-fosfatdehidro-genazė, heksokinazė, piruvatdekarboksilazė, fosfo-fruktokinazė, gliukoz-6-fosfatizomerazė, 3-fosfogli-ceratmutazė, piruvatkinazė, triozfosfatizomerazė, fosfogliukozizomerazė ir gliukokinazė.
[0340] Kiti mielių promotoriai yra indukuojami promotoriai, turintys papildomą pranašumą, kad transkripcija reguliuojama augimo sąlygomis. Tokie promotoriai: alkoholdehidrogenazės 2, izocitochromo C, rūgštinės fosfatazės, degradacijos fermentų, susijusių su azoto metabolizmu, metaltioneino, gliceraldehid- 3- fosfatde-hidrogenazės ir fermentų, atsakingų už maltozės ir galaktozės įsisavinimą, promotorinės sekos. Vektoriai ir promotoriai, naudojami ekspresijai mielėse, detaliai aprašyti Hitzeman et al., EP 73657( A). Mielių sustiprintojai sėkmingai naudojami kartu su mielių promotoriais .
[0341] Mpl ligando transkripcija nuo vektoriaus žinduolių ląstelėse- šeimininkuose kontroliuojama promotoriais, išskirtais iš virusų genomų, pvz., iš poliomos viruso, paukščių raupų viruso ( UK 2211504, publikuotas 1989. 07. 05), adenovirusų ( pvz., Adenoviruso 2), galvijų papiliomos viruso, paukščių sarkomos viruso, citomegalo viruso, retrovirusų, hepatito B viruso ir geriausiai iš Beždžionių Viruso 40 ( SV40), o taip pat heterologiniais žinduolių promotoriais, pvz., aktino promotoriumi, imunoglobulino promotoriumi, temperatūrinio šoko promotoriais arba promotoriais, normaliai susijusiais su mpl ligando seka, jei šie natūralūs promotoriai suderinami su kitomis ląstelės- šeimininko sistemomis.
[0342] Ankstyvasis ir vėlyvasis SV 40 viruso promotoriai paprastai gaunami kaip SV40 restrikcijos fragmentas, turintis taip pat SV40 viruso replikacijos iniciacijos vietą (Fiers et al., Nature, 273: 113 [1978]; Mulligan ir Berg, Science, 209:1422-1427 [1980]; Pavlakis et al. , Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 [1981]). Ankstyviausias žmogaus citomegalo viruso promotorius išskiriamas kaip HindlII E restrikcijos fragmentas (Greenaway et al., Gene, 18:355-360 [1982]). Sistema, tinkama DNR ekspresijai žinduolių ląstelėse-šeiminin-kuose, naudojant galvijų papilomos virusą, aprašyta JAV patente Nr. 4419446. Šios sistemos modifikacija apra-šyta JAV patente Nr. 4601978. Taip pat žiūr. Gray et al., Nature, 295:503-508 [1982] apie imuninio interferono kDNR ekspresiją beždžionių ląstelėse; (Reyes et al., Nature, 297:598-601 [1982] apie žmogaus p-interferono kDNR ekspresiją pelių ląstelėse, naudojant timidinkinazės promotorių iš Herpes simplex viruso; (Canaani ir Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 [1982]; apie žmogaus interferono pi geno ekspre-siją kultivuojamose pelių bei triušių ląstelėse; ir Gorman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781
[0343] [1982] apie bakterijų CAT sekų ekspresiją beždžionių inkstų ląstelių linijoje CV-1, viščiukų embrionų fibro-blastuose, Kinietiškų žiurkėnių kiaušidžių ląstelių linijoje, HeLa ląstelėse ir pelių NIH-3T3 ląstelėse, naudojant promotoriumi Rous'o sarkomos viruso ilgąją galinę pasikartojančią seką.
[0344] DNR, koduojančios šiame išradime pateiktą mpl ligandą, transkripcija aukštesniuose eukariotuose dažnai padidėja, kai į vektorių įterpiama sustiprintojo seka. Sustiprintoj ai yra cis-padėtyje veikiantys DNR elementai, paprastai nuo 10 iki 300 bp ilgio, kurie veikia promotorių, taip padidindami transkripciją. Sustiprintojai yra sąlyginai nepriklausomi nuo padeties ir orientacijos DNR sekoje, jie buvo rasti kiek 5'
[0345] (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993
[0346] [1981]), tiek ir 31transkripcijos vieneto galuose (Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3:1108 [ 1983]), taip pat viduryje introno (Banerji et al., Cell, 33:729 [1983]), ir pačioje koduojančioje sekoje (Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4:1293 [1984]). Žinoma daug sustiprintojų sekų iš žinduolių genų (globino, elastazės, albumino, a-fetoproteino ir insulino). Paprastai dažniau naudojami eukariotinių ląstelių virusų sustiprintojai, pastarieji apima: SV40 sustiprintoją, esantį vėlyvojoje replikacijos iniciacijos vietos pusėje (100-270 bp) , citomegalo viruso ankstyvojo promotoriaus sustiprin-toją, poliomos viruso sustiprintoją, esantį vėlyvojoje replikacijos iniciacijos vietos pusėje ir adenovirusų sustiprintojus. Žiūrėk taip pat(Yaniv, Nature, 297:17-18 [1982]) apie sustiprinančius elementus, taikomus eukariotų promotorių aktyvacijai. Sustiprintoją galima įterpti į 5' arba 3' mpl ligandą koduojančios sekos galą, bet geriau jį įterpti į vietą, esančią prie promotoriaus 5' galo.
[0347] ( vi) Transkripcijos terminacijos elementai Ekspresijos vektoriai, naudojami eukariotinėse ląstelėse-šeimininkuose (mielėse, grybuose, vabzdžių, augalų, gyvūnų, žmogaus ląstelėse arba kitų daugia-ląsčių organizmų branduolį turinčiose ląstelėse) turi turėti sekas, reikalingas transkripcijos terminacijai ir iRNR molekulių stabilizavimui. Tokios sekos paprastai būna eukariotų arba virusų DNR arba kDNR 5' arba, rečiau, 3' netransliuojamose dalyse. Šios dalys turi nukleotidų segmentus, kurie transkribuojami kaip poli-adenilinti fragmentai netransliuojamoje mpl ligandą koduojančios iDNR dalyje.
[0348] ( vii) Vektorių konstravimas ir analizė Tinkamų vektorių, turinčių vieną ar kelis aukščiau išvardintus elementus, konstravimas remiasi standartiniais ligavimo metodais. Išskirtos plazmidės arba DNR fragmentai skaldomi, prie gautų fragmentų padaromi lipnūs galai ir jie liguojami tokia tvarka, kad būtų gaunamos norimos plazmidės.
[0349] Norint įsitikinti,kad sukonstruotos plazmidės seka yra teisinga, ligavimo mišiniu transformuojamas E. coli K12 kamienas 294 (ATCC Nr. 31446), ir transformantai atrenkami pagal atsparumą ampicilinui ar tetraciklinui. Iš transformantų išskiriamos plazmidės ir analizuojamos restrikcine analize ir/arba sekvenuojamos pagal Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] arba pagal Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 [1980].
[0350] Šio išradimo įgyvendinimui labai naudingi ekspresijos vektoriai, kurie taikomi, siekiant mpl ligando polipeptidą koduojančios DNR laikinosios ekspresijos žinduolių ląstelėse. Paprastai laikinąjai ekspresijai taikomi ekspresijos vektoriai, sugebantys efektyviai replikuotis ląstelėse-šeimininkuose. Tuo būdu ląstelėje susikaupia daug ekspresijos vektoriaus kopijų ir atitinkamai sintetinami dideli norimo polipeptido, koduo-jamo ekspresijos vektoriumi, kiekiai (Sambrook et al., supra, pp. 16.17 - 16.22). Laikinosios ekspresijos sistemos, susidedančios iš tinkamo ekspresijos vektoriaus ir ląstelės-šeimininko, įgalina identifikuoti polipeptidus, koduojamus klonuotomis DNR, o taip pat greitai analizuoti tokių polipeptidų biologines ir fiziologines savybes. Taigi, laikinosios ekspresijos sistemos ypatingai naudingos šiame išradime identifikuojant mpl ligando polipeptido analogus ir variantus, kurie pasi-žymi mpl ligando polipeptido biologiniu aktyvumu.
[0351] ( ix) Tinkami pavyzdiniai stuburinių gyvūnų ląstelių vektoriai
[0352] Kiti metodai, vektoriai ir ląstelės-šeimininkal, tinkamos mpl ligando sintezei rekombinantinėse stubu-rinių gyvūnų ląstelių kultūros, yra aprašyti Gething et al., Nature, 293:620-625 [1981]; Mantei et al., Nature, 281:40-46 [1979]; Levinson et al. ;EP 117060 ir EP 117058. Geriausiai tinkama mpl ligando ekspresijai žinduolių ląstelėse plazmidė yra pRK5 (EP 307247; JAV patentas Nr. 5258287) arba pSVl6B (PCT publikacija Nr. WO 91/08291).
[0353] D. Ląstelių- šeimininkių atranka ir transformavimas
[0354] Tinkamos ląlstelės-šeimininkai vektorių klonavimui ar ekspresijai yra prokariotų ląstelės, mielės ar aukš-tesniųjų eukariotų ląstelės, aprašytos aukščiau. Tinkami prokariotai apima Eubacteria, Gram-neigiamas ar Gram-teigiamas, pavyzdžiui, E. coli, Bacilli rūšys, pvz., B. subtilis, Pseudomonas rūšis, pvz., P. aerugi-nosa, Salmonella typhimurium ar Serratia marcescans. Geriausias klonavimui E. coli kamienas yra E. coli 294 (ATCC Nr. 31446), nors ir kiti kamienai yra tinkami klonavimui: E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537) ir E. coli W3110 (ATCC Nr. 27325). Šie pavyzdžiai pateikti iliustracijai, o ne apribojimui. Palankiausia, kai ląstelės-šeimininkai sekretuoja minimalius kiekius proteinazių. Taip pat atliekami klonavimo darbai in vitro, pvz., PCR ar kitos nukleino rūgščių polimera-zinės reakcijos.
[0355] Be prokariotinių ląstelių, gali būti naudojami šeimininkais mpl ligandą koduojantiems vektoriams euka-riotiniai mikroorganizmai, pvz., siūliniai grybai ar mielės. Saccharomyces cerevisiae ar paprastos kepimo mielės dažniausiai naudojamos iš žemesniųjų eukarioti-nių mikroorganizmų. Daugelis mikroorganizmų iš kirų genčių, rūšių ir kiti mikroorganizmų kamienai yra paprastai prieinami ir gali būti naudojami šiame išra-dime. Pavyzdžiui, Schizosaccharomyces pombe (Beach ir Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139383, publikuotas 1985.05.02), Kluyve i om.yces (JAV patentas Nr. 4 943529:, pvz., K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737
[0356] [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans ir K. marxianus, yarrowia [EP 402226], Pichia pastoris (EP183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); siūliniai grybai, pvz. , Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publikuotas 1991.01.10), Aspergillus, pvz., A. niddulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983];. Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 [1984 ]) ir A. niger (Kelly ir Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]).
[0357] Ekspresuoti glikozilintam mpl ligandui tinkamos ląstelės-šeimininkės yra kilusios iš daugialąsčių organizmų. Tokios ląstelės pasižymi kompleksiniu procesingu ir glikozilinimo aktyvumu. Iš principo galima naudoti bet kokias aukštesniųjų eukariotų ląsteles kaip iš stuburinių, taip ir iš bestuburių gyvūnų. Bestuburių gyvūnų ląstelių pavyzdžiai yra augalų ir vabzdžių ląstelės. Gali būti naudojamos daugelio bakulovirusų kamienų ir variantų ir atitinkamų vabzdžių ląstelės iš Spodoptera frugiperda (vikšras), Aedes aegypti (moskitas), Aec/es albopictus (moskitas), Drosophila melanogaster (vaisinė muselė) ir Bombyx mori. Žiūrėk, pavyzdžiui, Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 [1988]; Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al.eds., Vol.8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; ir Maeda et al., Nature, 315:592-594 [1985] . Daugelis virusų kamienų yra prieinami transfekcij ai, pvz., Autographa californica NPV L-l variantas ir Bm-5 kamienas Bombyx mori NPV ir kiti virusai, ir tokie virusai, kaip ir šiame išradime naudojamas virusas, gali būti naudojami čia aprašytais būdais, ypač transf ekuoj ant Spodoptera frugiperda ląsteles.
[0358] Augalų audinių kultūros iš medvilnės, kukurūzų, bulvių, sojos pupelių, petunijų, pomidorų ir tabako gali būti naudojamos kaip šeimininkai. Augalų kultūros ląstelės paprastai transfekuojamos inkubuojant su tam tikrais bakterijų Agrobacterium tumefaciens kamienais, kuriose prieš tai buvo įterpta mpl ligando DNR. Augalų ląstelių kultūros inkubacijos su A. tumefaciens metu, DNR, koduojanti mpl ligandą, pernešama į augalo ląste-les; ląstelės tampa transfekuotos ir tam tikromis sąlygimis ekspresuoja mpl ligando DNR. Yra reguliato-rinės ir signalinės sekos, tinkamos augalų kultūros ląstelėms, pvz., nopalinsintetazės promotorius ir poliadenilinimo signalinės sekos (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 [1982]). Taip pat yra išskirtas DNR segmentas, esantis T-DNR prieš geną 780, kuris sugeba aktyvuoti arba padidinti augalų ekspresuoj amų genų transkripcijos lygį rekombinantinę DNR turinčiose augalų kultūros ląstelese. EP 321196, publikuotas 1989.06.21.
[0359] Bet labiausiai įdomios yra stuburinių gyvūnų ląs-telės, ir stuburinių gyvūnų ląstelių dauginimas kultū-roje (audinių kultūros) dabar jau yra rutininė proce-dūra (Tissure Culture, Academic Press, Kruse ir Patterson, redaktoriai [1973]). Žinduolių ląstelių-šeimininkų linijų pavyzdžiai yra: beždžionės inkstų CV1 linijos ląstelės, transformuotos SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); žmogaus embriono inkstų ląstelių linija (293 ar 293 linijos ląstelės, subklonuotos, kad galėtų augti suspensinėje kultūroje, Graham et al., J. Gen Virol. , 36:59 [1977]); jauniklių žiurkėnų inkstų ląstelės (BHK, ATCC CCL 10); Kinietiškų žiurkėnių kiaušidžių ląstelės (DHFR) (CHO, Urlaub ir Chasin, Froc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]); pelių sertoli ląstelės (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243- 251 [ 1980]) ; beždžionių inkstų ląstelės ( CV1 ATCC CCL 70) ; Afrikos žaliųjų beždžionių inkstų ląstelės ( VERO- 76, ATCC CRL- 1578) ; žmogaus gimdos kaklelio karcinomos ląstelės ( HELA, ATCC CCL 2) ; šuns inkstų ląstelės ( MDCK, ATCC CCL 34) ; buffalo žiurkių kepenų ląstelės ( BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; žmogaus plaučių ląstelės ( W138, ATCC CCL 75) ; žmogaus kepenų ląstelės ( Hep G2, ?- ?. °065) ; pelių pieno liaukų auglio ląstelės ( MMT 060562, ATCC CCL 51) ; TRI ląstelės ( Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44- 68 [ 1982]) ; MRC 5 ląstelės; FS4 ląstelės ir žmogaus hepatomos linija ( Hep G2).
[0360] Ląstelės-šeimininkai transfekuojamos ir transformuojamos šiame išradime aukščiau aprašytais ekspresijos ar klonavimo vektoriais; ląstelės kultivuojamos bendrai priimtinose maitinimo terpėse, papildant jas, kad būtų indukuojami promotoriai; atrenkami transformantai ar amplifikuojami genai, koduojantys tikslines sekas.
[0361] Transfekcija vadinamas procesas, kai į ląstelę įvedamas vektorius, nepriklausomai nuo to, ar vyksta kokios nors koduojančios sekos ekspresija. Specialistams yra žinoma daug transfekcijos metodų, pvz., kalcio fosfatinis metodas, elektroporacij a. Pasisekusi transfekcija paprastai įvertinama pagal bet kokį vektoriaus veikimo pasireiškimą ląstelėje-šeimininke .
[0362] Transformacija vadinamas procesas, kai į organizmą įvedama DNR taip, kad vyktų jos replikacija arba kaip ekstrachromosominio elemento, arba integruojantis į ląstelės-šeimininko chromosomą. Priklausomai nuo pasirinkto šeimininko, transformacija atliekama standartiniais metodais, tinkančiais šiam konkrečiam šeiminin-kui. Ląstelių paveikimas kalcio chloridu (žiūr. skyrių 1.82, Sambrood et al., supra) paprastai taikomas pro-kariotinėms ląstelėms arba kitoms, turinčioms ląstelės sienelės barjierą. Transformuojant augalų ląsteles, naudojamas užkrėtimas Agrobacter iui:: tumefaciens, tai aprašyta Shaw et al., Gene, 23:315 [ 1983] ir W0 89/ 05859, publikuotame 1989. 06. 29. Be to, augalų ląste-lės gali būti transfekuojamos paveikiant ultragarsu, kaip aprašyta patente WO 91/ 00358, publikuotame 1991. 01. 10. Žinduolių ląstelėms, kurios neturi ląstelių sienelės, geriau taikyti kalcio fosfatinį metodą, aprašytą Graham ir van der Eb, Virology, 52:456- 457 [ 1978]. Bendri žinduolių ląstelių- šeimininkų transfor-macijos aspektai aprašyti Axel JAV patente Nr. 4399216, publikuotame 1983. 08. 16. Mielių ląstelių transformacija paprastai vykdoma pagal metodus, aprašytus Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 [ 1977] ir Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 [ 1979]. Taip pat galima naudoti ir kitus DNR ivedimo metodus, pvz., injekciją į branduolį, elektroporaciją arba protoplastų suliejimą.
[0363] Prokariotų ląstelės, naudojamos šiame išradime mpl ligando polipeptido produkcijai, kultivuojamos tam tinkamoje terpėje, kaip aprašyta Sambrook et al., supra.
[0364] Šiame išradime žinduolių ląstelės-šeimininkai, naudojamos mpl ligando produkcijai, gali būti kultivuojamos įvairiose terpėse. Ląstelių-šeimininkų kulti-vavimui gali būti naudojamos komercinės terpės: Ham F10 (Sigma), minimali pagrindinė terpė ( [MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) ir Dulbecco modifikuota Eagle terpė
[0365] (DMEM, Sigma). Taip pat ląstelių-šeimininkų auginimui gali būti naudojama bet kuri terpė, aprašyta šiuose šaltiniuose: Ham ir Wallace, Meth. Enz., 58:44 [1979], Barnes ir Sato Anai. Biochem. , 102:255 [1980], JAV patentuose: 4 7 67 7 04 ; 4 6 57866; 4927762 arba 4560655; WO 90/03430; WO 87/00195; JAV patento Re. 30985;ir paraiš-kose USSN 07/592107 ar 07/592141, abi pateiktos 1990.10.03. Visų išvardintų terpių panaudojimas laikomas atitinkančiu ši išradimą. Bet kuri čia aprašyta
[0366] terpė gali būti papildoma, jei tai būtina, hormonais ir/ arba kitais augimo faktoriais ( pvz., insulinu, transferinu ar epiderminiu augimo faktoriumi) , druskomis ( pvz., natrio chloridu, kalcio, magnio druskomis ir fosfatais), buferinėm medžiagomis ( pvz., HEPES) , nukleozidais ( pvz., adenozinu ir timidinu), antibiotikais ( pvz., Gentamicinu™), mikroelementais ( pvz., neorganiniais junginiais, paprastai jų koncentracija būna keli | iM) ir gliukoze ar ekvivalentišku energijos šaltiniu. Kiti terpės priedai, žinomi šios srities specialistams, taip pat gali būti naudojami tinkamomis tam koncentracijomis. Ląstelių- šeimininkų, pasirinktų baltymų ekspresijai, kultivavimo sąlygos: temperatūra, pH ir kt., parenkamos specialistams žinomais būdais.
[0367] Šiame išradime ląstelės- šeimininkai apima ląste-les, kultivuojamas in vitro ir ląsteles, kurios yra pačiuose gyvūnuose.
[0368] F. Geno amplifikacijos/ ekspresijos nustatymas
[0369] Geno amplifikacij a ir/arba ekspresija gali būti įvertinama tiesiogiai mėginyje, pavyzdžiui, įprastais Southern blotavimu, northern blotavimu įvertinant iRNR transkripciją (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), dot hibridizacija (DNR analize), arba hibridizacija in situ, naudojant tinkamai pažymė-tus zondus, pasirenkamus pagal pateiktas šiame išradime sekas. Galima naudoti įvairius žymėjimo būdus, labiausiai įprastas yra žymėjimas radioizotopais, ypač 32P. Bet galima naudoti ir kitokius metodus, pvz., biotinu modifikuotus nukleotidus įterpti į polinukleotidą. Prie biotino gali jungtis avidinas ar antikūnai, kurie gali būti pažymimi įvairiomis žymėmis, pvz., radioizotopais, f 1uorescentinėmis žymėmis, fermentais ar kitais būdais. Taip pat gali būti naudojami antikūnai, atpažįstantys specifinius dupleksus, pvz., DNR dupleksus, RNR daplek-sus ir DNR-RNR hibridinius dupleksus ar DNR-baltymo dupleksus. Naudojami antikūnai gali būti pažymėti ir matavimas gali būti atliekamas, kai dupleksas sorbuojamas ant paviršiaus, kad, formuojantis ant paviršiaus dupleksams, būtų galima nustatyti prisijungusius prie duplekso antikūnus.
[0370] Taip pat geno ekspresija gali būti įvertinama imunologiniais metodais, pvz., atliekant imunohisto-cheminį audinių pjūvių dažymą, o taip pat analizuojant audinių kultūrų terpes arba organizmo skysčius, tokiu būdu tiesiogiai įvertinant geno ekspresijos produktą. Atliekant imunohistocheminio dažymo analizę, ląstelių mėginiai paprastai paruošiami dehidratuoj ant ir užfik-suojant ląsteles, po to seka reakcija su žymėtais antikūnais, specifiniais imobilizuotam geno produktui. Paprastai šios žymės yra matomos, pvz., fermentinės žymės, fluorescuojančios žymės, liuminescuojančios žymės ir kitos. Tinkamiausias šiam išradimui ypač jautrus dažymo metodas yra pateiktas Hsu, et al., Am. J. Clin. Path., 75:734- 738 [ 1980].
[0371] Imunocheminiam dažymui ir/arba mėginių tirpalų tyrimui naudojami kaip monokloniniai, taip ir polikloniniai antikūnai. Jie gali būti gaunami iš bet kurių žinduolių. Antikūnai gali būti pagaminti prieš natyvų mpl ligando polipeptidą ar prieš sintetinį polipeptidą, kuris yra susintetintas pagal DNR sekas, pateikiamas žemiau.
[0372] Patogiausia, kai mpl ligandas yra išskiriamas iš kultūrinės terpės, į kurią jis yra sekretuo j amas, nors taip pat gali būrį išskirtas iš ląstelių-šeiminmku lizato, kai baltymas yra ekspresuoj amas be signalinės sekos .
[0373] Kai mpl ligar.das yra ekspresuo j amas rekombinar.-tinėse ląstelėse, -kirtingose nuo žmogaus ląstelių, mpl ligando preparatuose nebūna kitų žmogaus polipep-tidų ar baltymų. Bet šiuo atveju yra būtina mpl ligandą išgryninti nuo rekombinantinių ląstelių baltymų ar polipeptidų, norint gauti išgrynintą, homogenišką mpl ligando preparatą. Pirmoje gryninimo stadijoje kultū-rinė terpė ar ląstelių lizatas yra centrifūguojami, siekiant pašalinti ląstelių nuolaužas. Ląstelių membranos ir tirpūs baltymai yra atskiriami. Taip pat gali būti naudojami ir komerciniai, skirti baltymams kon-centruoti, filtrai ( pvz., Amicon ar Millipore ultra-filtacinė įranga). mpl ligandas gali būti gryninamas iš tirpių baltymo frakcijos ir iš ląstelių lizato membra-ninės frakcijos, priklausomai nuo to, ar mpl ligandas yra įsijungęs į membraną, mpl ligandas toliau gryninamas nuo pašalinių tirpių baltymų ar polipeptidų išso-dinant jį druskomis ar jonų mainų chromatografija, ar chromatografuoj ant kitais sorbentais. Naudojamos matricos gali būti: akrilamidas, agarozė, dekstranas, celiuliozė ir kitos matricos, paprastai naudojamos baltymų gryninimui. Chromatografinės procedūros, tinkamos baltymų gryninimui, yra: imunoafininė chromatografija ( pav., anti- h/ npl ligando Mab) , receptorinė chromatografija ( pvz., mpl- IgG, ar protein A Sepharose), hidrofobinės sąveikos chromatografija ( HIC)
[0374] ( pvz., esterio, butilo ar fenilo Toyopearl) , lėktino chromatografija ( pvz., Con A- Sepharose, lentil- lectin-Sepharose), gelflltracij a (pvz., Sephadex G- 75), katijonų ir anijonų mainų chromatografija (pvz., DEAE ar karboksimetil- ir sulfopropil- celiuliozė), ir atvirkščių fazių didelio efektyvumo skystinė chromatografija ( RP- HPLC) ( žiūr. pvz., Urdal et al. f J. Chromatog., 296:171 [1984], kur dvi viena po kitos einančios RP- HPLC stadijos yra naudojamos rekombinantinio IL-2 gryninimui). Kitos gryninimo stadijos paprastai būna: išsodinimas etanoliu, išsodinimas
[0375] amonio sulfatu, chromatofokusavimas, preparatyvinė SDS PAGE ir kitos.
[0376] mpl ligando variantai, kuriuose amino rūgščių liekanos yra pašalintos, įterptos ar pakeistos, yra išskiriami taip pat, kaip ir natyvus mpl ligandas, turint omeny savybių pokyčius mpl ligando variantuose. Pavyzdžiui, gryninant mpl ligando junginį su kitu baltymu ar polipeptidu, pvz., bakteriniu virusiniu antigenu, galima atlikti imunoafininę chromatografiją, naudojant sorbentą su antikūnais prieš antigeną, kadangi šis sorbentas sugeba sorbuoti sulietą polipep-tidą. Taip pat mpl ligandas gali būti išgryninamas afinine chrimatografij a, naudojant išgrynintus mpl- IgG, imobilizuotus gerai žinomais būdais ( geriausiai) prie sorbento, tokio kaip Affi- Gel 10 ( Bio- Rad, Richmond, CA) ar panašaus. Proteinazių inhibitorius, toks kaip fenilmetilsulfonilfluoridas ( PMSF), turi būti naudojamas, norint išvengti proteolitinės degradacijos valymo metu, antibiotikai turi būti naudojami, norint išvengti atsitiktinio užkrato augimo. Šios srities specialistas gali įvertinti, kaip gryninimo metodai, tinkami natyviam mpl ligandui, turi būti modifikuojami, kai gryninamas mpl ligandas ar jo variantai iš kitų rekombinantinių ląstelių kultūros.
[0377] H. mpl ligando polipeptido kovalentinės modifikacijos
[0378] mpl ligando polipeptidu kovalentinės modifikacijos yra šio išradimo sudėtinė dalis. Kaip natyvus mpl ligandas, taip ir mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantai gali būti kovalentiškai modifikuoti. Vienas kovalentiškai modifikuoto mpl ligando tipas, aprašytas šiame išradime, yra mpl ligando fragmentas. Mpl ligando fragmentų variantai, kurių sudėtyje yra apie 40 amino rūgščių liekanų, gali bū c i paruošti
[0379] chemiškai sintetinant ar fermeniniu ar cheminiu būdu skaldant pilno ilgio mpl ligando polipeptidą ar jo variantą. Kiti mpl ligando ar jo fragmentų kovalentinės modifikacijos variantai yra molekulė įterpiama į taikinio mpl ligando ar jo fragmento amino rūgščių liekaną organiniu modifikuojančių agentu, kuris sugeba reaguoti su pasirinkta vieta grandinėje ar su N ar C galinėmis amino rūgščių liekanomis.
[0380] Cisteinilo liekanos paprastai modifikuojamos a-ha-logenacetatais (ir atitinkamais aminais), tokiais, kaip choracto rūgštis ar chloracetamidas, susidarant karboksimetil- ar karboksiamidometilo dariniams. Cistenilo liekanos taip pat gali būti paveiktos bromtrif luor-acetonu, a-brom-p-(5-imidozoil)propiono rūgštimi, chloracetilfosf atu, N-alkilmaleinimidais, 3-nitro-2-piridildisulfidu, metil-2-piridildisulfidu, p-chlor-mercuribenzoatu, 2-chlormercuri-4-nitrofenoliu ar chlor-7-nitrobenzo-2-oksa-l, 3-diazolu.
[0381] Histidilo liekanos modifikuojamos dietilpirokarbo-natu, kai pH 5,5-7,0, nes šis reagentas yra santykinai selektyvus šoninei histidilo grandinei. Taip pat gali būti naudojamas bromofenilacetilbromidas, reakcija vykdoma 0,1 M natrio kokodilato tirpale, esant pH 6.0.
[0382] Lizinilo ir N galinės amino rūgščių liekanos modifikuojamos gintaro rūgšties ar kitais karboksiliniais anhidridais. Modifikuojant šiais agentais, pakeičiamas liekanos krūvis į priešingą lizinilui krūvį. Kiti amino grupes turinčių liekanų modifikavimui tinkami reagentai apima imidoesterius, tokius, kaip metilpikolininidatas; piridoksalfosfatas; pirodoksalis, chlorborhidridas, trinitrobenzensulf o rūgštis, O-me t i 1 i zoka rbaraiaas , 2,4-pentandioiis ir transaminaze katalizuojama leakcija su glioksilatu.
[0383] Argmilo liekanos modifikuojamos vienu ar keliais įprastais reagentais, tarp jų: fenilglioksaL:s, 2,3-bu-tandionas, 1,2-cikloheksandionas ir ninhidrinas. Modifikuojant arginilo liekanas, reakcija turi būti atliekama šarminėje terpėje dėl aukštos guanidino grupės pKa- Šie reagentai taip pat gali reaguoti ir su lizino grupe, taip kaip ir su arginino liekanos e-amino grupe.
[0384] Specifinė tirozilo liekanos modifikacija gali būti atliekama, norint įvesti spektrometrines žymes, vykdant reakciją su aromatiniais diazonio junginiais arba su tetranitrometanu. Paprastai naudojami N-acetilimidizo-las ir tetranitrometanas, reakcijos metu susidaro O-acetiltirozilo junginiai ir 3-nitro dariniai, atitinkamai. Per tirozilo liekanas įvedamas radioaktyvus jo-das chloramino T metodu, aprašytu aukščiau, tam naudojamas 125J ar 131J, ir tokie dariniai yra naudojami radioimunoanalizėj e.
[0385] Šoninės karboksilinės grupės (aspartilo ar glutamilo) selektyviai modifikuojamos reakcijomis su karbo-diimidais (R-N=C=N-R' ) , kur R ir R' yra skirtingos alkilo liekanos. Tokie karbodiimidai gali būti 1-ciklo-heksil-3-(2-morfonilinil-4-etil)karbodiimidas arba 1-etil-3-(4-azonio-4,4-dimetilpentil)karbodiimidas. Asparagino ir glutamino rūgščių liekanos gali būti pakeistos su amonio jonais į asparaginilo ir glutaminilo liekanas.
[0386] Modifikavimas su difunkcinais agentais yra tinkamas rnpl ligando prisiuvimui prie vandenyje netirpios matricos arba paviršiaus, kad gryninant būtų galima naudoti anti-mpl ligando antikūnus ir atvirkščiai. Įprastai naudojami susiuvantys agentai yra šie: pvz., 1,1-di(diazoacetil)-2-feniletanas, glutaraldehidas, N-hidroksisukcinimido esteris, pavyzdžiui 4-azidosali-cilo rūgšties esteris, homodifunkcionalus imidoesteri.c:, įskaitant disukcinimid:iesterį tokį, kaip 3,3'ditic-bis ( sukcinimidilpropionatas) , ir difunkcionalūs maleir-imidai, tokie, kaip bis-N-maleinimido-1,8-oktanas . Mo-difikuojantys agentai, t.okie, kaip rne t i 1-3 - [ (p-a z icl fenil) ditio] propioimidatas, sudaro fotoaktyvius tarpinius produktus, kuriuos galima susiūti ( prijungti) paveikus šviesa. Taip pat baltymų imobilizacij ai gali būti naudojamos reakcingos, vandenyje netirpios matricos tokios, kaip cianbromidu aktyvuoti angliavandeniai, ir reakcingos matricos, aprašytos JAV patentuose: 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537; ir 4330440.
[0387] Glutaminilo ir asparagilo liekanos yra dažnai deamidinamos iki atitinkamų glutamilo ir aspartilo liekanų. Šios liekanos deamidinamos neutralioje arba šarminėje terpėje. Deamidintos šių liekanų formos taip pat yra šio išradimo dalis.
[0388] Kitos modifikacijos apima prolino ir lizino hidro-ksilinimą, serino ar treonino hidroksilinių grupių fosforilinimą, lizino, arginino ir histidino šoninių grandinių a-amino grupių metilinimą (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]), N galo amino grupės acetilinimą ir bet kokios C galinės karboksilinės grupės amidinimą.
[0389] Kiti mpl ligando polipeptido kovalentinės modifikacijos tipai, esantys šio išradimo sferoje, apima natyvaus polipeptido glikozilinimo pakeitimus. Tai reiškia vieno ar kelių angliavandenių komponentų, sutinkamų natyviame mpl ligande, pašalinimą ir/arba vieno ar kelių angliavandenių, nesutinkamų natyviame mpl ligande, pridėjimą.
[0390] Paprastai polipeptidų glikozilinimas būna per N atomą arba per O atomą. N glikozilinimas vyksta, prijungiant angliavandenio grandinę prie asparagino liekanos. Tripeptidinės sekos: asoa raginas-X-ser mas ir asparaginas-X-treoninas, kur X yra bet kokia amino rūgščių liekana, išskyrus prolino liekaną, yra fermentiniu būdu atliekamo angliavandenio grandinės prijungimo prie asparagino liekanos vieta. Taigi, kai yra šių trijų amino rūgščių liekanų tokios sekos, tai polipeptidas turi potencialią glikozilinimo vietą. O glikozilinimas vyksta prijungiant vieną kurį nors angliavan-denį - N- acetilgalaktozaminą, galaktozę ar ksilozę prie hidroksiamino rūgšties liekanos, paprastai prie serino ar treonino liekanos; bet gali jungtis ir prie 5- hidroksiprolino ar 5- hidroksilizino liekanų.
[0391] Papildomos glikozilinimo vietos mpl ligando polipeptide yra padaromos, pakeičiant amino rūgščių liekanas taip, kad būtų vienas ar keli aukščiau aprašyti tripeptidai ( N glikozilinimas) . Glikozilintų polipep-tidų variantai gali būti padaromi, papildant ar pakei-čiant vieną arba kelias serino ar treonino liekanas natyvaus mpl ligando sekoje ( 0 glikozilinimas). Mpl ligando amino rūgščių liekanų seka yra pakeičiama, padarant pakeitimus DNR lygyje, dažniausiai atliekant mutagenezę DNR, koduojančios mpl ligando polipeptidą, pakeičiant kodonus taip, kad jie transliuotų norimas amino rūgščių liekanas. DNR mutacija ( mutacijos) gali būti atliktos, naudojant metodus, aprašytus aukščiau, skyriuje " mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantai".
[0392] Angliavandenių liekanų skaičiaus padidinimą mpl ligando polipeptide galima atlikti taip pat ir fermentiniu ar cheminiu būdais. Šie metodai patogūs tuo, kad tada nereikia polipeptido ekspresiją atlikti sudėtin-gesnėse ląstelėse, kuriose vyksta N ir 0 glikozilinimas. Priklausomai nuo naudojamo metodo, angliavan-denis (angliavandeniai) gali būti prijungti prie (a) arginino ir histidino, (b) prie laisvų karboksilinių grupių, (c) prie laisvų sulfhidrilo grupių tokių, kaip cišteino, (d) laisvų hidroksilo grupių tokių, kaip serino, treonino ar hidroksiprolino, (e) prie aromati-nių liekanų tokių, kaip fenilalanino, tirozino ar triptofano ar (f) rrie amidinių glutamino grupių. Šie metodai aprašyti WC 37/05330, publikuotame 1S87.09.11. ir Aplin ir Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 [1981].
[0393] Angliavandenių, esančių mpl ligando polipeptido grandinėje, pašalinimą galima atlikti cheminiu ar fermentiniu būdais. Deglikozilinant cheminiu būdu, polipeptidas paveikiamas trifluormetansulfo rūgštimi ar ekvivalenčių junginiu. Šiuo būdu yra pašalinamos dauguma ar visos angliavandenių liekanos, išskyrus jun-giančius angliavandenius (N-acetilgliukozaminą ar N-acetilgalaktozaminą) , išlaikant nepažeistą polipeptidą. Cheminis deglikozilinimas aprašytas Hakimuddin, et al. , Arch. Biochem. Biophys. , 259:52 [1987] ir Edge et al., Anai. Biochem., 118:131 [1981]. Fermentinis angliavan-denių pašalinimas nuo polipeptidų grandinių gali būti atliekamas įvairiomis endo- ir egzoglikozidazėmis, kaip aprašyta Thotakura et al. , Meth. Enzymol., 138:350
[0394] [1987].
[0395] Glikozilinimas potencialiose glikozilinimo vietose gali būti blokuojamas, naudojant tunikamiciną, kaip aprašyta Duskin et al., J. Biol. Chem., 257:3105
[0396] [1982]. Tunikamicinas blokuoja baltymo ir N-glikozido ryšio susidarymą.
[0397] Kitas mpl ligando modifikavimo tipas apima prijun-gimą prie mpl ligando kurį nors iš daugelio nebaltymi-nių polimerų, pvz. , polietilenglikolį, polipropilengli-kolį ar polioksialkileną, būdu, pateiktu JAV patentuose: Nr. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 ir 4179337 . Kovalentiš kai modifikuoti šiais polimerais mpl ligando polipeptidai šiame išradime vadinami sukabintais ("pegylated") mpl ligando polipeptidais .
[0398] Suprantama, kad turi būti atliekamas išskirto mpl ligando varianto atrinkimas paoai jo sąveiką su mpl, o atrinktas mpl ligando varianta- turi pasižymėti imuno-biologiniu ir/arba biologiniu aktyvumu, kaip aprašyta aukščiau, mpl ligando variar.i :s gali būti atrenkamas pagal stabilumą rekombinantinėj e ląstelų kultūroje ar plazmoje ( pvz., atsparumas proteolizei), pagal afiniš-kumą mpl nariui, pagal atsparumą oksidacijai, pagal produkcijos lygį ir kitas sąvybes. Pavyzdžiui, imunolo-ginių mpl ligando polipeptido savybių, tokių kaip afi-niškumas pasirinktiems antikūnams, pakeitimai gali būti įvertinami konkurentine imunoanalize. Kitos baltymų ar polipeptidų savybių modifikacijos, tokios, kaip atsparumas redukcijos- oksidacijos procesams, terminis atsparumas, hidrofobiškumas ar atsparumas proteolizei, gali būti įvertinamos gerai žinomais metodais. 17. Antikūnų prieš mpl ligandą gavimas:
[0399] Polikloniniai antikūnai prieš mpl ligandą arba jo fragmentus paprastai yra gaunami, gyvūnams po oda (sc) arba į pilvo ertmę (ip) keletą kartų suleidžiant mpl ligandą kartu su adjuvantu. Geriausia konjuguoti mpl ligandą arba jo fragmentą, kuriame yra reikalinga amino rūgščių seka (seka-taikinys) , su tokiu baltymu, kuris yra imunogeniškas imunizuojamam gyvūnui, pvz., mo-liuskų hemocianinu, serumo albuminu, jaučio tiroglobu-linu arba sojos pupelių tripsino inhibitoriumi, naudojant difunkcinį arba modifikuojantį agentą, pavyzdžiui, maleinimidobenzoil-sulfosukcinimido esterį (prijungimas per cisteino liekaną) , N-hidroksisukcinimidą (per lizino liekaną), glutaro aldehidą, sukcino anhidridą, SOCI2, arba R1N=C=NR, kur R ir R1 yra skirtingos alkilo grupės .
[0400] Imunizuojant mpl ligandu ar jo fragmentais, gyvū-nams keliose vietose po odą suleidžiama nuo 1 mg iki 1 ųg (triušiams arba pelėms, atitinkamai) peptido arba konjugato, suspenduoto 3 tūriuose pilno Freund'o adju-vanto. Po mėnesio gyvūnams keliose vietose po oda suleidžiama nuo 1/ 5 iki 1/ 10 peptido arba konjugato pradinio kiekio, suspenduoto pilname Freund' o adjuvan-te. Po 7- 14 dienų iš gyvūnų paimamas kraujas ir serume nustatomas antikūnų prieš mpl ligandą titras. Gyvūnai pakartotinai imunizuojami tol, kol pasiekiamas pakankamai aukštas titras. Tikslinga pakartotinai imunizuoti gyvūnus to paties ligando konjugatu, bet konjugavimui naudoti kitą baltymą arba kitą konjugavimo agentą. Agreguoj antys agentai, tokie kaip aliuminis, naudojami imuninio atsako sustiprinimui.
[0401] Monokloniniai antikūnai yra išskiriami iš homoge-niškų antikūnų populiacijos, t. y., individualūs antikū-nai yra visiškai identiški visai populiacijai, išsky-rus retai pasitaikančias mutantines molekules, kurios gali atsirasti dėl natūraliai vykstančių mutacijų. Taigi, terminas " monokloniniai" rodo, kad antikūnai nėra skirtingų antikūnų mišinys.
[0402] Pavyzdžiui, šiame išradime aprašyti monokloniniai antikūnai prieš mpl ligandą gali būti gauti hibrido-minės technologijos būdu pagal Kohler'io ir Milstein'o metodą ( Nature, 256:495, 1975), arba rekombinantinės DNR metodais (JAV patentas Nr.4816567, Cabilly ir kt.).
[0403] Naudojant hibridominės technologijos metodą, pelė arba kitas tinkamas gyvūnas, pavyzdžiui, žiurkėnas, yra imunizuojamas aukščiau aprašytu būdu, kad limfocitai pradėtų produkuoti specifinius antikūnus prieš imuni-zacijai naudotą baltymą. Yra ir alternatyvus limfocitų in vitro imunizacijos būdas. Po to limfocicai suliejami su mi e lomos ląstelėmis, naudojant tinkama suliejimo agentą, pavyzdžiui, polietilenglikolį, kad susiformuotų hibridominė ląstelė (Goding, Monoclonal Ar.tibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Acaderr.ic Press, 1986) .
[0404] Tokiu būdu gautos hibridominės ląstelės išsėjamos ir auginamos tinkamoje terpėje, kurioje yra viena arba keletas medžiagų, inhibuoj ančių nehibridinių, tėvinių mielomos ląstelių augimą. Pavyzdžiui, jeigu tėvinės mielomos ląstelės neturi fermento hipoksantin-guanin-fosforiboziltransferazės (HGPRT arba HPRT), hibridomų auginimo terpėje paprastai turi būti hipoksantino, aminopterino ir timidino (HAT terpė), kurie sustabdo HGPRT neturinčių ląstelių augimą.
[0405] Paprastai pasirenkamos tokios mielomos ląstelės, kurios efektyviai hibridizuojasi, užtikrina stabilią antikūnų ekspresiją po suliejimo su atitinkama anti-kūnus produkuojančia ląstele, o taip pat yra jautrios tam tikrai terpei, pavyzdžiui, HAT terpei. Iš tokių mielomos ląstelių linijų dažniausiai pasirenkamos pelės mielomos ląstelių linijos, tokios kaip MOPC-21 ir MPC-11 (Salk Institute Distribution Center (Salk'o ląste-lių centras),San Diego, Kalifornija, JAV) bei SP-2 ląstelės (American Type Culture Collection, Rockville, Merilendas, JAV). Taip pat yra aprašytos žmogaus mielomos bei pelės-žmogaus heteromielomos ląstelių linijos, kurios gali būti panaudotos žmogaus monokloninių anti-kūnų gavimui (Kozbor, J.Immunol., 133:3001 [198 4]; Brodeur ir kt., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Markei Dekker, Inc., New York, 1987) .
[0406] Terpėje, kurioje auga hibridomos, yra tikrinama monokloninių antikūnų prieš mpl ligandą produkcija. Paprastai monokloniniu antikūnų specifiškumas tikrinamas imuniprecipitaci -os būdu arba in vitro metodais, tokiais kaip radioim'jr.: nis metodas (RIA) arba imunofer-mentinis metodas (ELISAs .
[0407] Monokloninių ant:. - ūnų afiniškumas (sąveikos tvir-tumas) gali būti i ertintas Scatchard'o analizės pagalba pagal Munsor. :: Polard, Anai. Biochem., 107:220
[0408] [1980]. • Nustačius, kad hibridominės ląstelės produkuoja norimo specifiškumo ir afiniškumo antikūnus, pradiniai klonai yra subklonuojami didėjančių praskiedimų metodu ir auginami kaip įprasta ( Goding, žr aukščiau). Šiam tikslui tinka tokios terpės, kaip DMEM arba RPMI- 1640. Be to, hibridomos gali būti auginamos in vivo , kaip gyvūno ascitinis auglys.
[0409] Subklonų produkuojami monokloniniai antikūnai paprastai išskiriami iš terpės, ascitinio skysčio arba serumo, naudojant įprastas imunoglobulinų gryninimo pro-cedūras, pavyzdžiui, chromatografiją ant baltymo A- Se-farozės arba hidroksilapatito, elektroforezę gelyje, dializę arba afininę chromatografiją.
[0410] Šiame išradime aprašytus monokloninius antikūnus koduojanti DNR yra išskirta ir sekvenuota, naudojant įprastas procedūras (t.y., naudojant oligonukleotidų sekas, kurios specifiškai sąveikauja su genų, koduojan-čių pelės antikūnų lengvąsias ir sunkiąsias grandines, sekomis). Ši DNR paprastai išskiriama iš hibridominių ląstelių. Išskirta DNR gali būti perkelta Į ekspresijos vektorius, kurie po to tranfekuojami į ląstelę-šeimi-ninką, pavyzdžiui, į beždžionių COS ląteles, žiurkėnių kiaušidžių ląsteles (CHO) arba į neprodukuojančias imunoglobulinų mielomos ląsteles, tokiu būdu užtikri-nant monokloninių antikūnų sintezę rekombinantinėj e ląstelėje-šeimininke. DNR taip pat gali būti modifikuo-jama, pavyzdžiui, žmogaus sunkiųjų ir lengvųjų gran-dinių pastoviuosius domenus koduojančiomis DNR sekomis pakeičiamos homologiškos pelės DNR sekos (Cabilly ir kt, žr. aukščiau, Morrison ir kt . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851 [1984 ]), arba prie imunoglobulinus koduojančios DNR sekos kovalentiškai prijungiama kitokį polipeptidą koduojanti seka arba jcs dalis.
[0411] Pakeitus tokį ne imunoglobu1 ininės kilmės baltymą šiame išradime aprašytų antikūnų pastoviuoju domenu,
[0412] .ji'ba šių antikūnų antigeną jungiančiosios vietos
[0413] kintamuoju domenu, sukuriami bivalentiniai chimeriniai antikūnai, kuriuose yra dvi antigeną jungiančiosios vietos - viena specifiška mpl ligandui, kita specifiška kitam antigenui.
[0414] Chimeriniai arba hibridiniai antikūnai taip pat gali būti gaunami in vitro, naudojant gerai žinomus baltymų cheminės sintezės metodus arba prijungimo agen-tus. Pavyzdžiui, galima sukonstruoti imunotoksinus, naudc jar.t disulfidų mainų reakciją arba įvedant tio-eterinį ryšį. Šiam tikslui tinka tokie reagentai, kaip iminotiolatas ir metil-4-merkaptobutirimidatas .
[0415] Norint pritaikyti aprašytus antikūnus diagnosti-niams tikslams, reikia pažymėti vieną iš komponentų. Šis komponentas turi tiesiogiai ar netiesiogiai sukelti signalą, kurį galima išmatuoti. Pavyzdžiui, tokia žymė gali būti radioizotopas, toks kaip 3H, 14C, 32P, 35S arba 125I, fluorescuojantis arba chemiliuminescuoj antis junginys, toks kaip fluoresceino izotiocianatas, rodaminas arba liuciferinas, o taip pat fermentai, tokie kaip šarminė fosfatazė, beta-galaktozidazė arba krienų peroksidazė.
[0416] Šiam tikslui gali būti panaudotas bet kuris žino-mas antikūnų žymėjimo metodas, pavyzdžiui, metodai, aprašyti Hunter ir kt., Nature, 144:945 [1962], David ir kt., Biochemistry, 13:1014 [1974]; Pain ir kt., J. Immun. Meth., 40:219 [1981], Nygren, J. Hystochem. and Cytochem., 30:407 [1982],
[0417] Šiame išradime aprašyti antikūnai gali būti panaudoti bet kokiam žinomam analizės metodui, pavyzdžiui, konkurenciniam analizės metodui, tiesioginei ir netie-sioginei dviepitopinei analizei, o taip pat imunopreci-pitacijai (Zola, Monocioni'. Antibodies: A iManual of Techniąues, pp. 147-158, C?- C Press, Inc., 1987).
[0418] Konkurentiniai analizes metodai remiasi tuo, kad žymėtas standartas (tai -: ^ i i būti mpl ligandas arba imunologiškai aktyvus jo fragmentas) konkuruoja su testuojamajame pavyzdyje esančiu mpl ligandu dėl sąvei-kos su antikūnais, mpl ligando kiekis testuojamajame pavyzdyje yra atvirkščiai proporcingas standarto, prisijungusio prie antikūnų, kiekiui. Kad būtų galima nustatyti, kiek standarto prisijungė prie antikūnų, paprastai antikūnai yra imobilizuojami arba išsodinami - tokiu būdu yra atskiriami prisijungę ir neprisijungę prie antiTcūnų standartas bei analizuojamasis ligandas.
[0419] Dviepitopinėj e analizėje yra naudojami dveji antikūnai, kurių kiekvienas atpažįsta skirtingas anali-zuojamojo baltymo ( mpl ligando) imunogeniškas sekas, arba epitopus. Dviepitopinėj e analizėje antigenas sąveikauja su pirmaisiais antikūnais, imobilizuotais kietoje fazėje, o po to antrieji antikūnai prisijungia prie antigeno, tokiu būdu sudarydami netirpų trijų komponentų kompleksą ( David ir Green, JAV patentas Nr. 4376110). Antrieji antikūnai gali būti žymėti ( tie-sioginė dviepitopinė analizė), arba jų kiekis išmatuo-jamas, naudojant žymėtus anti- imunoglobulininius anti-kūnus ( netiesioginė dviepitopinė analizė) . Pavyzdžiui, viena iš dviepitopinės analizės modifikacijų yra imuno-fermentinė analizė, kai naudojama fermentinė žymė
[0420] Garai žinomi metodai, kurių pagalba ne žmogaus kilmės antikūnai gali būti humanizuojami. Paprastai humanizuotuose antikūnuose yra įterpta viena arba daugiau ne žmogaus kilmės amino rūgščių liekanų. Šios ne žmogaus kilmės amino rūgščių liekanos dažnai vadinamos "pernešimo" liekanomis ir paprastai yra paimamos iš "pernešamo" kintamojo domeno. Humanizaciją galima atlikti metodais, pasiūlytais Winter ir kt. (Jonės ir kt., Nature, 321:522:525 [1986]; Riechmann ir kt. , Nature, 332:323-327 [1S88]; Verhoeyen ir kt., Science, 239:1534-1536 [1988]), pakeičiant graužikų CDR sekas atitinkamomis žmogaus antikūnų sekomis. Atitinkamai, tokie "humanizuoti" antikūnai vadinami chimeriniais (Cagilly et al ., supra ), jeigu juose žymiai mažiau nei intaktinis kintamasis domenas (t.y., ne visas domenas) yra pakeičiamas atitinkama ne žmogaus kilmės amino rūgščių seka. Praktiškai, humanizuoti antikūnai yra tipiški žmogaus antikūnai, kuriuose kai kurios CDR, o kartais ir kai kurios FR amino rūgščių liekanos pakeistos analogiškomis graužikų antikūnų sekomis.
[0421] Siekiant sumažinti imunogeniškumą, labai svarbu pasirinkti žmogaus imunoglobulinų sunkiųjų ir lengvųjų grandinių kintamuosius domenus, tinkamus humanizuotų antikūnų gavimui. Tam gali būti naudojamas "geriausio atitikimo" metodas, kai graužikų antikūnų kintamojo domeno seka yra palyginama su visų žinomų žmogaus imunoglobulinų kintamųjų domenų sekų biblioteka. Ta žmogaus imunoglobulinų seka, kuri labiausiai panaši į graužikų imunoglobulinų seką, pasirenkama kaip karkasas (framework, FR) humanizuotiems antikūnams gauti (Sims ir kt. , J. Immunol., 151:2296 [1993]; Chothia ir Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 [1987]). Naudojant kitą metodą, pasirenkamas tam tikras karkasas, gautas iš bendros (konsensinės) visiems žmogaus antikūnams amino rūgščių sekos, kuri sudaro tam tikrą lengvųjų ir sunkiųjų grandinių pogrupi. Tas pats karkasas gali būti naudojamas keliems skirtingiems humanizuotiems antikūnams gauti (Carter ir kt. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 [1992]; Presta ir kt. , J. Immunol., 151:2623
[0422] [1993]) .
[0423] Taip pat labai svarbu, kad atlikus antikūnų huma-nizaciją būtų išsaugotas jų aukštas afiniškumas ir kitos svarbios biologinės savybės. Siekiant šio tikslo, pasirenkamas toks metodas, kai humanizuotų antikūnų ruošimo metu y:a analizuojamos pradinės sekos ir įvairūs humanizuoti produktai, naudojant pradinių ir humanizuotų sekų erdvinės struktūros modelius. Imuno-globulinų erdvinės struktūros modeliai yra visiems prieinami ir gerai žinomi šios srities specialistams. Sukurtos kompiuterinės programos, kurios iliustruoja ir pademonstruoja tam tikros pasirinktos imunoglobulinų sekos galimas erdvinės konformacijos struktūras. Analizuojant šiuos modelius, galima įvertinti tam tikrų amino rūgščių liekanų reikšmę tiriamos imunoglobulinų sekos funkcijoms, t.y., galima analizuoti amino rūgščių liekanas, kurios yra svarbios tiriamos imunoglobulinų sekos sąveikai su antigenu. Tokiu būdu, galima pasirinkti tokias FR sekas ir tokias "pernešimo" sekas, kad antikūnams būtų suteiktos tam tikros reikalingos savy-bės, pavyzdžiui, didelis afiniškumas antigenui. Apskri-tai, CDR sekos turi tiesioginę įtaką sąveikai su antigenu (JAV paraiška išradimui Nr.07/934373, pateikta 1992.08.21., kuri yra paraiškos Nr. 07/715272, pateiktos 1991.06.14., tęsinys).
[0424] Kita vertus, šiuo metu galima gauti transgeninius gyvūnus (pvz., peles), kuriuose po imunizacijos susidaro vien tik žmogaus antikūnai ir visai nevyksta endogeninių imunoglobulinų sintezė. Pavyzdžiui, buvo aprašyta, kad homozigotinė delecija antikūnų sunkiosios grandinės sujungimo srities genų (JH) srityje visiškai inhibuoja endogeninių antikūnų produkciją chimerinėse ir mutantinėse pelėse, turinčiose mutaciją nepertvarky-tame imunoglobulinų gene (germ-iine mutant). Kai į tokią mutantinę pelę perkeliamas r,epertvarkytas žmogaus imunoglobulinų genas, po stimuliacijos antigenu prasideda žmogaus imunoglobulinų sintezė (Jakobovits ir kt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 [1993]; Jakobovits ir kt. , Nature, 362:255-258 [19 93]; Bruggermann ir kt . , Year in Imr.uno., 7:33 [1993]). Žmogaus antikūnai taip pat gal: būti gaunami ragų bibliotekų pagalba (Hoogenboom :r Winter, J. Mol. Biol., 227, 381, [ 1991] ; Marks ir k t. , J. Mol. Biol. , 222, 581 [ 1991]).
[0425] Bispecifiniai antikūnai yra monokloniniai anti-kūnai, paprastai žmogaus arba humanizuoti antikūnai, kurie yra specifiški mažiausiai dviems skirtingiems antigenams. Yra žinomi bispecifinių antikūnų gavimo metodai.
[0426] Tradiciškai, rekombinantiniai bispecifiniai anti-kūnai gaunami, atliekant dviejų imunoglobulinų lengvųjų grandinių-sunkiųjų grandinių porų ko-ekpresiją, kai abi sunkiosios grandinės turi skirtingą specifiškumą
[0427] (Milstein ir Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Dėl imunoglobulinų lengvųjų ir sunkiųjų grandinių įvairovės tokios hibridomos (kvadromos) produkuoja 10 skirtingų antikūnų molekulių mišinį, kurių tik viena turi teisin-gą bispecifinę struktūrą. Šių teisingos struktūros antikūnų išvalymas (tam paprastai naudojama afininė chromatografija), yr^ gana sudėtingas, o išeigos mažos. Panašios procedūros aprašytos PCT publikacijoje WO 93/08829 (publikuota 1993.05.13.), o taip pat Trauhecker ir kt. , EMBO, 10:3655-3659 [1991] .
[0428] Yra ir kitas, tinkamesnis būdas, kai reikiamo spe-cifiškumo kintamieji domenai (antikūno-antigeno sąvei-kos sritys) yra sujungiami su imunoglobulinų pastoviųjų domenų sekomis. Paprastai tokiam junginiui naudojamas sunkiosios grandinės pastovusis domenas, kuriame turi būti bent dalys šarnyrinės (hinge) , CH2 ir CH3 sričių. Be to, bent viename iš junginių turėtų būti ir pirmojo sunkiosios grandinės domeno (CH1) dalis, kurioje yra sritis, būtina lengvosios grandinės prisijungimui. DNR, koduojanti imunoglobulinų sunkiosios grandinės junginius ir, je:gu reikia, imunoglobulinų lengvąja grandi-nę, yra įterpiama į skirtingus ekspresijos vektorius ir vienu metu c ransfekuojama į tinkamą ląste 1 ę-šeirr-.ininką. Transfekuotose ląstelėse stebima didelė galimų kombina-cijų įvairovė, skirtingomis tarpusavio proporcijomis susirenkant šiems trims polipeptidiniams fragmentams, kadangi esant šių trijų polipeptidinių grandinių tam tikram nevienodam santykiui užtikrinama optimali išeiga. Tačiau įmanoma dvi ar visas tris polipeptidinių grandinių koduojančias DNR sekas įterpti į vieną ekspresijos vektorių, kai siekiama didelės bent dviejų polipeptidinių grandinių ekspresijos, esant vienodam jų santykiui, arba kai šios proporcijos neturi didelės reikšmės. Pasirenkant šį būdą, bispecifiniai antikūnai yra sukonstruojami iš hibridinės imunoglobulinų sunkiosios grandinės, turinčios vienokį specifiškumą, ir iš hibridinės imunoglobulinų sunkiosios grandinės - lengvosios grandinės poros, turinčios kitokį specifiškumą. Buvo nustatyta, kad tokią .asimetrinę struktūrą, turin-čią bispecifinį komponentą, lengviau atskirti nuo kitų nereikalingų imunoglobulinų grandinių kombinacijų, kadangi imunoglobulinų lengvąsias grandines turi tik pusė bispecifinių molekulių. Šis būdas aprašytas parai-škoje išradimui Nr.07/931811, pateiktoje 1992.08.17.
[0429] Detaliau bispecifinių antikūnų gavimo metodai aprašyti Suresh ir kt. , Methods in Enzymol., 121:210
[0430] [1986] .
[0431] Heterokonjuguoti antikūnai taip pat yra šio išra-dimo dalis. Heterokonjuguoti antikūnai yra sukompo-nuojami iš dviejų kovalentiškai sujungtų antikūnų. Tokie antikūnai buvo sukurti tam, kad, pavyzažiui, būtų galima nukreipti imuninės sistemos ląsteles atakuoti nepageidautinas ląsteles (JAV patentas Nr. 4676980), arba kad būtų galima gydyti ŽIV infekciją (PST publi-kacija WO 91/00360 ir WO 92/00373, EP 0308S;. Hetero->:onj uguotus antikūnus galima sukonstruoti, naudojant m e t kokį įprastą konjugavimo metodą. Tinkami prijungimo agentai yra gerai žinomi ir aprašyti JAV patente Nr. 4676980, kartu pateikiant ir keletą konjugavimo metodų. IV. Megakariocitopoetinio baltymo - mpl ligando - panaudojimas terapijoje.
[0432] Biologiškai aktyvus mpl ligandas, atliekantis hematopoetinio efektoriaus funkciją ir aprašytas čia kaip megakariocitopoetinis arba trombocitopoetinis baltymas (TPO), steriliai paruošus jo vaistinę formą, gali būti naudojamas megakariocitopoetinės arba trom-bocitopoetinės funkcijos stimuliavimui, gydant trombo-citopeniją, atsiradusią dėl susilpnėjusios trombocitų produkcijos arba jų destrukcijos. Kaulų čiulpų hipoplazija, susijusi su trombocitopenija (pvz., aplastinė anemija po chemoterapijos arba kaulų čiulpų persodi-nimo), o taip pat ir kiti susirgimai, tokie kaip išsė-tinė intravaskulinė koaguliacija (DIC), imuninė trombocitopenija (tarp jų ŽIV sukelta ITP arba ne ŽIV sukelta ITP), chroniška idiopatinė trombocitopenija, kongenitalinė trombocitopenija, mielodisplazij a ir trombotinė trombocitopenija, gali būti efektyviai gydomi šiame išradime aprašytais komponentais. Be to, šie megakariocitopoetiniai baltymai gali būti panau-dojami, gydant mieloproliferacines ligas, o taip pat trombocitozes, atsiradusias dėl uždegimų arba geležies trūkumo.
[0433] Tikslingiausia šiame išradime aprašytą megakario-citopoetinį arba trombocitopoetinį baltymą (TPO) naudoti mielotoksinei chemoterapijai, gydant leukemiją arba kietus auglius, mieloabliatyvinei terapijai auto-loginės arba alogeninės kaulų čiulpų tranplantacijos atveju, o taip pat mielodisplazijos, idiopatinės aplas-tinės anemijos, kongenitalinės trombocitopenijos bei imuninės trombocitopenijos atvejais.
[0434] Kiti susirgimai, kurie gali būti sėkmingai gydomi šiame išradime aprašytu megakariocitopoetiniu baltymu,
[0435] yra trombocitų defektai arba pažeidimai, atsiradę dėl \ vaistų ar nuodų poveikio arba aktyvacijos, vykstant \ sąveikai su dirbtiniu paviršiumi. Šviais atvejais minė-tas baltymas gali būti naudojamas stimuliuoti naujų, nepažeistų trombocitų atsparumą. Visas galimų pritai-kymo variantų sąrašas pateiktas Šio išradimo esmės aprašyme, o ypač jo (a)-(f) dalyse ir ten cituojamuose šaltiniuose.
[0436] Megakariocitopoetiniai baltymai, aprašyti šiame išradime, gali būti naudojami vieni arba kombinuojant juos su kitais citokinais, hemopoetinais, interleu-kinais, augimo faktoriais arba antikūnais, gydant minėtus susirgimus. Taigi, šie aprašyti komponentai gali būti naudojami kartu su kitais trombopoetinį aktyvumą turinčiais baltymais arba peptidais, tarp jų G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, eritropoetinu (EPO), kit-ligandu, IL-6 ir IL-11.
[0437] Megakariocitopoetiniai baltymai, aprašyti šiame išradime, sumaišomi su nešikliais, tinkančiais vaisti-nių preparatų gamybai. Tokia vaistinė forma gali būti naudojama intraveninėms injekcijoms arba inhaliacijoms per nosį arba plaučius. Ši vaistinė forma taip pat gali būti suleidžiama po oda arba parenteraliniu būdu. Pa-ruoštas nuolatiniam vartojimui, šis preparatas turi būti nepirogeniškas, ištirpintas tinkamame injekcijoms tirpale su atitinkamu pH, tam tikro izotoniškumo bei stabilumo. Šios sąlygos gerai žinomos šios srities specialistams. Trumpai tariant, šiame išradime aprašytų komponentų vaistinės formos yra paruošiamos vartojimui arba saugojimui, į atitinkamai išgrynintus komponentus pridedant fiziologiškai priimtinų nešiklių arba stabi-lizatorių. Šios medžiagos yra netoksiškos, vartojant jas reikiamomis dozėmis, o į jų sudėtį įeina buferinių tirpalų komponentai, tokie kaip fosfatai, citratai, acetatai arba kitokios organinių rūgščių druskos; antioksidantai, tokie kaip askorbino rūgštis; mažo molekulinio svorio (mažiau nei 10 amino rūgščių liekanų) peptidai, tokie kaip poliargininas; baltymai, tokie kaip serumo albuminas, želatina arba imunoglobulinai; hidro-filiniai polimerai, tokie kaip polivinilpirolidinonas; amino rūgštys, tokios kaip glicinas, gliutamatas, aspartatas, argininas; monosacharidai, disacharidai ir kiti angliavandeniai, tarp jų celiuliozė arba jos dariniai, gliukozė, manozė arba dekstrinai; chelatiniai agentai, tokie kaip EDTA; sacharidai, tokie kaip mani-tas arba sorbitas, jonai, tokie kaip natrio jonai, ir/arba nejoninės paviršiaus aktyvios medžiagos, tokios kaip Tween, Puronics arba polietilenglikolis.
[0438] Apie 0,5-500 mg megakariocitopoetinio baltymo arba šių baltymų mišinio (tai gali būti jų rūgštinė, šarminė forma arba vaistinei formai tinkama druska) sumaišoma su fiziologiškai priimtinu nešikliu, užpildu, stabili-zatoriumi, konservantu ir t.t., kaip įprasta vaistų gamybos praktikoje. Aktyvaus komponento kiekis turi atitikti reikiamą dozę.
[0439] Sterilūs tirpalai injekcijoms paruošiami taip, kaip įprasta farmacijos praktikoje. Pavyzdžiui, aktyvusis komponentas ištirpinamas arba suspenduojamas vandenyje arba natūraliame augaliniame aliejuje, pavyz-džiui, sezamo, riešutų arba medvilnės sėklų aliejuje arba sintetinėse riebiosiose rūgštyse, tokiose, kaip etilo oleatas ar panašiose. Buferinės medžiagos, kon-servantai, antioksidantai ir kt., gali būti irgi pridedami, kaip įprasta farmacinėje praktikoje.
[0440] Kad būtų palaikoma pastovi preparato koncentracija, naudojamos pusiau pralaidžios matricos iš kietų hidrofobinių polimerų, kurie suformuoja mikrokapsules su ten esančiu polipeptidu. Tokių pusiau pralaidžių membranų pavyzdžiai gali būti poliesteriai, hidrogeliai (pvz., poli(2-hidroksietimetakrilatas), kaip aprašyta
[0441] Langer ir kt., J. Biomed. Mater. Res., 15:167- 277 [ 1981] ir Langer, Chem. Tech., 12:98- 105 [ 1982] arba polivinilalkoholis) , o taip pat poliaktidai ( JAV patentas Nr. 3773919, EP 58481), L- gliutamino rūgšties ir gama- etil- L- gliutamato kopolimerai ( Sidman ir kt., Biopolymers, 22:547- 556 [ 1983]), nesuyrantis etilenvinilacetatas ( Langer ir kt., supra), suyrantys pieno rūgšties- glikolio rūgšties kopolimerai, tokie kaip Lupron Depot™ ( mikro- rutuliukai iš pieno rūgšties-glikolio rūgšties kopolimero ir leuprolido acetato) , ir poli- D-(-)- 3- hidroksibutiro rūgšties ( EP 133988).
[0442] Jeigu polimerai, tokie kaip etilenvinilacetatas ir pieno rūgšties- glikolio rūgšties kopolimerai, gali at-palaiduoti baltymo molekules daugiau kaip 100 dienų, kai kurie hidrogeliai atpalaiduoja baltymus trumpesnį laiką. Kai baltymas, uždarytas į kapsulę, išbūna organizme ilgą laiką, jis gali denatūruoti arba agreguoti, veikiamas drėgmės 37°C temperatūroje, ir dėl to gali netekti biologinio aktyvumo arba gali pasikeisti jo imunogeninės savybės. Priklausomai nuo šių pokyčių mechanizmo turi būti pasirenkama baltymo stabilizavimo strategija. Pavyzdžiui, jeigu vyksta agregacija dėl tarpmolekulinio S- S- ryšio susiformavimo, stabilizaciją galima atlikti, modifikuojant sulfhidrilines liekanas, liofilizuojant preparatą iš rūgštaus tirpalo, kontroliuojant drėgmę, naudojant tam tikrus priedus ir kuriant specifines polimerinių matricų kompozicijas.
[0443] Norint palaikyti pastovią megakariocitopoetinio baltymo koncentraciją, taip pat galima naudoti liposo-mose "uždarytą" megakariocitopoetini baltymą. Liposomos su jose "uždarytu" megakariocitopoetiniu baltymu paruo-šiamos šiais metodais: DE 3218121; Epstei ir kt., Proc. Natl. Acai. Sci. USA, 82:3688-3692 [ 19851; Hwang ir k t . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980]; EP 5232 2 ; EP 3667 6; EP 88046; EP 143949 ; E P 142641; paraiška Japonijos patentui 83- 118008; JAV patentai Nr. 4485045 ir 4544545 ir EP 102324. Paprastai liposomos yra mažos ( apie 200- 800 A), vienasluoksnės, ir jų sudėtyje būna daugiau nei 30 mol. procentų cholestero-lio - tikslesnės proporcijos pasirenkamos taip, kad būtų optimalus megakariocitopoetinio baltymo terapinis efektas.
[0444] Dozę turi nustatyti gydantis gydytojas, atsižvelg-damas į įvairius faktorius, galinčius turėti įtakos vaistų veikimui - ligos ūmumą ir tipą, kūno svorį, lytį, dietos laikymąsi, injekcijų laiką ir dažnį, kitų medikamentų vartojimą, o taip pat ir kitus klinikinius faktorius. Paprastai dienos norma yra 0, 1- 100 jj. g/ kg kūno svorio. Optimali dozė yra 0, 1- 50 p. g/ kg kūno svorio. Optimaliausia pradinė dozė yra 1- 5 p. g/ kg per dieną. Dozės yra panašios kaip ir kitiems citokinams, ypač G- CSF, GM- CSF, ir EPO. Terapiškai efektyvios dozės gali būti nustatomos in vitro arba in vivo metodais.
[0445] Tikimasi, kad šio aprašymo ir iliustracijų pakankama tam, kad bet kuris specialistas išsamiai atkartotų šį išradimą. Pateikiami darbiniai pavyzdžiai atsklei-džia optimalius išradimo variantus, bet neapriboja išradimo.
[0446] Dalinai išgrynintas kiaulės mpl ligandas Surenkama normalių ar kiaulių su aplastine anemija trombocitais neturtinga plazma. Kiaulių plazma padaroma aplastine, kiaules apšvitinant 900 cGy visam svoriui, spinduliavimo šaltiniu naudojamas 4 rnEV linijinis grei-tintuvas. Apšvitintoms kiaulėms atliekamas cefazolino injekcijos : raumenis 6-8 dienas. Po to visas jų kraujas surenkamas, esant pinai anestezijai, [ridėdama heparino ir centrifuguojama, esant 1800g, 30 minučių; taip gaunama plazma be trombocitų. Megakariocitus stimuliuojančio aktyvumo maksimumas būna po 6 dienų po apšvitinimo.
[0447] Į aplastinę kiaulių plazmą, gautą iš apšvitintų kiaulių, pridedama iki 4M NaCl ir maišoma 30 min. kambario temperatūroje. Gautos nuosėdos pašalinamos centrifūguojant (3800 aps/min) centrifūgoje Sorvall RC3B, supernatantas užnešamas ant kolonos su Phenyl-Toyopearl (220 ml), nulygsvarintos lOmM Na fosfatiniu buferiniu tirpalu, į kurį pridėta iki 4M NaCl. Kolona praplaunama tuo pačiu buferiniu tirpalu, kol A280 tampa mažesnis, nei 0,05, baltymai eliujuojami dH2Ū. Eliujuo-tų baltymų piko frakcija praskiedžiama dH2Ū iki 15 mS laidumo ir užnešamas ant Blue-Sepharose kolonėlės (240 ml) , nulygsvarintos PBS. Kolonėlė praplaunama penkiais kolonos tūriais PBS ir penkiais kolonos tū-riais lOmM (pH 7,4) Na fosfatiniu buferiniu tirpalu, į kurį pridėta 2 M karbamido. Baltymai eliujuojami 10 mM (pH 7.4) natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu, į kurį pridėta 2M urėjos ir 1M NaCl. Į apjungtas eliuoto baltymo frakcijas pridedama 0,01% oktilglukozido (n-oktil-P-D-gliukopiranozido) ir po ImM EDTA ir Pefabloc (Boe-hinger Mannheim) ir sorbuojama ant tandemiškai sujugto CD4-IgG (Capton, D. J. et al., Nature, 337:525-531
[0448] [1989]) ir mpl-IgG Ultralink (Pierce) kolonėlių (žiūr. žemiau). CD4-IgG (2 ml) kolonėlė pašalinama, kai mėgi-nys užnešamas ir mpl-IgG (4 ml) kolonėlė praplaunama po 10 kolonėlės tūrių PBS ir PBS su 2 M NaCl, ir sorbuoti baltymai eliujuojami su 0,1 M glicino-HCl tirpalu, pH 2,25. Frakcijos surenkamos į 1/10 frakcijos tūrio 1 M Tris-HCl buferinį tirpalą (pH 8,0).
[0449] Eliujuotos frakcijos analizuojamos SDS PAGE (4-20%, Novex gel) redukuojančiose sąlygose (Fig. 5). Išryškintų sidabru baltymų intensyvios juostos atitinka 66000, 55000, 30000, 28000 ir 14000 molekulines mases. Tam, kad būtų galima nustatyti, kurie baltymai stimuliuoja Ba/ F3- mpl ląstelių kultūrą, šie baltymai buvo eliujuoti iš SDS PAGE gelio, kaip aprašyta Pavyzdyje 2.
[0450] Ultralink afininė kolonėlė
[0451] 10- 20 mg mpl- IgG ar CD4- IgG PBS tirpale buvo pri-siuvama prie 0, 5 g Ultralink sorbento ( Pierce) pagal gamintojo aprašymą.
[0452] mpl- IgG konstravimas ir ekspresija Chimerinė molekulė, kurioje yra visas ekstraląste-linis žmogaus mpl domenas (amino rūgščių liekanos 1-491) ir žmogaus IgGl molekulės Fc regionas, ekspresuo-jama 293 ląstelių linijoje. kDNR fragmentas, koduojantis žmogaus mpl amino rūgščių liekanas nuo 1 iki 4 91, gaunamas iš žmogaus megakariocitų CMK ląstelių kDNR bibliotekos panaudojus PCR, ir po to sekvenuoj amas. Clal skėlimo sritis buvo prijungiama 5' gale, BstEII skėlimo sritis - 3' gale. Šis fragmentas buvo klonuojamas prieš IgGI Fc koduojantį regioną Į Bluescript vek-torių tarp Clal ir BstEII skėlimo sričių po dalinio PCR produkto suskaldymo su BstEII, nes dvi kitos BstEII skėlimo vietos yra koduojančioje ekstraląstelinį mpl domeną DNR. BstEII skėlimo vieta buvo įvedama į mpl PCR produkto 3' galą, tam, kad Fc sritis būtų tame pačiame rėmelyje kartu su mpl ekstraląsteliniu domenu. Ši konstrukcija buvo subklonuota į pRK5-tkneo vektorių tarp Clal ir Xbal skėlimo sričių ir transfekuota į žmogaus embrioninių inkstų ląstelių 293 liniją kalcio fosfatiniu metodu. Ląstelės buvo auginamos selektyvioje ter-pėje su 0,4 mg/ml G418 ir išaugę individualūs klonai buvo atskiriami. mpl-IgG ekspresija atskirtuose klonuose buvo nustatyta naudojant žmogaus Fc specifinę ELISA. Geriausiai besiekspresuoj antis klonas produkavo 1 2 mg/ml mpl-IgG.
[0453] kDNR, atitinkanti visą žmogaus mpl P koduojančią sritį, buvo klonuota į pRK5- tkneo vektorių, kuris buvo vėliau linearizuotas Not I ir transfekuotas į IL- 3 pri-klausomų Ba/ F3 ląstelių liniją elektroporacijos būdu ( lxl07 ląstelių, 9605F, 250 V) . Po trijų dienų buvo pradėta transfekantų atranka, naudojant 2 mg/ ml G418. Ląstelės buvo atrinktos bendrai arba klonuotos limi-tuojančių skiedimų metodu 96 šulinėlių plokštelėse. Atrinktos ląstelės auginamos RPMI terpėje su 15 % FBS, 1 mg/ ml G418, 20 mM glutamino, 10 mM HEPES ir 100 | ig/ ml Pen- Strep. mpl P ekspresija atrinktuose klonuose buvo nustatyta FACS analize, naudojant polikloninius triušio anti- mpl P antikūnus .
[0454] mpl ligando nustatymas pavaizduotas Fig. 2. mpl ligando nustatymui iš įvairių šaltinių mpl P Ba/ F3 ląstelės buvo augintos be IL- 3 24 valandas, esant 5xl05 ląstelių viename ml inkubatoriuje, prisotintame vandens garais, 37°C temperatūroje, paduodant orą su 5% CO2. Po auginimo be IL- 3 ląstelės buvo perkeliamos į 96 šuli-nėlių plokšteles, esant 50000 ląstelių 200 įj. 1 terpės, pridedama arba nepridedama praskiestų mėginių ir kultivuojama 24 valandas C02- inkubatoriuj e. 20 p. 1 beseruminės RPMI terpės, kurioje yra 1 p. Ci 3H- timidino, buvo pridedama į kiekvieną šulinėlį ir laikoma 6- 8 valandas. Ląstelės buvo surenkamos ant 96 šulinėlių GF/ C filtro plokštelių ir praplaunamos 5 kartus vandeniu. Radioaktyvumas buvo įvertintas pridėjus 40 ( J. 1 scinciliacinio skysčio ( Microscint 20) Packard Top Count skaitikliu.
[0455] Išgrynintas kiaulės mpl ligandas Gel- filtracija
[0456] Vienodi afiniškai išgryninto mpl ligando (6 frakcija eliujuota nuo mpl-IgG kolonėlės) ir 2 kartus sukoncentruoto Laemmli pavyzdžio buferinio tirpalo tūriai buvo sumaišomi kambario temperatūroje be redukuojančio agento ir nedelsiant užnešami ant Novex 4-20 % poliakrilamidinio gelio. Mėginys nebuvo kaitinamas. Kontrole buvo naudojamas pavyzdžio buferinis tirpalas be ligando. Elektroforezė buvo vykdoma 4-6°C temperatūroje, esant 135 V įtampai, maždaug 2lA valandas. Elektrof oretinis buferinis tirpalas elektroforezės pradžioje buvo kambario temperatūros. Gelis buvo išimamas iš elektroforezės aparato ir nuo gelio nuimama viena plokštelė.
[0457] Gėlio replika buvo padaroma ant nitroceliuliozės tokiu būdu: gabalėlis nitroceliuliozės membranos buvo sudrėkinamas distiliuotu vandeniu ir atsargiai užde-damas ant gelio viršaus taip, kad po membrana neliktų oro burbulėlių. Nitoceliuliozinė membrana ir gelis pažymimi kad nudažytą membraną būtų galima vėl tiksliai uždėti ant gelio. Maždaug po 2 minučių nitroceliuozinė membrana buvo atsargiai nuimama, gelis įdedamas į plastikinį maišelį ir padedamas į šaldytuvą. Nitroce-liuliozinė membrana buvo ryškinama Bio-Rad baltymų dažymo auksu reagentų rinkiniu, pirmiausia purtant membraną tris kartus po 10 ml 0,1 % Tween 20 +0,5 M NaCl +0,1 M Tris-HCl buferiniame tirpale (pH 7,5) apytikriai po 45 minutes, po tc tris kartus praplaunama 10 ml distiliuoto vandens po 5 minutes. Dažymo auksu mišinys buvo užpilamas ir paliekama ryškintis, kol standartinių baltymų juostos tampa matomos. Gelio replika po to praplaunama vandeniu, uždedama, sutapa-tinus žymes, ant maišelyje suvynioto poliakrilatradinio gelio. Novex standartinių baltymų juostų pozicijos buvo pažymėtos ant gelio ir nubrėžiamos gelio pjaustymo linijos. Nitroceliuoliozinė membrana ir plastikinis maišelis nuo gelio nuimami, gelis supjaustomas pagal pažymėtas linijas aštriu peiliuku. Pjūviai padaromi kiek ilgesni nei mėginių takelių plotis, kad nudažius likusiąją gelio dalį, būtų galima tiksliai nustatyti išpjautos juostelės poziciją. Kai supjaustyto gelio gabaliukai nuimami, likusi gelio dalis nudažoma sidabru, ir pamatuojamos supjaustymo linijų ir stan-dartinių baltymų atstumai nuo starto pozicijos. Pagal Novex standartus nustatomos išpjautų gelio juostelių pozicijas atitinkančios molekulinės masės.
[0458] Dvylika gelio gabalėlių buvo įdedama į dviejų Bio-Rad 422 modelio elektroeliutorio kiuvetes. Kiuvetėse buvo naudojami membraniniai kamštukai su 12-14 kD pra-laidumu. Elektroeliucij ai buvo naudojamas eliucijos buferinis tirpalas: 50mM amonio bikarbonato + 0,05 % SDS (pH apie 7,8) . Prieš naudojimą vienas litras šio buferinio tirpalo buvo vieną valandą išlaikomas 4-6°C temperatūroje. Eliucija buvo vykdoma šaltame kambaryje, esant 10 mA srovei vienai kiuvetei (pradinė įtampa - 40 V) ir palaikant 4-6°C temperatūrą. Elektroeliucij a trukdavo apie 4 valandas. Kiuvetės atsargiai buvo iš-imamos ir viršuje esantis tirpalas buvo nusiurbiamas pipete. Eliucijos kamera buvo išimama ir tirpalas, esantis membranos dangtelyje buvo nusiurbiamas Pipet-manu ir saugomas. Po 50 (.il išgryninto vandens buvo įpi-lama į membranų dangtelius, supurtoma, kol visi SDS kristalai ištirps. Šie tirpalai buvo prijungiami prie pirmųjų tirpalų. Bendri eliucijos tirpalų tūriai buvo po 300 - 500^1 vienam gelio gabalėliui. Mėginiai buvo dializuojami supylus į lOmm Spectrapor 4 dializės žar-neles, kurių pralaidumas - 12 - 14 kD, prieš išgrynintą vandeni kelias valandas. Po to mėginiai buvo dializuojami per naktį 4-6°C temperatūroje pri'vš ml (6 mė-giniaras) fosfatinio buferinio fiziologinio tirpalo ( PBS yra apytikriai 4 mM kalio). Buferinis tirpalas buvo pakeičiamas kitą rytą ir dar dializuojama 2,5 valandos. Mėginiai buvo išimami iš dializės maišelių ir supilami į mikrocentrifūginius mėgintuvėlius. Mėginiai buvo iš-laikomi vieną valandą lede, po to centrifūguojami, esant 14000 aps/ min, 4 minutes. Supernatantai buvo praskiedžiami PBS ir juose buvo nustatomas mpl ligando aktyvumas. Likę mėginiai buvo užšaldomi - 70°C tempe-ratūroje .
[0459] Šešta nuo mpl-IgG afininės kolonėlės frakcija (2,6 ml) buvo koncentruojama Microcon-10 kiuvetėje (Amicon). Tam, kad būtų išvengta mpl ligando sorbcijos Microcon kiuvetėje, membrana buvo praplaunama 1 % SDS tirpalu ir pridedama 5JJ.1 10% SDS tirpalo į 6 frakcijos mėginį. Pavyzdžio buferinis tirpalas, du kartus sukon-centruotas (20 pl), buvo įpilamas į 6 frakcijos Microcon koncentratą (20 įi I ) ir bendras (40 jai) mišinys buvo užnešamas į vieną 4-20 % gradientinio poliakrilamidinio gelio (Novex) takelį. Elektroforezė buvo atliekama pagal Novex aprašymą. Prieš elektroblotingą gelis buvo nulygsvarinamas 5 minutes 10 mM 3-(cikloheksilamino)-1-propansulfo rūgšties (CAPS) buferiniame tirpale, pH 11,0, kuriame buvo 10% metanolio. Elektroblotingas buvo vykdomas 45 minutes su Immobilon-PSQ membranomis (Millipore), esant 250mA pastoviai srovei Bio-Rad Trans-Blot pernešimo kiuvetėje (32). PVDF membrana buvo ryš-kinama su 0,1% Coomassie Blue 40% metanolio, 0,1% acto rūgšties tirpale 1 minutę, blukinamas 2-3 minutes 10% acto rūgšties ir 50% metanolio tirpale. Vieninteliai matomi baltymai 18000 - 35000 D molekulinės masės srityje buvo 30000, 28000 ir 22000 D molekulinės masės.
[0460] 30, 28 ir 22 kD molekulinės masės juostos buvo naudojamos baltymų sekvenavimui. Automatinis baltymų sekvenavimas buvo atliekamas 470A modelio Applied Bio-system sekvenatoriumi su sujungtu PTH analizatoriumi. Sekvenatorius buvo modifikuotas taip, kad būtų galima naudoti 80-90% mėginio (Rodriguez, J. Chomatogr., 350: 217-225 [1985]). Į tirpiklį A buvo pridedama acetono (~12 fj.1 /1) UV detekcijos subalansavimui. Baltymai po elektroblotavimo buvo sekvenuojami Blott strypuose. Eliucijos pikai buvo integruojami naudojant Justice Innovation duomenų apdorojimo programą ir Nelson Ana-lytical 970 keitiklį. Sekų analizė buvo atliekama naudojant VAX 5900 (Henzel et al., J. Chromatogr., 404:41-52 [1987]). Baltymų N galo amino rūgščių liekanų sekos (naudojant vienos raidės kodus, abejotinas amino rūgš-čių liekanas pažymint skliausteliuose) ir gautos me-džiagos kiekiai (laužtiniuose skliausteliuose) pateikti Lentelėj e 2'.
[0461]
[0462] Megakariocitopoezės suspensinėje ląstelių kultū-roje tyrimas
[0463] Žmogaus • periferinės kamieninės ląstelės (PSC)
[0464] (išskirtos iš savanorių pacientų) buvo atskiestos 5 kartus IMDM terpėje (Gibco) ir centrifuguotos 15 min. kambario temperatūroje 800xg. Ląstelės buvo suspen-
[0465] duotos IMDM, užneštos ant 60% Percoll'o (1,077 g/ml tankio) (Pharmacia) ir centrifuguotos 800xg 30 min. Mažo tankio mononuklearinės ląstelės, sukoncentruotos tarp skirtingo tankio sluoksnių, buvo nusiurbtos, praplautos 2x IMDM terpe, suspenduotos (l-2xl06 ląste-lių/ml) IMDM terpėje su 30% FBS ir išpilstytos po 1 ml į 24 šulinėlių plokštelę audinių kultūrai (Costar). APP arba APP be mpl ligando buvo pridėta iki 10% ir kultūros buvo auginamos 12-14 dienų 37°C temperatū-roje inkubatoriuje, prisotintame vandens garų ir 5% CO2. Kultūros taip pat buvo auginamos su 10% APP ir 0,5 Įig mpl-IgG, kurie buvo pridėti 0, 2 ir 4 dieną. APP buvo.atskirta nuo mpl ligando, praleidžiant per mpl- IgG afininę kolonėlę.
[0466] Megakariocitopoezės įvertinimui šiose suspensinėse kultūrose buvo naudojama Solberg et al. metodo modifikacija, panaudojant radioaktyviu izotopu žymėtus pelės IgG monokloninius antikūnus (HP1-1D) prieš GPIIbIIIa (gautus iš Dr. Nichols' o, Mayo klinika). lOOjag HP1-1D
[0467] buvo žymėta lmCi Na 1 ? SJ naudojant Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) pagal gamintojo instrukcijas. Žymėtas HP1-1D buvo laikomas PBS su 0,01% oktil-gliukozido. Tipiškas specifinis radioaktyvumas buvo l-2xl06cpm/ųg (>95% po precipitacijos 12,5% trichloracto rūgštimi).
[0468] Kiekvienas eksperimento taškas suspensinėje kultū-roje buvo nustatinėjamas trimis pakartojimais. Po 12-14 dienų kultivavimo po 1 ml ląstelių suspensijos buvo pernešama į 1,5 ml Ependorf mėgintuvėlius ir centrifū-guojama 10 min. 800xg kambario temperatūroje. Gautos ląstelių nuosėdos buvo suspenduojamos 100 ųl PBS su 0,02% EDTA ir 20% veršiuko serumo. 10 ng 125I-HP1-1D, ištirpinto 50 jil analizės buferinio tirpalo, buvo pridedama prie suspenduotų ląstelių ir inkubuojama 60 min. kambario temperatūroje (KT) , retkarčiais supur-tant. Po to ląstelės buvo nusodinamos, centrifuguojant 10 min. 800xg KT ir praplaunamos 2x analizės buferiniu tirpalu. Ląstelių nuosėdų radioaktyvumas buvo matuojamas 1 min. gama skaitiklyje (Pacard). Nespecifinė są-veika buvo nustatoma, pridedant 1 Įig nežymėto HP1-1D, 60 min. prieš įdedant žymėto HP1-1D. Specifinė sąveika buvo nustatoma kaip skirtumas tarp viso prisijungusio 125J-HP1-1D radioaktyvumo ir radioaktyvumo, esant nežy-mėto HP1-1D pertekliui.
[0469] Pagal 30 kD, 28 kD ir 18-22 kD baltymų N galo amino rūgščių liekanų sekas buvo susintetinti išsigimę oligonukleotidų pradmenys polimerazinei grandininei reakcijai (PCR) (žiūr. Lentelę 4). Buvo susintetinti dviejų tipų išsigimę pradmenys: teigiamas 20 nukleotidų pradmuo, koduojantis 2-8 amino rūgščių liekanas ( mpl 1) ir antisensinis 21 nukleotido pradmuo, komplementarus 18-24 amino rūgščių liekanas koduojančiai sekai ( mpl 2) .
[0470] (2048 - išsigimimo laipsnis) (SEQ ID Nr.: 35) mpl 2 : 5' NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3 '
[0471] Kiaulės genominė DNR, išskirta iš periferinio kraujo limfocitų, buvo naudojama kaip matrica PCR.
[0472] 50 f.il reakcijos mišinyje buvo: 0,8|.ig kiaulės genominės DNR 10 mM Tris-HCl (pH 8,3) tirpale, 50 mM KC1, 3 mM MgCl2, 100 (ig/ml BSA, 400 |iM dNTP, po 1 ja M kiekvieno išsigimusio pradmens ir 2,5 vieneto Tag polimerazės. Pradinis matricos denatūravimas buvo atliekamas 94°C
[0473] temperatūroje 8 minutes, po to sekė 35 ciklai išlaikymo po 45 sekundes 94°C, 1 min. 55°C ir 1 min. 72°C tempera-tūrose. Paskutinis ciklas buvo iki 10 min. 72°C tempe-ratūroje PCR produktai buvo atskiriami elektoforeze 12% poliakrilamidiniame gelyje ir vizualizuojami su etidžio bromidu. Buvo tikimasi, kad, jei amino rūgščių liekanų seka baltymo N gale koduojama vienu egzonu, tai taisyk-lingas PCR produktas turi būti 69 bazių porų (bp) ilgio. Tokio dydžio DNR fragmentas buvo eliujuotas iš gelio ir subklonuotas į vektorių pGEMT (Promega). Trijų klonų sekos yra pateiktos žemiau Lentelėje 5.
[0474] PCR pradmenų pozicijos pavaizduotos pabraukiant bazes. Gauti rezultatai atitinka 30 kD, 28 kD ir 18-22 kD baltymų N gale esančia amino rūgščių liekanų seka nuo 9 iki 17 amino rūgščių liekanos, ir tai patvirtina, kad šios sekos yar koduojamos vienu kiaulės DNR egzonu.
[0475] Remiantis duomenimis, pateiktais Pavyzdyje 5, genominės bibliotekos analizei buvo sukonstruotas ir susintetintas 45 monomerų dezoksioligonukleotidas, pavadintas pR45. Jo seka:
[0476] Šis oligonukleotidas, pažymėtas 32P naudojant (y32P) ATP ir T4 kinazę, buvo naudojamas žmogaus geno-minės DNR bibliotekos, esančios X,geml2, analizei ne-griežtose hibridizacijos ir atplovimo sąlygose (žiūr. Pavyzdį 7). Teigiami klonai buvo surenkami, išgryninami ir analizuojami restikcijos ir Southern blotingo pagalba. Klonas Nr. 4 buvo atrinktas tolesnei analizei.
[0477] 2,8 kb BamHI-XbaI fragmentas, kuris hibridizavosi su pR45, buvo subklonuotas į pBluescript SK- vektorių. Dalinis šio klono DNR sekvenavimas buvo atliktas naudojant pradmenis, specifinius kiaulės mpl ligando DNR sekai. Nustatyta seka patvirtino, kad išskirta DNR koduoja žmogaus mpl ligandą, homologišką kiaulės mpl ligandui. Nustatyta Ecol restriktazės skėlimo vieta sekoje leido išskirti 390 bp EcoRI-XbaI fragmentą iš 2,8 kbp BamHI-XbaI fragmento ir subklonuoti šį frag-mentą į pBluescript SK-.
[0478] Abi šio fragmento grandinės buvo sekvenuotos. Žmo-gaus DNR seka ir išvestinė amino rūgščių liekanų seka yra pateiktos Fig. 9 (SEQ ID Nr: 3 ir 4), galimos intronų vietos genominėje sekoje taip pat pažymėtos rodyklėmis ir nurodytas spėjamas egzonas ("egzonas 3") .
[0479] Analizuojant išvestinę amino rūgščių liekanų seką, buvo patvirtinta, kad serinas yra pirma amino rūgščių liekana subrendusio mpl ligando sekoje, tai taip pat buvo nustatyta sekvenuojant amino rūgščių liekanų seką. Labai tikėtina, kad prieš pat šį kodoną (Ser) yra sig-nalinė seka, dalyvaujanti subrendusio mpl ligando sekrecijoje. Ši signalinė seka, matyt, yra pertraukta ties 68 nukleotidu intronu.
[0480] Panašu, kad 3' kryptimi egzonas baigiasi ties 196 nukleotidu. šis egzonas koduoja 42 amino rūgščių lie-kanų seką, 16 iš kurių, matyt, yra dalis signalinės sekos, o 26 - subrendusio žmogaus mpl ligando.
[0481] Remiantis žmogaus " egzono 3" seka ( Pavyzdys 6) buvo susintetinti du neišsigimę oligonukleotidai, atitinkantys 3' ir 5' " egzono 3" galams ( Lentelė 6)
[0482]
[0483] Šie du pradmenys buvo naudojami PCR reakcijoje, naudojant kaip matricą DNR iš įvairių žmogaus kDNR bibliotekų arba 1 ng Qiuck Clone kDNR (Clonetech) iš įvairių audinių. Reakcijos sąlygos aprašytos Pavyzdyje 5. Laukiamas taisyklingo PCR produkto dydis turėjo būti 140 bp. Po PCR produktų analizės 12 % poliakrilamidiniame gelyje tokio dydžio fragmentas buvo aptiktas kDNR bibliotekose, išskirtose iš suaugusiųjų inkstų ir iš embrioninių inkstų ląstelių linijos 293, o taip pat kDNR, paruoštoje iš žmogaus embrioninių kepenų
[0484] Embrioninių kepenų kDNR biblioteka, klonuota ?.DR2 (Clonetech cat. Nr. HL1151x) , buvo analizuojama su ta pačia 45 oligonukleotidų seka, kuri buvo naudojama analizuojant žmogaus genominę biblioteką. Olikonukleo-tidas buvo pažymėtas su ( y32P)- ATP, naudojant T4 poli-nukleotidkinazę. Biblioteka buvo analizuojama švelnio-mis hibridizacijos sąlygomis. Filtrai buvo prehibridi-zuojami 2 valandas, po to hibridizuojami su mėginiais per naktį ( 16 vai.) 42°C temperatūroje 20% formamide, 5xSSC, 10x Denhardto buferiniame tirpale, 0, 05M natrio fosfatiniame tirpale ( pH 6, 5), 0, 1% natrio pirofosfato lirpūii; pnoijus J j. iy, ml uiLraįarsu psvįiKius lašišą spermos DNR. Filtrai buvo pamerkiami į 2xSCC ir vieną kartą praplaunami 0, 5xSCC, 0, 1% SDS 42°C temperatūroje. Filtrai buvo laikomi per naktį ant Kodak X- Ray foto-juostos. Teigiami klonai buvo surenkami, gryninami, ir įterptos sekos dydis buvo nustatomas PCR, klonuojant BamHI- XbaI f lankuo j ančius oligonukleotidus į A. DR2 ( Clonetech Cat. Nr. 6475- 1). 5 jj. 1 fago suspensijos buvo naudojama kaip matricos šaltinis. Pradinė denatūracija buvo atliekama 94°C temperatūroje 7 minutes, po kurios sekė 30 amplifikaci jos ciklų ( 1 min. 94°C, 1 min 52°C ir 1,5 min. 5 2 °C) Pabaigoje buvo išlaikoma 15 min. 72cC temperatūroje. Klonas Nr. FL2b turėjo 1,8 kbp intarpą ir buvo atrinktas tolesnei analizei.
[0485] Plazmidė pDR2 (Clonetech, >.DR2 & pDR2 Cloning and Expresion system Library Protocol Handbook, p. 42), kurioje yra XDR2 fago rankos, buvo sukarpoma, kaip aprašyta gamintojo instrukcijose (Clonetech, A.DR2 & pDR2 Cloning and Expresion system Library Protocol Handbook, p. 29-30) . Plazmidės pDR2-FL2b restrikcinė analizė su BamHI ir Xbal parodė, kad yra intarpe vidinė BamHI skėlimo vieta, apytikriai 650 pozicijoje. Skaldant plazmidę BamHI-XbaI, intarpas sukarpomas į du fragmentus, vienas yra 0,65 kbp, kitas - 1,15 kgp. DNR seka buvo nustatoma su trimis skirtingų klasių matri-comis, 'gautomis iš plazmidės pDR2-FL2b. Dvigrandės plazmidinės DNR sekos analizė buvo atliekama ABI373 modelio automatiniu fluorescentiniu DNR sekvenatoriumi (Applied Biosystems, Foster City, California) pagal standartinį analizės protokolą dažu žymėtiems didez-oksinukleozidtrifosfatų terminatoriams (spalviniai terminatoriai) ir įprastus šokinėjančius pradmenis (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]; Smith et ai., Nature, 321:674-679 [1986]). Polimerazinės grandininės reakcijos ampifikacijos būdu gautų plazmidės fragmentų tiesioginis sekvenavimas buvo atliekamas ABI373 sekvenatoriumi, naudojant įprastinius pradmenis ir spalvinius terminatorius. Viengrandė matrica buvo gauta naudojant M13 Janus vektorių (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland et al., Nucl. Acids Res., 21:3385-3390 [1993]). BamHI-XbaI (1,15 kbp) ir BamHI (0,65 kbp) fragmentai buvo išskirti iš plzmidės pDR2-FL2b, galai buvo užpildomi su T4 DNR polimeraze, esant reakcijos mišinyje dezoksinukleotidams, ir subklonuojami į SmaI skėlimo vietą vektoriuje M13 Janus. Sekvenavimas buvo atliekamas pagal standartinį proto-kolą, naudojant dažu žymėtus M13 universalius ir atvirkštinius pradmenis, arba šokinėjančius pradmenis ir spalvinius terminatorius. Neautomatinis sekvenavimas buvo atliekamas su viengrande M13 DNR, naudojant šoki-nėjančius pradmenis ir standartinį didezoksiterminavimo metodą (Sanger et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]), naudojant 33P žymėtus a-dATP ir Sekvenazę (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) . DNR sekvenatorius buvo valdomas Seąuencher V2.1bl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan) . Žmogaus ML nukleotidų ir išvestinės amino rūgščių liekanų sekos pateiktos Fig. 1 (SEQ ID Nr.:l).
[0486] Žmogaus mpl ligando ( TPO) geno išskyrimas Žmogaus genominės DNR TPO geno klonai buvo išskirti atliekant žmogaus genominės bibliotekos, esančios A.-Geml2, analizę, panaudojant anksčiau aprašytą oligonukleotidu pR45 švelniom sąlygoms (žiūr. Pavyzdį 7) arba labai griežtomis sąlygomis, naudojant fragmentą, atitinkantį kDNR, koduojančio žmogaus mpl ligandą, 3' dalį (nuo BamHI skėlimo vietos iki 3' galo) . Buvo išskirti du persidengiantys 35 kbp lambda klonai. Buvo subklonuoti ir sekvenuoti du persidengiantys fragmentai (BamHI ir EcoRI), kuriuose yra pilnas TPO genas. Žmogaus geno 7 kbp ilgio genominėje DNR yra 6 egzonai ( Fig. 14A, B ir C) . Prie visų egzonų/intronų ribų yra konsensinis motyvas, būdingas žinduolių genams (Shapiro, M. B., et al'., Nucl. Acids Res., 15:7155 [1987]) . Egzone 1 ir egzone 2 yra 5' netransliuojamos sekos ir pirmąsias 4 signalinio polipeptido amino rūgščių liekanas koduojantys nukleotidai. Likusi sekretorinio signalo dalis ir pirmosios subrendusio baltymo 26 amino rūgščių liekanos koduojamos egzono 3 viduje. Visas C galo domenas ir 3' ne-transliuojamas galas, o taip pat į eritropoetiną pana-šaus domeno apie 50 amino rūgščių liekanų yra koduojama egzono 6 viduje. Keturios amino rūgščių liekanos, kurios pašalinamos, kaip pastebėta hML-2 (hTPO-2) baltymui, yra koduojamos 6 egzono 51 gale.
[0487] Žmogaus nxpl ligando ( hML) laikinoji ekspresija
[0488] Siekiant subklonuoti pilno ilgio intarpą, esantį pDR2-FL2b plazmidėje, pastaroji buvo visiškai suskaldyta restriktaze Xbal, o po to ne visiškai suskaldyta restrikcijos endonukleaze BamHI. DNR fragmentas, atitinkantis 1,8 kbp ilgio intarpą, buvo išgrynintas elektroforetiškai agaroziniame gelyje ir subklonuotas pRK5 plazmidėje (pRK5-h mpl I) (pRK5 konstravimas pateiktas JAV patente Nr. 5258287) funkcionaliai sujungiant intarpą su akstyviausiuoj u citoraegalo viruso promotoriumi. DNR iš konstrukto pRK5-h mpl I buvo išskirta PEG metodu ir transfekuota į žmogaus embriono inkstų ląstelių liniją 293, auginamą Dulbecco modifikuotuoje Eagle terpėje (DMEM) su šiais prie-dais: mitybinis mišinys F-12, 20 mM HEPES (pH 7,4) ir 10 % embrioninio galvijų serumu. Ląstelės buvo transfekuotos kalcio fosfatiniu metodu, kaip aprašyta (Gorman, C. [1985] in DNR Cloning: A Practical Approach (Glover, D. M., ed.) Vol. II, pp. 143-190, IRL Press, Washington, D.C.). Po 36 valandų transfekuotų ląstelių supernatantų aktyvumai buvo analizuojami proliferacijos metodu (žiūr. Pavyzdį 1) . 293 linijos ląstelių, trans-fekuotų vien pRK vektoriumi, supernatantai nestimu-liuodavo nei Ba/F3, nei Ba/F3- mpl ląstelių proliferacijos (Fig. 12A) . Ląstelių, transfekuotų pRK5-hmp2l plazmide, supernatantai neveikė Ba/F3 ląstelių, bet stipriai stimuliuodavo Ba/F3-mpl ląstelių proliferaciją
[0489] (Fig. 12A) . Tai įrodo,kad ši kDNR koduoja fukcionaliai aktyvų žmogaus mpl ligandą.
[0490] Žmogaus iapl ligando izoformos hML2, hML3 ir hML4 Siekiant nustatyti alternatyvias hML formas, buvo susintetinti pradmenys, atitinkantys kiekvieną sekos, koduojančios hML, galą. Šie pradmenys buvo panaudoti RT-PCR amplifikuoj ant suaugusio žmogaus kepenų RNR. Papildomai buvo sukonstruoti ir panaudoti vidiniai pradmenys, flankuoj antys pasirinktus regionus (žiūr. žemiau). Tiesioginis PCR produkto galų sekvenavimas parodė, kad yra viena seka, atitinkanti kDNR, išskirtos
[0491] iš žmogaus embrioninių kepenų bibliotekos, seką (žiūr.
[0492] Fig. 1 [SEQ ID Nr.:l]). Tačiau pagal sekų, esančių prie EPO domeno C galo (PCR produkto viduryje), struktūrą buvo galima spręsti apie galimus spaisingo variantus, esančius šioje srityje. Kad būtų galima išskirti šiuos spaisingo variantus, suaugusio žmogaus kepenų kDNR buvo analizuojama PCR, naudojant minėtą sritį flankuojančius pradmenis, kurių sekos pateiktos Lentelėje 7.
[0493] Žmogaus ML izoformų PCR pradmenys phmpllcdna. 3el: 5 ' TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG 3' (SEQ ID Nr.:45)
[0494] 5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG 3' (SEQ ID Nr.:4 6)
[0495] PCR produktai buvo subklonuoti į M13. Individualių subklonų sekvenavimas parodė, kad egzistuoja mažiausiai trys ML izoformos. Viena iš jų, hML (taip pat žymima kaip I1ML332) , yra ilgiausia forma ir atitinka seką, išskirtą iš embrioninių kepenų bibliotekos. Keturios žmogaus mpl ligando izoformų sekos, pradedant nuo ilgiausios (hML) ir baigiant trumpiausia (hML-4), yra pateiktos Fig. 11 (SEQ ID Nr.: 6, 8, 9, ir 10) .
[0496] Žmogaus Mpl ligando izoformų ir pakeistų variantų hML2 , hML3 ir hML ( Rl53A , R154A ) konstravimas ir tarpinė
[0497] Izoformos hML2, hML3 ir pakeisti variantai hML(R153A, R154A) buvo konstruojami iš hML, naudojant rekombinantinę PCR techniką, aprašytą Russell Higuchi, in PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Editors.
[0498] Visų konstrukcijų "išoriniai" pradmenys yra pateikti Lentelėje 8, "persidengiantys" pradmenys pateikti Lentelėje 9.
[0499] LENTELĖ 8
[0500] Išoriniai pradmenys
[0501]
[0502] Visos PCR amplifikacijos buvo atliktos su klonuota Pfu DNR polimeraze (Stratagene), šiomis sąlygomis: pradinė matricos denatūracija buvo atlikta 94°C tempe-ratūroje 7 min., po to sekė 30 ciklų po 1 min. 94°C, 1 min. 55°C ir 1,5 min. 55°C. Paskutinis ciklas buvo pabaigiamas išlaikant 10 min. 72°C temperatūroje. Galutinis PCR produktas buvo suskaldytas Clal-Xbal, išrgy-nintas gelyje ir klonuotas į pRK5tkneo. 293 linijos ląstelės buvo transfekuotos įvairiais konsruktais, kaip aprašyta aukščiau, šių ląstelių supernatantas buvo ti-riamas Ba/F3- mpl proliferacijos metodu. hML-2 ir hML-3 šiame tyrime neturėjo aktyvumo, hML(R153A, R154A) pasi-žymėjo panašiu aktyvumu kaip ir hML, tai parodo, kad skėlimas šioje dviejų bazinių amino rūgščių liekanų vietoje neturi įtakos aktyvumui (žiūr. Fig. 13).
[0503] DNR fragmentas, atitinkantis visą žmogaus mpl ligando koduojamą regioną buvo gautas panaudojant PCR, išgrynintas gelyje ir pažymėtas atsitiktiniais pradmenimis, esant 32P-dATP ir 32P-dCTP. Šis mėginys buvo panaudotas analizuojant 106 klonų iš pelės kepenų kDNR bibliotekos, klonuotos A.GT10 (Clontech Cat Nr. ML3001a) . Replikos ant filtrų buvo gautos per naktį mėginius hibridizuoj ant 35 % formamide, 5xSSC, 10xDenharto buferiniame tirpale, 0,1 % SDS, 0,05 M natrio fosfatiniame buferiniame tirpale (pH 6.5), 0,1% natrio pirofosfato tirpale, esant 100 |ig/ml apdorotos ultragarsu lašišos spermos DNR. Filtrai buvo praplaunami 2xSSC, po to praplaunami vieną kartą 0,5xSCC, 0,1% SDS 42°C temperatūroje. Hibridizacijai naudotas fagas buvo išgrynintas ir kDNR intarpai buvo subklonuoti į Eco R1 skėlimo vietą Bluescript SK- plazmidėje. "LD" klonas su 1,5 kbp intarpu buvo pasirinktas tolesnei analizei, abi grandinės buvo analizuojamos, kaip aprašyta aukščiau žmogaus ML kDNR atveju. Klono LD nukleotidų ir išves-tinės amino rūgščių liekanų sekos yra pateiktos Fig. 14 (SEQ ID Nr.: 1 ir 11). Išvestinė subrendusio ML baltymo amino rūgščių liekanų seka iš šio klono yra iš 331 amino rūgščių liekanų ir žymima mML33i (ar mML-2 dėl nurodytų žemiau priežasčių). Žymus tiek nukleotidų, tiek ir amino rūgščių liekanų sekų identiškumas buvo nustatytas šių ML į EPO-panašiuose domenuose. Tačiau, kai buvo palygintos žmogaus ir pelių ML išvestines amino rūgščių liekanų sekos, buvo pastebėta keturių amino rūgščių liekanų (tarp 111 ir 114) delecija, kuri atitiko 12 nukleotidų deleciją (nuo 618 nukleotido) , nustatytą tiek žmogaus (žiūr. aukščiau), tiek ir kiau-lės (žiūr. žemiau) kDNR. Todėl buvo ištirti ir kiti klonai, siekiant nustatyti galimas pelių ML baltymo izoformas. Viename klone "L7", turinčiame 1,4 kbp intarpą su išvestine 335 amino rūgščių liekanų seka, buvo "prarastas" tetrapeptidas LPLQ. Ši forma, matyt, yra visas pelės ML baltymas, ir pažymėtas mML arba mML335 . mML nukleotidų ir išvestinė amino rūgščių liekanų sekos pateiktos Fig. 16 (SEQ ID Nr.: 12 ir 13). "L2" klonas taip pat buvo išskirtas ir sekvenuotas. Šiame klone buvo 116 nukleotidų delecija taip pat kaip ir hML3 sekoje, todėl buvo pažymėtas mML-3. Šių dviejų izoformų amino rūgščių liekanų sekų palyginimas yra
[0504] Pelės ML ekspresijos vektorius buvo sukonstruotas taip pat kaip ir Pavyzdyje 8. Klonai, pažymėti mML ir mML-2, buvo subklonuoti į pRK5tkneo, žinduolių ekspresijos vektorių, kuris leidžia ekspresuoti baltymus kontruoliuojant ekspresiją CMV promotoriui ir SV40 poliadenilacijos signalui. Galutiniai ekspresijos vektoriai, mMLpRKtkneo ir mML2pRKtkneo, buvo laikinai transfekuoti į 293 linijos ląsteles kalcio fosfatiniu metodu. Po transfekcijos terpė buvo kondicionuojama penkias dienas. Ląstelės buvo palaikomos DMEM terpėje su didele gliukozės koncentracija su 10 % embrioninio veršiukų serumo.
[0505] Pelės mpl ( mmpl) ekspresija Ba/ F3 ląstelėse.
[0506] Stabili ląstelių linija, ekspresuojanti c- mpl buvo gauta transfekuoj ant mmpl pRKtkneo vektoriumi taip pat, kaip ir žmogaus mpl atveju, aprašytu Pavyzdyje 1. Trumpai: ekspresijos vektoriumi (20 j-ig, linijinis), kuriame yra pilna pelės mpl koduojanti seka, (Skoda, R. C., et al., EMBO J12:2645-2653 [1993]) buvo transfekuojamos ląstelės Ba/F3 elektroporacijos būdu (5xl06 ląstelių, 250 V, 960 p.F), po to sekė selekcija pagal atsparumą neomicinui su 2mg/ml G418. mpl ekspresija buvo įvertinama tėkmės citometriją, naudojant triušio antiserumą prieš pelės mpl-IgG. Ba/F3 ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpėje, kondicionuotoje WEHI-3B ląstelių (kaip IL-3 šaltinio). 293 ląstelių linijos, transfekuotos su mML ir mMl-2, supernatantas buvo analizuojamas su BA/F3 ląstelėmis, transfekuotomis su mmpl ir hmpl, aprašytu Pavyzdyje 1 būdu.
[0507] Kiaulės ML (pML) kDNR buvo išskirta naudojant RACE PCR. Trumpai aprašant: oligodT pradmuo ir du specifiniai pradmenys buvo sukonstruoti remiantis kiaulės ML geno egzono seka, koduojančia baltymo, išskirto iš kiaulių aplastinio serumo, N galą. Buvo paruoštos kDNR iš aplastinių kiaulių įvairių audinių. 1342 bp kDNR PCR produktas buvo aptiktas inkstuose ir subklonuotas. Keletas klonų buvo sekvenuoti ir surasta seka, koduojanti subrendusį kiaulės mpl ligandą (be pilnos signa-linės sekos) . Buvo nustatyta, kad kDNR koduoja 332 amino rūgščių liekanų subrendusį baltymą, (PML332) , jo seka pateikta Fig. 18 (SEQ ID Nr.: 9 ir 16).
[0508] Genominiai kiaulės ML geno klonai buvo išskirti tikrinant kiaulės genominę biblioteką, esančią EMBL3 (Clontech Inc.) su pR45. Biblioteka buvo tikrinama kaip aprašyta Pavyzdyje 7. Buvo atrinkta keletas klonų ir sekvenuotas egzonas, koduojantis amino rūgščių liekanų seką, identišką ML sekai. Kiaulės kDNR buvo gauta, naudojant modifikuotą RACE PCR metodą. Buvo susintetinti du specifiniai ML pradmenys, remiantis kiaulės ML geno seka. Poliadenilinta iRNR buvo išskirta iš aplas-tinių kiaulių inkstų iš esmės taip, kaip aprašyta aukščiau. kDNR buvo susintetinta atvirkštinės transkripcijos būdu su BamdT pradmeniu,
[0509] 51GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3' (SEQ ID Nr.:55)
[0510] nukreiptu į poliadenosino seką iRNR sekoje. Pirma PCR amplif ikaci j a (28 ciklai po 60 sek. 95°C, 60 sek. 58°C ir 90 sek. 72°C) buvo atliekama naudojant ML specifinį h-tiesioginį-1 pradmenį
[0511] 5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT3' (SEQ ID Nr.:43)
[0512] ir BAMAD pradmenį
[0513] 5'GACTCGAGGATCCATCG3' (SEQ ID Nr.:56) 100 ml reakcijos mišinio (50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM dNTP su 0,05 V/ml Amplitaą polimeraze [Perkin Elmer Inc.]). PCR produktas buvo suskaldomas su Clal, ekstrahuojamas fenolio-chloroformo miši-niu (1:1), išsodinamas etanoliu ir liguotjamas į 0.1 mg Bluescript SK- vektorių (Stratagene Inc.), kuris buvo suskaldomas su Clal ir Kpnl. Po 2 valandų inkubacijos kambario temperatūroje, vienas ketvirtadalis ligavimo mišinio buvo pridedamas į kitą PCR ciklą (22 ciklai aprašyti aukščiau), naudojant kitą specifinį tiesioginį pradmenį tiesioginis-1
[0514] 51GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG31 (SEQ ID Nr.:57) ir T3-21 (oligonukleotidas , kuris jungiasi šalia poliklonavimo regiono Bluescript SK- vektoriuje): 51CGAAATTAACCCTCACTAAAG3' (SEQ ID Nr.:58). Gautas PCR produktas buvo suskaldytas Xbal ir Clal ir subklonuotas į Bluescript SK- vektorių. Buvo sekvenuota keletas nepriklausomų PCR reakcijų klonų.
[0515] Buvo identifikuota kita forma, pažymėta pML-2, koduojanti baltymą be keturių amino rūgščių liekanų
[0516] (328 amino rūgščių liekanos) (žiūr. Fig. 21 [SEQ ID Nr.:21]). Lyginant pML ir pML-2 amino rūgščių liekanų
[0517] sekas, matome, kad šios sekos yra identiškos, iškyrus tai, kad paskutiniojoje nėra QLPP tetrapeptido, atitin-kančio 111-114 liekanas (žiūr. SEQ ID Nr.:18 ir 21). Keturių amino rūgščių liekanų delecija aptinkama pelės, žmogaus ir kiaulės ML kDNR tose pačiose baltymų išvestinių amino rūgščių liekanų sekų vietose.
[0518] Trombopoetino ( TPO) poveikio trombocitų antigeno GPIIfrIIIa ekspresijos indukcijai CMK ląstelėse tyrimas
[0519] CMK ląstelės yra auginamos RPMI 1640 terpėje su 10% embrioninio veršiuko serumo ir lOmM gliutamino. Ląstelės prieš bandymą praplaunamos ir suspenduojamos (5xl05 ląstelių/ml) , beseruminėje GIF terpėje su 5mg/l jaučio insulino, 10mg/l apo-transferino ir įprastu mikroelementų kiekiu. Atitinkamai atskiestas TPO standartas arba tiriami pavyzdžiai po 100 |al įnešami į kiekvieną 96-šulinėlių plokščiadugnės plokštelės šuli-nėlį. Tada įnešama po 100 fil CMK ląstelių suspensijos, ir plokštelės inkubuojamos 48 valandas inkubatoriuje su 5% CO2 37°C temperatūroje. Po inkubacijos plokštelės centrifuguojamos penkias minutes 1000 aps./min. 4°C temperatūroje. Supernatantai išpilami ir į kiekvieną šulinėlį pridedama po 100 jil konjuguotų su FITC'u GPII^IIIg monokloninių 2D2 antikūnų. Po vienos valandos inkubacijos 4°C temperatūroje, plokštelės vėl centrifuguojamos penkias minutes 1000 aps./min. Supernatantai su neprisijungusiais antikūnais išpilami ir šulinėliai praplaunami 200 |.il 0,1% BSA-PBS tirpalo. Plovimas 0,1% BSA-PBS kartojamas tris kartus. Po to ląstelės analizuojamos naudojant standartinę vienparametrinę analizę, t.y. FASCAN aparatu matuojant santykinį fluorescensijos intensyvumą.
[0520] Trombopoetino ( TPO) poveikio DAMI ląstelių endomitotiniam aktyvumui tyrimas 96- šulinėlių plokštelėse
[0521] DAMI ląstelės yra auginamos IMDM terpėje su 10% arklio serumo (Gibco), lOmM glutamino, lOOng/ml penicilino G ir 50 fig/ml streptomicino. Prieš bandymą ląstelės yra praplaunamos, suspenduojamos (lxl05 ląstelių/ml) , IMDM terpėje su 1 % arklio ??.''"?";o ir išpilstomos į 96-šulinėlių apvaliadugnes plokiueles. Į DAMI ląstelių suspensiją plokštelėse pridedama po 100 |il TPO standarto arba tiriamų pavyzdžių ir inkubuojama 48 valandas inkubatoriuje su 5% CO2 37°C temperatūroje. Po inkubacijos plokštelės centrifū-guojamos Sorvall 6000B centrifugoje penkias minutes 1000 aps./min. 4°C temperatūroje. Supernatantas išpilamas, o plokštelės du kartus praplaunamos 200 jj.1 PBS su 0,1% BSA tirpalo. Ląstelės fiksuojamos, pridedant 200 jj.1 atšaldyto 70 % etanolio-PBS, o po to resuspenduojama. Po 15 min. inkubacijos 4°C temperatūroje, plokštelės yra centrifuguojamos penkias minutes 2000 aps./min., supernatantas išpilamas, o į šulinėlius Įnešama po 150 įj.1 lmg/ml RNR'zės su 0,1 mg/ml propidžio j odido ir 0,05 % Tween-20. Po vienos valandos inkubacijos 37°C temperatūroje, tėkmės-citometrijos metodu matuojami DNR kiekio pakitimai. Poliploidija yra įvertinama pagal formulę:
[0522] NPR — normalinis poliploidų santykis.
[0523] Trombocitų produkcijos in vivo nustatymas ,
[0524] Siekiant sukelti trombocitopeniją, C57BL6 linijos pelėms (gautos iš Charles River) į pilvo ertmę (IP)
[0525] (diena 1) buvo suleidžiama 1 ml ožkos serumo prieš pe-lių trombocitus (6 ampulės) . 5 ir 6 dieną pelėms buvo suleidžiamos dvi injekcijos (IP) faktoriaus ar PBS, naudojamo, kaip kontrolė. 7 dieną buvo suleidžiama į veną 30jj.Ci Na235SC>4 0,1 ml druskos tirpale, 35S įsijun-gimo į cirkuliuojančius trombocitus procentas nuo su-leistos dozės buvo nustatomas kraujo mėginiuose, paim-tuose iš bandomųjų ir kontrolinių pelių. Trombocitų ir leukocitų radioaktyvumai buvo matuojami po to tiek pat laiko, paėmus kraują iš retro-orbitalinio sinuso.
[0526] įvertinant mpl - Rse . gD chimerinio receptoriaus
[0527] fosforilinimą
[0528] Žmogaus mpl receptorius buvo atrastas Vigon et ai., PNAS USA, 89:5640-5644 (1992). Chimerinis receptorius, kurio sudėtyje yra ekstraląstelinis mpl receptoriaus domenas (ECD), transmembraninis (TM) ir vidu-ląstelinis (ICD) Rse domenai (Mark et al. , J. of Biol. Chem., 269 ( 14) : 10720-10728 [1994]) ir C galinis flag polipeptidas (pvz., Rse.gD), buvo naudojamas KIRA ELISA analizėje, aprašomoje šiame pavyzdyje. Schematinis analizės aprašymas pateiktas Pieš. 30 ir 31.
[0529] ( a) Sujungiančio agento paruošimas Monoklonaliniai anti-gD (klonas 5B6) buvo pagaminti prieš peptidą iš Herpes simplex viruso glikoproteino D (Paborsky et al . , Protein Engineering 3 (6): 547-
[0530] 553 [1990]). Išgrynintas preparatas buvo praskiedžiamas iki 3,0 mg/ml koncentracijos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), pH 7,4 ir išpilstytas po 1,0 ml buvo saugomas -20°C temperatūroje.
[0531] ( b) Antikūnių prieš fosfotiroziną paruošimas Monokloniniai antikūnai prieš fosfotiroziną (klonas 4G10) buvo gautas iš UBI (Lake Placid,NY) ir bioti-nilinti, naudojant ilgos grandinės biotin-N-hidroksi-sukcinamidą (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).
[0532] mpl ligandas buvo gautas rekombinantiniu būdu, kaip aprašyta šiame išradime. Išgrynintas mpl ligandas buvo saugomas 4°C temperatūroje.
[0533] ( d) Rse. gD nukleino rūgščių paruošimas Sintetiniai dvigrandžiai oligonukleotidai buvo panaudoti atstatyti žmogaus Rse C galo 10 amino rūgščių liekanų (880-890) seką, kuri buvo prijungta prie papil-domų 21 amino rūgščių liekanų, kuriose yra 5B6 epitopas ir stop kodonas. Lentelėje 10 pateikta sintetinė sulie-to geno dalis.
[0534]
[0535] Sintetinė DNR buvo liguojama su kDNR, koduojančia žmogaus Rse amino rūgščių liekanas nuo 1 iki 880 nukleotido, pradedant nukleotidu 2644 prie PstI skėlimo vietos publikuotoje žmogaus Rse kDNR sekoje (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269 ( 14):10720-10728 [1984]) ir su ekspresijos vektoriaus pSV17.ID.LL polilinkerio HindlII skėlimo vieta (žiūr. Fig. 32 A-L; SEQ ID Nr.:22). Taip buvo sukonstruota ekspresinė plaz-midė pSV.ID.Rse . gD. Trumpai charakterizuojant, ekspresijos plazmidėje yra dicistroninis pirminis transkrip-tas, kuriame yra seka, koduojanti DHFR, ribojama 5' splaisingo donoro ir 3' splaisingo akceptoriaus introno splaisingo srities, kurios eina po sekos, koduojančios Rse.gD. Visa (be splaisingo) informacinė seka turi DHFR, kaip pirmą atviro skaitymo rėmelį, todėl generuoja DHFR baltymą, o tai leidžia selekcijuonuoti stabilius transformantus.
[0536] ( e) mpl- Rse. gD nukleino rūgščių paruošimas Ekspresijos plazmidė pSV.ID.Rse . gD, sukonstruota, kaip aprašyta aukščiau, buvo modifikuota į plazmidę pSV.ID.M.tmRd6, kurioje yra sekos, koduojančios žmogaus mpl ECD (amino rūgščių liekanos 1-491) sulietą su transmembraniniu domenu ir viduląsteliniu domenu Rse.gD (amino rūgščių liekanos 429-911). Buvo naudojami sintetiniai oligonukleotidai dalies žmogaus mpl ekstraląs-telinio domeno sujungimui su dalimi sekos, koduojančios Rse, atliekant dviejų etapų PCR klonavimo reakciją, kaip aprašyta Mark et alJ. Biol. Chem., 267:26166-26171 (1992). Pirmame PCR reakcijos etape buvo naudojamas pradmuo M1
[0537]
[0538] su Rse kDNR matrica. Šios suliejimo vietos PvuII-SmaI fragmentas buvo panaudotas konstruojant pilno ilgio chimerinį receptorių.
[0539] DP12.CH0 ląstelės (EP 307,247, publikuotas 1989.03.15) buvo elektroporuojamos su pSV.ID.M.tmRd6 plazmide, kuri buvo linerizuota per unikalią NotI skė-limo vietą. DNR buvo išsodinama etanoliu po ekstrakci-jos fenolio/chloroformo mišiniu ir suspenduojama 20 p.1 1/10 Tris EDTA. Po to prieš elektroporaci j ą (400 V, 330 jiF) , 10 f^g DNR buvo inkubuojama su 107 CHO DP12 ląstelėmis 1 ml PBS tirpalo lede 10 min. Ląstelės po elektroporaci jos buvo išlaikomos 10 min. lede prieš perkeliant jas į neselektyvią terpę. Po 24 valandų ląstelės buvo maitinamos terpe be nukleotidų tam, kad būtų galima atrinkti DHFR+ stabilius klonus.
[0540] ( g) Transformuotų ląstelių selekcija KIRA ELISA analizei
[0541] Ekspresijos klonai MPL/Rse.gD buvo identifikuojami vesternblotavimu,atlikus visų ląstelių lizato frakcio-navimą SDS PAGE, naudojant 5B6 antikūnus, kurie detek-tuoja gD tag epitopą.
[0542] ( h) Terpė
[0543] Ląstelės buvo auginamos F12/DMEM 50:50 terpėje (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Terpė buvo papildyta 10 % diafiltruotu FBS (HyClone, Logan, Utah), 25mM HEPES ir 2mM L-gliutaminu.
[0544] ( i) KIRA ELISA analizė
[0545] Vektoriumi Mpl-Rse.gD transformuotos DP12.CH0 buvo perkeltos (po 3xl04 viename šulinėlyje) į plokščiadug-nes 96 šulinėlių plokšteles kartu su 100 |il terpės ir kultivuojamos per naktį 37°C temperatūroje, esant 5% CO2 • Sekantį rytą šulinėliuose esantis supernetantas buvo dekantuoj amas, plokštelės atsargiai nusausinamos ant popierinio rankšluosčio. Į kiekvieną šulinėlį buvo įpilama po 50 jai terpės su tiriamasiais mėginiais arba 200, 50, 12,5, 3.12, 0,78, 0,19, 0,048 ar 0 ng/ml mpl ligando. Ląstelės buvo stimuliuojamos 30 minučių 37°C temperatūroje, šulinėliuose esantis supernatantas buvo dekantuojamas ir plokštelės vėl atsargiai nusausinamos ant popierinio rankšluosčio. Siekiant sulizuoti ląste-les ir ištirpinti chimerinį receptorių, buvo pridedama po 100 ptl lizatinio buferinio tirpalo i kiekvieną šuli-nėlį. Lizatinio buferinio tirpalo sudėtis: 150mM NaCl tirpalas su 50mM HEPES (Gibco), 0,5% Triton-X 100 (Gibco), 0,01% mertiolato, 30 kTV/ml aprotino (ICN Biochemicals, Aurora, OH) , lmM 4-(2-aminoetil)-benzen-sulfonilflorido hidrochlorido (AEBSF, ICN Biochemicals) , 50 jjM leupeptino (ICN Biochemicals) ir 2 mM natrio ortovanadato (Na3VC>4, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) , pH 7,5. Plokštelė buvo atsargiai purtoma kratytuve (Bellco Instruments, Vineland, NJ) 60 minučių kambario temperatūroje.
[0546] Kol ląstelės buvo tirpinamos, ELISA mikrotitravimo plokštelės (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) su sor-buotais per naktį 4°C temperatūroje 5B6 monokloniniais antikūnais (5,0 fig/ml 50 mM karbonatiniame buferiniame tirpale, pH 9,6, po 100 |al į vieną šulinėlį) buvo nude-kantuojamos ir atsargiai nusausinamos ant popierinio rankšluoščio, po to blokuojamos, įpilant 150 jai vienam šulinėliui blokavimo buferinio tirpalo [PBS, kuriame yra 0,5 % BSA (Intergen Company, Purchase, NY) ir 0,01 % mertiolato] panaudojant automatinį plokštelių plovimo įrenginį (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA).
[0547] Lizatas su ištirpintu MPL/Rse.gD iš audinių kultū-ros plokštelės šulinėlių buvo perkeliamas (po 85 p.1 į šulinėlį) į anti-gD 5B6 padengtus ir blokuotus ELISA plokštelės šulinėlius ir inkubuojama 2 valandas kambario temperatūroje, atsargiai purtant. Neprisijungęs mpl- Rse. gD buvo pašalinamas praplaunant praplovimo buferiniu tirpalu, ir pridedama po 100 jai biotinilintų 4G10 ( antikūnų prieš fosfotiroziną), praskiestų 1:18000 praskiedimo buferiniu tirpalu ( PBS, kuriame yra 0, 5 % BSA, 0, 05 % Tween- 20, 5 mM EDTA ir 0, 01 % mertiolato) , tai yra 56 ng/ ml buvo įdedami į kiekvieną šulinėlį. Po 2 vai. inkubacijos kambario temperatūroje plokštelė buvo praplaunama, ir į kiekvieną šulinėlį buvo pridedama po 100 fil streptovidino konjugato su krienų peroksidaze ( HRPO) ( Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA), praskiesto 1:60000 praskiedimo buferiniu tirpalu. Plokštelės buvo inkubuojamos 30 min. kambario temperatūroje, švelniai purtant. Neprisijungęs avidino konjugatas buvo išplaunamas, ir į kiekvieną šulinėlį buvo pridedama po 100 ja. 1 šviežiai paruošto substrato tirpalo ( tetrametilbenzidinas [ TMB] ; dvikomponentis substrato rinkinys ( Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) buvo pridėtas į kiekvieną šulinėlį. Reakcijai įvykti plokštelės buvo laikomos 10 min., po to spalvos susidarymas buvo stabdomas, pridedant į kiekvieną šulinėlį po 100 ( ii 1, 0 M H3P04 tirpalo. Sugertis 450 nm bangoje buvo matuojama, lyginant su sugertimi 650 nm bangoje ( ABS45o/65o) , naudojant vmax plokštelių daugiakanalį spektrofotometrą
[0548] ( Molecular Devices, Polo Alto, CA) , kontroliuojant Macintosh Centris 650 ( Apple Computers, Cupertino, CA) , duomenys apdorojami DeltaSoft programa ( BioMetallics, Ine, Princeton, NJ).
[0549] Kalibracinė kreivė buvo sudaroma pagal dpl2. trkA, B ar C. gD ląstelių stimuliaciją, esant 200, 50, 12. 5, 3. 12, 0, 78, 0, 19, 0, 048 ar 0 ng/ ml mpl ligando arba išreiškiama kaip ng/ ml TPO ir ABS450/ 650 ± sd priklauso-mybė, naudojant DeltaSoft programą. Pavyzdžių koncentracijos buvo nustatomos pagal sugertį ir iš kalibra-cinės kreivės išreiškiamos kaip TPO aktyvumas ng/ ml.
[0550] Nustatyta, kad mpl ligandas sugeba aktyvuoti mpl-Rse. gD c h i me r i n i receptorių 1 i g a n d ~specifiniu nuo koncentracijos priklausomu būdu. Toliau mpl-Rse.gD KIRA ELISA analize buvo nustatyta, kad analizei netrukdo 100 % žmogaus serumas (parodyta piešinėlyje) ar 100 % plazma (neparodyta piešinėlyje), tai leidžia naudoti metodą tiriant pacientus ir atliekant pK mėginių analizę.
[0551] Trombopoetino nustatymas ELISA metodu , pagrįstas sąveika su receptoriumi
[0552] ELISA plokštelės buvo padengiamos triušio antikūnų prieš žmogaus IgG (Fc) F(ab')2 fragmentais karbonatiniame buferiniame tirpale pH 9, 6 per naktį 4°C tempera-tūroje. Plokštelės buvo blokuojamos 0,5 % jaučio serumo albuminu PBS kambario temperatūroje 1 valandą. Kultū-rinė terpė iš fermentatoriaus, turintį chimerinį recep-torių mpl -IgG, buvo įpilama į šulinėlius ir inkubuojama 2 valandas. Toliau į šulinėlius buvo įpilami standarti-nio pavyzdžio (TPO332, produkuotas 293 linijos ląste-lėse, kurio koncentracija buvo nustatyta pagal amino rūgščių liekanų analizę) praskiedimų serija (nuo 25 iki 0,38 ng/ml, praskiedimo žingsnis 2) ir mėginių praskiedimo serijos. Standartas ir mėginiai skiedžiami PBS su 0,5 % jaučio serumo albumino ir 0,05 % Tween 20. Inkubuojama buvo 2 valandas. Susirišęs TPO buvo detektuo-jamas, naudojant išgrynintus proteinu-A ir biotini-lintus triušio antikūnus prieš TPO155, kuris buvo ekspresuotas E. coli ląstelėse. Po 1 valandos inkubacijos į šulinėlius buvo įnešama steptavidin-peroksidazė ir inkubuojama 30 min. Prisijungusi peroksidazė buvo nustatoma, naudojant substratą - 3,3 ' ,5,5 '-tetrametil-benzidiną. Sugertis buvo įvertinama 450 nm bangoje. Plokštelės buvo praplaunamos po kiekvienos stadijos. Duomenų analizei buvo naudojama kalibracinė kreivė, apdorota, naudojant 4 parametrų kreivių aprašymo Kaleidagraph programa. TPO koncentracijos mėginiuose buvo apskaičiuojamos pagal kalibracinę kreivę.
[0553] TPO ekspresija ir išgryninimas iš ląstelių 293 linijos
[0554] 1. Ląstelių 293 linijos ekspresijos vektorių paruošimas
[0555] kDNR, atitinkanti visą TPO baltymą ir esanti atvirame skaitymo rėmelyje, buvo gauta PCR metodo pagalba, naudojant šiuos oligonukleotidinius pradmenis:
[0556]
[0557] DNR fragmentas buvo amplifikuojamas nuo pRK5-h;npII matricos (aprašyta Pavyzdyje 9), naudojant pfu DNR polimerazę (Stratagene) . Pradinė denatūracija buvo altiekama 94°C temperatūroje 7 minutes, po to sekė 25 amplif ikaci j os ciklai (1 min. 94°C, 1 min. 55°C ir 1 min. 72°C). Pabaigoje buvo išlaikoma 72°C temperatūroje 15 minučių. PCR produktas buvo išgrynintas ir klonuotas tarp Clal ir Xbal skėlimo vietų pRK5tkneo plazmidėje, kuri yra sukonstruota modifikuojant pRK5 vektorių. Vektorius pRK5tkneo.ORF ekspresuoja geną, apsprendžian-tį atsparumą neomicinui ir kontroliuojamą timidinkina-zės promotoriumi. Antras konstruktas, atitinkantis EPO homologišką domeną, buvo sukonstruotas tokiu pat būdu, tik naudojant kiek skirtingą pradmenų porą. Tiesioginis pradmuo buvo Cla.FL.F (žiūr. Lentelę 11), o atvirkšti-nio pradmens seka buvo tokia:
[0558] 5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT (SE(2 ID Nr.:66)
[0559] Galutinis konstruktas buvo pavadinatas pRK5-tkneoEP0-D. Abiejų konstruktų sekos buvo patvirtintos aprašytu Pavyzdyje 7 būdu.
[0560] 2. Žmogaus embriono inkstų ląstelių transfekcija
[0561] Aukščiau aprašyti konstruktai buvo transfekuoti į žmogaus embriono inkstų ląsteles, naudojant kalcio fosfatinį metodą, aprašyta Pavyzdyje 9. Praėjus 24 vai. po transfekcijos, buvo pradedama neomicinui atsparių klonų atranka selektyvioje terpėje su 0,4 mg/ml G418. Po 10 - 15 dienų neomicinui atsparūs klonai buvo indi-vidualiai perkeliami į 96 šulinėlių plokšteles, toliau auginama iki ląstelių monosluoksnio susidarymo. MLi53 ir ML332 ekspresija buvo įvertinama, tikrinant transfektan-tų kondicionuotos terpės aktyvumą Ba/F3- mpl ląstelių proliferacijos metodu (žiūr. Pavyzdį 1).
[0562] 293-rhML332 kondicionuota terpė buvo užnešama ant Blue-Sepharose (Pharmacia) kolonėlės, kuri buvo nulygs-varinta 10 mM natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7,4 (buferis A). Kolonėlė paeiliui buvo praplaunama 10 kolonėlės tūrių buferiu A ir buferio A su 2 M karbamido. Baltymai buvo eliujuojami buferiniu tirpalu A su 2 M karbamido ir 1 M NaCl. Eliujuotos nuo Blue-Sepharose kolonėlės apjungtos frakcijos buvo užnešamos ant WGA-Sepharose kolonėlės, nulygsvarintos buferiniu tirpalu A. Kolonėlė paeiliui buvo praplaunama su 10 kolo-nėlės tūrių buferio A su 2 M karbamido ir 1 M NaCl, baltymai buvo eliujuojami tuo pačiu buferiniu tirpalu, į kurį pridėta 0,5 M N-acetil-D-glukozamino. Eliuatas nuo WGA-Sepharose kolonėlės buvo chromatografuoj amas C4-HPLC kolonėlėje (Synchrom, Inc.) nulygsvarintoj e 0,1 % TFA. Nuo C4-HPLC kolonėlės baltymai buvo eliujuojami propanolio gradientu (0-25 %, 25-35%, 35-70%). rhML332 buvo aptiktas 28-30% propanolio gradiento srityje. SDS-PAGE analizėje išgrynintas rhML.332 migruoja plačia juosta 68-80 kD srityje (žiūr. Fig. 15).
[0563] 293-rhML153 kodicionuota terpė buvo gryninama su Blue-Sepharose, kaip aprašyta rhML332 atveju. Eliuatas
[0564] iš Blue-Sepharose kolonėlės buvo užneštas, kaip apra-šyta aukščiau. rhMLi53 eliuatas iš mpl- afininės kolonė-lės buvo chromatografuojamas C4-HPLC kolonėlėje, kaip aprašyta rhML332 atveju. Išgrynintas rhMLi53 SDS-PAGE analizėje išskiriamas kaip dvi dominuojančios juostos ir dvi minorinės juostos, kurių molekulinės masės yra -18000 - 21000 kD (žiūr. Fig. 15).
[0565] Ekspresijos vektoriai, panaudoti elektroporaci-joje, aprašytoje žemiau, buvo pažymėti: p S VI5 . ID. LL. MLORF (pilnas arba hTP0332) , ir
[0566] Šių plazmidžių konstrukcijos yra pateiktos Fig. 23 ir 24 .
[0567] kDNR, kurioje yra pilnas hTPO atviras skaitymo rėmelis, buvo gauta PCR, naudojant oligonukleotidinius pradmenis, pateiktus Lentelėje 12.
[0568] CHO ekspresijos vektoriaus PCR pradmenys
[0569]
[0570] PRK5-hmplI (aprašytas Pavyzdžiuose 7 ir 9) buvo naudojamas kaip matrica, esant pfu DNR polimerazei (Stratagene). Pradinė denatūracija buvo atliekama 94:C temperatūroje 7 minutes, po to sekė 25 amplifikacijos ciklai (1 min. 94°C, 1 min. 55°C ir 1 min. 72°C). Pabaigoje buvo išlaikoma 72°C temperatūroje 15 minučių. PCR produktas buvo gryninamas ir klonuojamas į Clal ir Salį skėlimo vietą plazmidėje pSVI5.ID.LL, tokiu būdu buvo sukonstruotas vektorius pSVI5.ID.LL.MLORF. Sekantis konstruktas, kuriame yra EPO homologinis domenas, buvo sukonstruotas tuo pačiu keliu, naudojant Cla.FL.F2 kaip tiesioginį pradmenį ir sekantį atvirkštinį pradmenį:
[0571]
[0572] Galutinis konstruktas buvo pažymėtas pSVI5.ID.LL.MLEP0-D. Abiejų konstruktų sekos buvo patikrintos aprašytu Pavyzdžiuose 7 ir 9 būdu.
[0573] Trumpai, pilno ilgio ir nukirptą ligandą koduojan-čios sekos buvo įterptos į poliklonavimo sritį CHO ekspresijos vektoriuje pSVI5.ID.LL. Šiame vektoriuje yra ankstyvas promotoriaus/sustiprintoj o regionas, modifikuotas splaisingo elementas, kuriame yra pelės DHFR kDNR, poliklonavimo sritis tikslinio geno įterpimui (šiuo atveju TPO sekos), SV40 poliadenilinimo signalas, replikacijos iniciavimo vieta ir beta-laktamazės genas plazmidės selekcijai ir amplifikacijai bakterij ose.
[0574] 3. Stabilios CHO ląstelių linijos, ekspresuojančios rekombinantinius TPO332 ir TP0i53, sukūrimo metodologija
[0575] CHO (Kinijos žiurkėnių kiaušidžių) ląstelių-šeimi-ninkų linija, naudojama TPO molekulių ekspresijai, yra žinoma kaip CH0-DP12 (žiūr. EP 307247, publikuotą 1989.03.15). Ši žinduolių ląstelių linija buvo atrinkta iš transfekuotų tėvinių ląstelių linijos (CHO-K1 DUX-Bll(DHFR-)- gautos iš Dr. Frank Lee, Stanford Univer-sity su Dr. L. Chasin sutikimu) su preproinsulino ekspresijos vektoriumi, tam kad būtų gauti klonai su suma-žintu insulino poreikiu. Šios lątelės taip pat yra DHFR-, todėl klonai gali būti atrenkami esant DHFR kDNR vektoriaus sekoms, auginant terpėje be nukleozidų priedų (glicino, hipoksantino ir timidino). Ši atrankos sistema paprastai naudojama stabilioms ekspresuojan-čioms CHO ląstelių linijoms atrinkti.
[0576] b. Transfekcijos metodas ( elektroporacija)
[0577] Ląstelių, ekspresuo j ančių TPO332 ir TPO153, linijos buvo gaunamos transfekuoj ant DP12 ląsteles elektroporacija (žiūr. Anderson, G.L. J.Tiss.Cult. Meth., 15,56
[0578] [1993]) atitinkamai su linearizuotomis pSVI5.ID.LL.ML0RF ar su pSVI5.ID.LL.MLEPO-D plazmidėmis. Trys (3) restrikcijos fermentų reakcijos mišiniai buvo naudojami kiekvienos plazmidės skėlimui; buvo naudojama 10 |ig, 25 |ig ir 50 jag vektoriaus, skaldant su NOTI fermentu pagal standartinius molekulinės biologijos metodus. Ši restrikcijos vieta, vienintelė vektoriuje, yra lineari-zacijos regione 3' gale ir už TPO iigando transkripcijos elementų (žiūr. Fig. 23). 100 (ig reakcijos miši-nio buvo inkubuojamas per naktį 37°C temperatūroje. Kitą dieną mišinys buvo vieną kartą išekstrahuoj amas fenolio-chloroformo-izoamilo alkoholio mišiniu (50:49:1) ir ekstraktas išsodinamas etanoliu, išlaikant sausame lede vieną valandą. Nuosėdos buvo surenkamos centrifuguoj ant 15 min. ir po to išdžiovinamos. Linea-rizuota DNR buvo suspenduota į 50 (J.1 Ham DMEM-F12 1:1 terpę, papildant ją standartiniais antibiotikais ir 2 mM gliutamino.
[0579] Auginamų DP12 ląstelių suspensija buvo surenkama, praplaunama vieną kartą terpe, naudojama DNR suspenda-vimui, ir pabaigai suspenduojamos toje pačioje terpėje, esant ląstelių koncentracijai 107 ląstelių 750 fil. Ląstelių suspensijos alikvotos (po 750 (ii) ir kiekvienas linearizuotos DNR mišinys buvo inkubuojami kartu kambario temperatūroje vieną valandą ir pernešami į BRL elektroporacijos kamerą. Kiekvienas reakcijos mišinys buvo elektroporuoj amas standartiniame elektroporacijos aparate, esant 350V ir 330 JJ. F, esant mažai talpuminei varžai. Po elektroporacijos ląstelės buvo paliekamos aparate 5 min. ir po to buvo papildomai išlaikomos 10 min. lede. Elektroporuotos ląstelės buvo perkeliamos į 60 mm audinių kultūros lėkšteles, kuriose buvo po 5 ml pilnos standartinės CHO augimo terpės ( didelės glukozės koncentracijos DMEM- F12 50:50, be glicino su lx GHT, 2 mM glutamino ir 5% embrioninio veršiukų serumo) ir auginamos audinių kultūros inkubatoriuje per nakti, esant 5 % CO2.
[0580] Kitą dieną ląstelės buvo tripsinizuojamos nuo plokštelių pagal standartinę metodiką ir perkeltos į 150 mm audinių kultūros lėkšteles su DHFR selektyvia terpe ( Ham DMEM- F12, 1:1 terpe, aprašyta aukščiau, papildyta 2 % arba 5 % dializuoto embrioninio veršiukų serumo, bet be glicino, hipoksantino ir timidino - tai yra standartinė DHFR selekcijos terpė). Ląstelės iš kiekvienos 60 mm lėkštelės buvo padauginamos į penkias 150 mm lėkšteles. Ląstelės buvo inkubuojamos nuo 10 iki 15 dienų ( su vienu terpės pakeitimu) 37°C temperatū-roje, esant 5 % CO2, kol buvo pastebimas klonų augimas ir kol klonų dydis pasiekė dydį, tinkamą pernešti į 96 šulinėlių plokšteles. Po 4- 5 dienų ląstelės buvo perkeliamos į 96 šulinėlių plokšteles, naudojant sterilius geltonus pipetmano antgalius ( po 50 fil) . Ląstelės buvo paliekamos augti, kol susidarydavo ląstelių monosluoks-nis ( paprastai 3- 5 dienas), ir tripsinizuojamos, kiek-vieną kloną išsėjant 2 pakartojimais. Trumpą laiką šios dvi kopijos buvo laikomos šaldiklyje, pridėjus į kiek-vieną šulinėlį po 50 ). il 10 % DMSO. Likusi klonų dalis buvo auginama iki monosluoksnio susidarymo, augimo terpė buvo išsiurbiama ir užpilama beserumine terpe, po penkių dienų tokiuose kondicionuotos terpės mėginiuose buvo nustatoma TPO ekspresija, naudojant analizę su Ba/F ląstelėmis. Klonai, atrinkti pagal šią analizę ir turintys didžiausią ekspresijos lygį/ buvo paimami iš šaldiklio ir pagausinti dviejuose 150 mm T-induose. Pa-augintos ląstelės buvo naudojamos adaptacijai suspen-sinei kultūrai, pakartotinei analizei ir saugojimui.
[0581] Keletas ląstelių linijų, turinčių didžiausią titrą po selekcijos, kuri aprašyta aukščiau, buvo amplifikuo-jamos metotreksato metodu, siekiant gauti dar didesnio titro klonus. CHO ląstelių klonai buvo padidinti ir pernešti į 10 cm lėkšteles, esant 4 metotreksato koncentracijoms (t. y., 50 nM, 100 nM, 200 nM ir 400 nM) ir dviems ar trims skirtingoms ląstelių koncentracijoms (105, 5xl05 ir 106 ląstelių lėkštelėje). Šios ląstelės buvo inkubuojamos 37°C temperatūroje, esant 5 % CO2, kol klonai bus pastebimi ir galima bus perkelti į 96 šulinėlių plokšteles tolesnei analizei. Keletas aukšto titro klonų po šios selekcijos buvo paveikti didesnės koncentracijos metotreksato (t. y., 600 nM 800 nM, 1000 nm ir 1200 nM) , atsparūs klonai buvo perkeliami į 96 šulinėlių plokšteles ir tiriami.
[0582] 4. Stabiliai ekspresuojančių rekombinantinį žmogaus TPO332 ir TPO153 CHO ląstelių linijos kulti-\ ra v ima s
[0583] Saugomos ląstelės buvo atšildomos ir ląstelės pagausinamos standartiniais ląstelių auginimo būdais terpėje kaip su serumu, taip ir be serumo. Pasiekus reikiamą ląstelių tankumą, ląstelės buvo praplaunamos, siekiant pašalinti ląstelių kultūrinę terpę. Ląstelės po to buvo kultivuojamos bet kokiu standartiniu būdu: induose ar nepertraukiamoje kultūroje 25 - 40°C tempe-ratūroje, esant neutraliam pH ir ištirpusio 02 kiekiui ne mažiau 5 %, kol susidaro reikiamas sekretuojamo TPO kiekis. Ląstelių kultūros skystis buvo atskiriamas nuo ląstelių mechaniniu būdu, pvz., centrifūguoj ant. 5. Rekombinantinio žmogaus TPO gryninimas iš CHO auginimo terpės.
[0584] Ląstelių auginimo terpė (HCCF) buvo užnešama ant Blue Sepharose 6 fast Flow kolonėlės (Pharmacia), nulygsvarintos su 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7.4 su 0,15 M NaCl, apytikriai 100 1 HCCF vienam litrui sorbento; linijinis pratekėjimo greitis apie 300 ml/(val*cm2) . Kolona buvo praplaunama 3-5 kolonos tūriais nulygsvarinimo buferiniu tirpalu, po to 3 - 5 kolonos tūriais 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7,4 su 2,0 M karbamido. TPO buvo eliujuojamas 3-5 kolonos tūriais natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu su 2,0 M karbamido ir 1,0 M NaCl.
[0585] Apjungtos po Blue Sepharose frakcijos su TPO buvo užnešamos ant Wheat Germ Lectin Sepharose 6MB kolonos (Pharmacia), nulygsvarintos 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7,4 su 2,0 M urėjos ir 1,0 M NaCl, apytikriai nuo 8 iki 16 ml apjungtų frakcijų nuo Blue Sepharose vienam mililitrui sorbento; linijinis prate-kėjimo greitis apie 50 ml/(val*cm2) . Kolona buvo praplaunama 2-3 kolonos tūriais nulygsvarinimo buferiniu tirpalu. TPO buvo eliujuojamas 2-5 kolonos tūriais 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7.4 su 2.0 M karbamido ir 0,5 M N-acetil-D-glukozamino.
[0586] Į apjungtas Wheat Germ Lectin frakcijas buvo pri-dėta iki 0,04 % C12E g ir 0,1 % trifloracto rūgšties (TFA) . Gautas tirpalas buvo chromatografuoj amas C4 atvirkščių fazių kolonėlėje (Vydac 214TP1022), nulysva-rinus 0,1 % TFA, 0,04 % Ci2E8; užnešama apytikriai 0,2 - 0,5 mg baltymo 1 ml sorbento, pratekėjimo greitis 157 ml/ (val*cm2) .
[0587] Baltymai buvo eliuiuojami dviem linijiniais acetonitrilo gradientais su 0,1 % TFA ir 0,04 % C12E3. Pirmas linijinis gradientas buvo nuo 0 iki 30 % acetonitrilo per 15 min., sekantis - nuo 30 iki 60 % acetonitrilo per 60 minutes. TPO buvo eliu j uo j amas, esant apie 50 % acetonitrilo. Surinktos frakcijos buvo analizuojamos
[0588] Apjungtos po C4 kolonėlės frakcijos buvo praskies-tos dvigubu 0,01 M natrio fosfatinio buferinio tirpalo pH 7.4 su 0,15 M NaCL tūriu ir diafiltruojama prieš apytikriai šešis tūrius 0,01 M natrio fosfatinio buferinio tirpalo pH 7,4 su 0,15 M NaCl Anicon YM aparatu ar kitais ultrafiltracijos aparatais, naudojant 10000 - 30000 D pralaidžias membranas. Gautas diafiltratas buvo sukoncentruojamas ultrafiltruoj ant. Į diafiltracijos koncentratą buvo pridedama Tween-80 iki 0,01 % koncentracijos .
[0589] Visas ar dalis koncentrato (nuo 2 iki 5 % kolonos tūrio) buvo užnešama ant Sephacryl S-300 HR kolonos (Pharmacia), nulygsvarintos 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu, pH 7.4 su 0,15 M NaCl ir 0,01 % Tween-80 ir gelfiltruojama, esant pratekėjimo greičiui 17 ml/(val*cm2) . Frakcijos, kuriose po SDS PAGE anali-zės buvo nustatytas neagregavęs ir be proteinazinės degradacijos produktų TPO, buvo apjungiamos. Apjungtos frakcijos buvo perfiltruotos per 0,22 ^m filtrą Millex-GV ar panašų ir saugomos 2-8°C temperatūroje.
[0590] 1. TPO ekspresijos vektoriaus E. coli konstravimas
[0591] Plazmidės pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 ir pMP202 buvo sukonstruotos taip, kad ekspresuotų pirmąsias 155 TPO amino rūgščių liekanas už trumpos lyderinės sekos, kuri buvo skirtinga kiekvienai konstrukcijai. Lyderinė seka leidžia padidinti transliacijos iniciavimo lygį ir palengvina baltymo gryninimą. Plazmidės pMP210-l, -T8,
[0592] -21,-22, -24, -25 buvo sukonstruotos taip, kad ekspre-suotų pirmąsias 153 TPO amino rūgščių liekanas po ini-
[0593] ciacijos vietos (metionino liekanos), ir kad skirtųsi naudojamais pirmųjų TPO šešių amino rūgščių liekanų kodonais. Plazmidė pMP251 yra išvestinė iš pMP210-l plazmidės, joje TPO baltymo C gale yra papildomos dvi amino rūgščių liekanos. Visos aukščiau paminėtos plaz-midės pasižymi didele TPO ekspresija E. coli ląstelėse, indukuojant triptofano promotorių (Yansura, D. G. et al., Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Ed.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidės pMPl ir pMP172 yra tarpinės, konstruojant aukščiau nurodytas plazmidės, kurių pagalba ekspresuojamas viduląstelinis
[0594] TPO.
[0595] Plazmidė pPMl yra TPO fragmento, į kurį įeina pirmosios 155 amino rūgščių liekanos, ekspresijos vektorius, ir jis buvo gautas liguojant penkis DNR fragmentus, kaip parodyta Fig. 33. Pirmasis fragmentas - tai vektorius pPho21, kuriame yra pašalintas MluI-BamHI fragmentas. pPho21 yra išvestinis iš phGHl (Chang, C.N., et al., Gene 55:189-196 [ 1987]), šiame vektoriuje žmogaus augimo hormono genas buvo pakeistas E. coli phoA genu ir buvo sukonstruota MluI skėlimo vieta STII signalinės sekos vietoje, koduojančioje 20 - 21 amino rūgšties liekaną.
[0596] Sekantys du fragmentai - DNR iš pRK5-hmplI (Pavyzdys 9) 258 bazių porų Hinfl-PstI fragmentas, koduojantis TPO baltymo seką nuo 19 iki 103 amino rūgščių liekanos ir sintetinis DNR fragmentas, koduojantis TPO baltymo seką nuo 1 iki 18 amino rūgščių liekanos:
[0597] buvo pirmiausia liguojami su T4-DNR ligaze, o po to perkerpami su Pstl. Ketvirtas yra Pstl-HaelII frag-
[0598] mentas iš pRK5hraplI, sudarytas iš 152 bp, koduojantis TPO amino rūgščių liekanų seką nuo 104 iki 155 amino rūgščių liekanos. Paskutinis buvo 412 bp ilgio StuI-BamHI fragmentas iš pdhl08, turintis A. iki transkripcijos terminatoriaus, kaip ankščiau aprašyta (Scholtissek, S. et al., NAR 15:3185 [1987]).
[0599] Plazmidė pMP21 sukonstruota taip, kad ekspresuotų TPO baltymo pirmąsias 155 amino rūgščių liekanas, naudojant STII signalinės sekos dali iš 13 amino rūgščių liekanų. Ši plazmidė buvo sukonstruota, liguojant tris (3) DNR fragmentus, pateiktus Fig. 34. Pirmas fragmentas buvo padarytas iš vektoriaus pVEG31, iškirpus mažą Xbal-Sphl fragmentą. Vektorius pVEG31 yra sukonstruotas iš vektoriaus pHGH207-l (deBoer, H.A. et al., in Promoter Structure and Funktion (Rodriguez, R.L. and Chamberlain, M.J., Ed.) 462, Prager, New York [1982]). Šiame vektoriuje žmogaus augimo hormono genas buvo pakeistas vaskuliarinio endotelio augimo faktoriaus genu (identiškas vektoriaus fragmentas gali būti gautas iš paskutiniosios plazmidės).
[0600] Kita ligavimo dalis buvo sintetinė dvigrandė DNR:
[0601] Paskutinioji 1072 bp dalis buvo Mlul-Sphl fragmentas iš pMPl, koduojantis 155 TPO baltymo amino rūgščių liekanas .
[0602] Plazmidė pMP151 sukonstruota taip, kad ekspresuotų TPO baltymo pirmąsias 155 amino rūgščių liekanas už lyderinės seka, į kurią įeina 7 amino rūgščių liekanų STII signalinės sekos, aštuonios histidino 1iekanos ir faktoriaus Xa skėlimo vieta. Kaip parodyta Fig. 35, pMP151 buvo konstruojama liguojant tris DNR fragmentus. Pirmasis fragmentas buvo gautas iš anksčiau aprašytos plazmidės pVEG31 iškirpus mažą Xbal-Sphl fragmentą ir jį pašalinus. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvi-grandė DNR:
[0603] Paskutinysis buvo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas iš plazmidės pMPll, koduojantis TPO baltymo 154 amino rūgščių liekanas. Plazmidė pMPll identišką plazmidei pMPl, skiriasi tik keliais kodonais STII signalinėje sekoje (šis fragmentas gali būti gaunamas iš pMPl plazmidės).
[0604] Plazmidė pMP202 labai panaši į ekspresijos vektorių pMP151, skiriasi tik tuo, kad Xa faktoriaus skėlimo vieta pakeista į trombino skėlimo vietą. Kaip parodyta Fig. 36, pMP202 buvo konstruojama liguojant tris DNR fragmentus. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš ankščiau aprašytos plazmidės pVEG31 iškirpus mažą Xbal-Sphl fragmentą ir jį pašalinus. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:
[0605] Paskutinysis buvo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas iš aukščiau aprašytos plazmidės pMPll.
[0606] Plazmidė pMP172 yra TPO fragmento, į kurį įeina pirmosios 153 amino rūgščių liekanos, sekrecijos vektorius, ir yra tarpinė konstrukcija sudarant plazmidę pMP210. Kaip parodyta Fig. 37, pMP172 plazmidė buvo konstruojama, liguojant tris DNR fragmentus. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš vektoriaus pLS321amB pašali-nus mažą EcoRI-HindlII fragmentą. Sekantis 946 bp ilgio EcoRI-Hgal fragmentas buvo gautas iš aukščiau aprašytos plazmidės pMPll. Paskutinysis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:
[0607] Plazmidė pMP210 buvo sukonstruota, kad ekspresuotų pirmąsias TPO baltymo 153 amino rūgščių liekanas po transliacijos iniciavimo vietos - metionino liekanos. Ši plazmidė buvo sukonstruota kaip plazmidžių bankas, atsiktinai pakeičiant pirmuosiuose TPO 6 kodonuose trečioje pozicijoje kiekvieno kodono nukleotidą. Šios plazmidės konstravimas atliktas liguojant tris DNR fragmentus pavaizduotas Fig. 38. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš vektoriaus pVEG31 pašalinus mažą Xbal-Sphl fragmentą. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR, pateikta žemiau. Šis fragmentas buvo pirmiausia paveikiamas DNR polimeraze I (Klenow), po to sekė skaldymas Xbal ir HinfI. Fragmentas koduoja iniciacijos metioniną ir atsitiktinai pakeistus 6 TPO baltymo kodonus.
[0608] Trečiasis 890 bp ilgio Hinfl-Sphl fragmentas buvo gautas iš plazmidės pMP172, koduojantis TPO baltymo 19-153 amino rūgščių liekanas.
[0609] Su plazmidžių pMP210 banku (apie 3700 klonų) buvo pakartotinai atlikta transformacija, esant didelei tetraciklino koncentracijai (50 ng/ml) LB plokštelėse, tam kad būtų galima atrinkti klonus su dideliu transliacijos iniciacijos lygiu (Yansura, D.G. et al. , Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:151-158
[0610] [1982]). Iš aštuonių klonų augančių, esant didelei tetraciklino koncentracijai, buvo atrinkti penki, kurie ekspresavo daugiausiai TPO baltymo, DNR sekos nustatymui. Rezultatai pateikti Pieš. 39 (SEQ ID Nr.: 23, 24, 25, 26, 27 ir 28).
[0611] Plazmidė pMP41 buvo konstruojama, kad ekspresuotų pirmąsias TPO baltymo 155 amino rūgščių liekanas sulietas su lyderine seka, sudaryta iš 7 STII signalinės sekos amino rūgščių liekanų, sekančių po Xa faktoriaus skėlimo vietos. Plazmidės konstravimas pavaizduotas Fig. 40. Buvo liguojami trys DNR fragmentai. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš plazmidės pVEG31 iškerpant mažą Xbal-Sphl segmentą. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:
[0612]
[0613] Paskutinysis ligavimo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas buvo gautas iš anksčiau aprašytos pMPll plazmidės.
[0614] Plazmidė pMP57 ekspresuoja TPO baltymo pirmąsias 155 amino rūgščių liekanas po lyderinės sekos, sudarytos iš 9 STII signalinės sekos amino rūgščių liekanų ir dviejų bazinių amino rūgščių liekanų - Lys-Arg. Šis dviejų bazinių amino rūgščių liekanų fragmentas leidžia pašalinti signalinę seka proteiną ArgC. Šios plazmi-dės konstravimas pavaizduotas F: .i . 41. Buvo liguojami trys DNR fragmentai. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš ankščiau aprašytos pVEG31 plazmidės pašalinus mažą Xbal-Sphl fragmentą. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:
[0615] Paskutinysis ligavimo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas buvo gautas iš ankščiau aprašytos pMPll plazmidės.
[0616] Plazmidė pMP251 yra plazmidės pMP210-l darinys, į kurią buvo įterptos dvi papildomos amino rūgščių liekanos TPO baltymo C gale. Šios plazmidės konstravimas pavaizduotas Fig. 42. Plazmidė buvo konstruojama, liguojant du DNR fragmentus. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš plzmidės pMP21 iškerpant mažą Xbal-Apal segmentą. Antrasis buvo 316 bp ilgio Xbal-Apal fragmentas iš plazmidės pMP210-l.
[0617] 2. E. coli transformacija ir indukcij a TPO ekspresijos vektoriumi
[0618] Aukščiau aprašyti TPO ekspresijos vektoriai buvo naudojami E. coli kamieno 44C6 (w3110 tonAA rpoHts lonA clpPA galE) transformacijai CaClž temperatūriniu šoku (Mendel, M. et al., J. Mol. Biol., 53:159-162 [1970]). Transformuotos ląstelės pirmiausia buvo auginamos LB terpėje esant 50 (.ig/ml karbenicilino 37°C temperatū-roje, kol sugertis 600 nm bangoje padidėja iki 2-3. LB terpė po auginimo buvo praskiedžiama 20 kartų M9 terpe, kurioje buvo 0,49 % kazamino rūgščių (m/v) ir 50 j_ig/ml karbenicilino. Po 15 valandų auginimo aeruojant 30°C temperatūroje ląstelės buvo surenkamos centri fūguoj ant.
[0619] Pateikti žemiau biologiškai aktyvaus, su atstatyta struktūra TPO (Met-1 1-153) produkcijos metodai gali būti pritaikyti TPO analogams, tarp jų ir formoms su papildomomis sekomis C ir N baltymo galuose (žiūr. Pavyzdį 23).
[0620] E. coli ląstelės, ekspresuo j ančios TPO (Met-1 1-153), kuris koduojamas plazmide pMP210-l, yra auginamos aukščiau aprašytu būdu. Paprastai apie 100 g ląstelių suspenduojama Polytron homogenizatoriumi viename litre (10 ląstelių kiekio tūrių) ardymo buferinio tirpalo (10 mM tris, 5 mM EDTA, pH 8), ląstelės centrifūguo-jamos esant 5000 g, 30 min. Praplautos ląstelės vėl suspenduojamos Polytron homogenizatoriumi 1 1 ardymo buferinio tirpalo ir ląstelės ardomos LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Ine) ląstelių ardymo aparatu ar Microfluidizer (Microfluidies International) aparatu pagal gamintojų instrukcijas. Gauta suspensija centrifūguo-j ama esant 5000 g, 30 min. Nuosėdos suspenduojamos ir centrifūguojama antrą kartą. Praplautos nuosėdos naudojamos iš karto arba užšaldomos -70°C temperatūroje.
[0621] B. Monomerinio TPO ( Met' 1 1- 153) soliubilizavimas ir gryninimas.
[0622] Atplautos nuosėdos buvo suspenduojamos 5 tūriuose (pagal nuosėdų svorį) 20 mM Tris, pH 8 su 6 M guanidino ir 25 mM DTT (ditiotreitolio) ir maišomos 1-3 vai., ar per naktį 4°C temperatūroje, kad ištirptų TPO baltymas. Galima naudoti ir dideles (6-8 M) karbamido koncentracijas, bet gaunama mažesnė TPO baltymo išeiga, lyginant su guanidinu. Po soliubilizacijos tirpalas nuskaidrinimas centrifūguoj ant esant 30000 g 30 min., tirpale lieka denatūruotas, monomerinis TPO baltymas. Supernatantas chromatografuoj amas kolonėlėje su Superdex 200 gelfiltracijos sorbentu (Pharmacia, 2,6x60 cm), tirpalo pratekėjimo greitis - 2 ml/min. Baltymas eliujuojamas 20 mM natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 6.0 su 10 mM DTT. Frakcijos eliujuotos nuo 160 iki 200 ml surenkamos, jose buvo monomerinis, denatūruotas TPO baltymas. Toliau TPO baltymas buvo chromatografuojamas pusiau preparatyvinėj e atvirkščių fazių C4 kolo-nėlėje (2x20 VYDAC). Mėginiai buvo užnešami 5 ml/min greičiu ant kolonėlės, nulygsvarintos 0,1 % TFA (trifluoracto rūgštimi) su 30 % acetonitrilo. Baltymai buvo eliujuojami linijiniu acetonitrilo gradientu (30-60 % per 60 min.) . Išgrynintas redukuotas baltymas buvo eliujuojamas esant 50 % acetonitrilo. Toks preparatas buvo naudojamas natyvios struktūros atstatymui, kad būtų gautas biologiškai aktyvus TPO variantas.
[0623] C. TPO ( Met' 1 1- 153) biologinio aktyvumo atstatymas
[0624] Apie 20 mg monomerinio, redukuoto ir denatūruoto TPO baltymo, esančio 40 ml 0,1 % TFA ir 50 % acetonitrilo tirpale, buvo praskiedžiama 360 ml struktūros atstatymo buferinio tirpalo, turinčio:
[0625] Po sumaišymo, struktūros atstatymo buferinis tirpalas atsargiai maišomas 4 C temperatūroje 12-48 valandas, tam kad būtų pasiekta didžiausia TPO struktū-ros su teisingais disulfidiniai s tilteliais atstatymo išeiga (žiūr. žemiau). Tirpalas po to buvo parūgština-mas TFA iki galutinės jos koncentracijos 0,2 %, perfil-truotas per 0,45 ar 0,22 jam filtrą, pridedama 1/10 tūrio acetonitrilo. Šis tirpalas buvo chromatografuojamas ant atvirkščių fazių C4 kolonėlės, atstatytos struktūros TPO (Met-1 1-153) baltymas buvo eliujuojamas ta pačia gradiento programa. Šiomis sąlygomis atstatytos struktūros, biologiškai aktyvus TPO baltymas buvo eliujuojamas, esant apie 45 % acetonitrilo koncentracijai. TPO baltymas su netaisyklingais disulfidiniais tilteliais buvo eliujuojamas anksčiau. Galutinis išgrynintas TPO (Met-1 1-153) preparatas turėjo mažiau nei 5 % priemaišų, analizuojant SDS PAGE ir analitine atvirkščių fazių C4 kolonėle. Tyrimams su gyvuliukais išgrynintas po C4 chromatografijos preparatas buvo dializuojams tinkamame fiziologiniame buferiniame tirpale. Buvo naudojami izotoniniai buferiniai tirpalai (10 mM natrio acetato, pH 5,5; natrio sukcinate, pH 5.5; ar 10 mM natrio fosfato, pH 7,4) su 150 mM NaCl ir 0,01 % Tween 80.
[0626] Kadangi TPO pasižymi dideliu aktyvumu testuojant su BA/F3 ląstelėmis (pusė maksimalios stimuliacijos pasiekiama su maždaug 3 pg/ml), todėl galima gauti biologiškai aktyvius preparatus, naudojant daugelį buferinių tirpalų, paviršiaus aktyvių medžiagų ir naudojant įvairias red-oks sistemas. Vis dėlto, daž-niausiai kitomis sąlygomis gaunama labai maža dalis teisigai atstatytos struktūros preparato (<10 %) . Gamybiniams procesams reikalinga, kad struktūros atstatymo proceso išeiga būtų ne mažesė kaip 10 %, geriau 30-50 % ir geriausia, kad išeiga būtų didesnė nei 50 %. Struktūros atstatymo stadijoje buvo išbandyta daug paviršiaus aktyvių medžiagų (Triton X-100, dodeci1-beta-maltozidas, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkosi-las, Tv:een 20 ir Tween 80, Zwitergent 3-14 ir kiti) . Iš šių paviršiaus aktyvių medžiagų buvo nustatyta, kad tik CHAPJ grupės (CHAPS ir CHAPSO) paviršiaus aktyvios medžiagos tinka struktūros atstatymui, sumažinant baltymų agregaciją ir netaisyklingų disulfidinių tilte-lių susidarymą. Patartina naudoti didesnes nei 1 % CHAPS koncentracijas. Natrio chloridas reikalingas didesnei proceso išeigai pasiekti, optimali jo koncentracija yra nuo 0,1 M iki 0,5 M. EDTA (1-5 mM) reikalingas metalų jonais katalizuoj amų oksidacijos procesų pašalinimui (ir išvengti baltymų agregacijos) , šie procesai pastebimi kai kuriems preparatams. Didesnės nei 15 % glicerino koncentracijos sudaro optimalias struktūros atstatymui sąlygas. Tam , kad būtų didesnės proceso išeigos, labai svarbu, kad tirpale būtų red-oks reaktyvų pora: oksiduotas ir redukuotas gliutationas ar oksiduotas ir redukuotas cisteinas. Paprastai gaunamos didesnės proceso išeigos, kai oksiduotos ir redukuotos formos molinis santykis yra lygus ar didesnis nei vienetas. TPO preparatų struktūros atstatymui optimalus tirpalo pH yra nuo 7,5 iki 9. Organinių tirpiklių
[0627] (pvz., etanolis, acetonitrilas, metanolis) toleruojama koncentracija yra 10-15 % arba žemesnė. Didinant organinių tirpiklių koncentraciją, didėja baltymo formų su netaisyklingais disulfidiniais tilteliais. Geriausia naudoti TRIS ir fosfatinius buferinius tirpalus. Atstatant baltymo struktūra 4°C temperatūroje, gaunama didesnė teisingai atstatytos struktūros TPO baltymo išeiga.
[0628] TPO preparatams, grynintiems pirmą kartą per C4 kolonėlę, struktūros atstatymo proceso tipiška išeiga sudaro 40-60 % (skaičiuojant nuo redukuoto ir denatū-ruoto TPO kiekio). Biologiškai aktyvūs preparatai gali būti gaunami, kai struktūros atstatymo procese naudojami mažiau išgryninti TPO preparatai (pvz., po Superdex 200 gelfiltracijos ar po intarpinių kūnelių eks-trakcijos ), bet šiais atvejais šio proceso išeiga būna mažesnė dėl didelio baltymo išsėdimo į nuosėdas ir dėl priemaišinių baltymų trukdymo.
[0629] Kadangi TPO ( Met- 1 1- 153) baltymo sudėtyje yra keturios cisteino liekanos, tai galimi trys skirtingi disulfidinių tiltelių susidarymo variantai šiame baltyme: 1 variantas: disulfidinis ryšys tarp 1- 4 ir 2- 3 cisteino liekanos 2 variantas: disulfidinis ryšys tarp 1- 2 ir 3- 4 cisteino liekanos 3 variantas: disulfidinis ryšys tarp 1- 3 ir 2- 4 cisteino liekanos
[0630] Pradinių struktūros atstatymo sąlygų tyrimuose buvo naudojama keletas frakcijų TPO baltymo po chromatografijos atvirkštinių fazių kolonėlėje C4 . Tik viena frakcija pasižymėjo žymesniu biologiniu aktyvumu, tiriant su BA/ F3 ląstelėmis. Vėliau struktūros atstatymo sąlygos buvo optimizuojamos, naudojant šiuos preparatus. Šiomis sąlygomis neteisingos struktūros baltymo kiekis buvo mažesnis nei 10- 20 % nuo bendro gauto monomerinio TPO kiekio.
[0631] Biologiškai aktyvaus TPO disulfidinių tiltelių išsidėstymas buvo nustatytas remiantis masės spektroskopija ir analizuojant baltymo amino rūgščių liekanų seką. Biologiškai aktyvaus TPO baltymo disulfidinių tiltelių vietos yra tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanos (t.y., 1 variantas). Baltymo frakcijų po C4 chromatografijos mėginiai (5-10 nM) buvo skaldomi tripsinu (tripsino ir baltymo molinis santykis 1:25) . Skaldymo mišinys buvo analizuojamas matricine lazerine assorb-cine masės spektroskopija prieš ir po redukcijos DDT. Po redukcijos buvo nustatomi baltymo fragmentai, atitinkantys didžiausius tripsininius TPO fragmentus. Neredukuotucse pavyzdžiuose keletas iš šių fragmentų nebuvo nustatyti, bet atsirasdavo kitos molekulinės masės fragmentai. Naujai atsiradusiųjų fragmentu mole-kulinė masė daugeliu atvejų sutapo su atskirų tripsini-nių peptidų, daI yvauj ančių disulfidinių tilteliu susi-daryme, molekulinių masių suma. Taigi, galima neabejo-tinai teigti, kad teisingos disulfidinių jungčių vietos atstatytos struktūros rekombinantiniame biologiškai aktyviame TPO baltyme yra tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanų. Tai sutampa su žinomomis disulfidinių jungčių vietomis eritropoetino molekulėje.
[0632] Atstatytos struktūros išgrynintas TPO(Met-1 1-153) pasižymėjo aktyvumu kaip in vitro, taip ir in vivo tyrimuose. Tiriant BA/F3 ląstelėse, buvo nustatyta, kad pusė maksimalios timidino įsijungimo į BA/F3 ląsteles stimuliacijos buvo pasiekiama su 3,3 pg/ml(0,3 pM) TPO. Mėginius tiriant ELISA, pagrįsta sąveika su mpl receptoriumi, pusė maksimalaus aktyvumo pasiekiama esant 1.9 ng/ml (120 pM) TPO koncentracijai. Normaliuose ir mielosupresuotuose gyvūnuose, apšvitintuose beveik letalia Rentgeno spindulių doze, TPO(Met_1 1-153) labai efektyviai stimuliavo naujų trombocitų susidarymą
[0633] (aktyvumas buvo pastebimas net esant 30 ng/pelei dozei).
[0634] Trys skirtingi TPO variantai, produkuojami E. coli, buvo išgryninti ir atstatyta baltymų struktūra iki biologiškai aktyvių preparatų. Šie variantai buvo tokie: (1) MFL - 13 amino rūgščių liekanų iš bakterinės STII signalinės sekos buvo sulieta su TPO domeno(1-155 amino rūgščių liekanos) N galu. Gauta galutinė seka: MKKNIAFLLNAYASPAPPAC —-CVRRA ( SEQ ID Nr.:85),
[0635] kur lyderinė seka yra pabraukta, C----C pažymėta seka nuo Cys7 iki Cysl51. Šis variantas buvo sukonstruotas, kad būtų galima pažymėti tirozino liekanas radioaktyviu
[0636] jodu - toks TPO baltymas buvo naudojamas tiriant receptorius ir įvertinant biologinį aktyvumą.
[0637] ( 2) H8MFL - 7 amino rūgščių liekanos iš STII sekos, 8 histidino liekanos ir Xa faktoriaus fermentinio skėlimo vieta IEGR buvo sulieta su TPO baltymo domeno ( 1- 155 amino rūgščių liekana) N galu. Galutinė seka:
[0638] MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC -- CVRRA ( SEQ ID Nr. :86), kur lyderinė seka yra pabraukta, C— C pažymėta seka nuo Cys7 iki Cysl51. Šis TPO baltymo variantas po išgryni-nimo ir struktūros atstatymo gali būti paveiktas fermentu - Faktoriumi Xa, kuris skelia grandinę po arginino liekanos sekoje IEGR. Po skaldymo gaunamas TPO baltymo variantas su 155 amino rūgščių liekanų seka, kuriame kaip ir gamtiniame baltyme yra serino liekana baltymo N gale.( 3) T- H8MFL - buvo sukonstruotas kaip variante( 2), iškyrus tai, kad trombino skaldoma seka IEPR buvo sulieta su TPO domeno N galu. Galutinė seka: MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC — CVRRA ( S. EQ ID Nr. :87), kur lyderinė seka yra pabraukta, C— C pažymėta seka nuo Cys7 iki Cysl51. Šis TPO baltymo variantas po išgryni-nimo ir struktūros atstatymo gali būti paveiktas trombinu. Po skaldymo gaunamas gamtinis N galo TPO baltymo variantas su 155 amino rūgščių liekanų seka.
[0639] A. Biologiškai aktyvaus TPO variantų ( 1) , ( 2) ir ( 3) išskyrimas, soliubilizavimas ir monomerinių formų išgryninimas.
[0640] Visi šie TPO baltymo variantai buvo ekspresuoti E. coli. Šių variantų baltymų pagrindinis kiekis buvo produkuojams intarpiniuose kūneliuose, tai buvo nustatyta TPO (Met-1 1-153) atveju Pavyzdyje 22. Buvo naudojami identiški baltymų išskyrimo, soliubilizavimo ir monomerinių TPO variantų gryninimo metodai, kaip ir aprašyti Pavyzdyje 22. Buvo naudojamos identiškos struktūros atstatymo sąlygos, kaip ir TPO (Met"1 1-153) atveju , bendra šios stadijos išeiga sudarė 30-50 %. Po struktūros atstatymo TPO variantai buvo chromatografuo-jami C4 atvirkščių fazių kolonėlėje, esant 0,1 % TFA, naudojant aprašytą aukščiau acetonitrilo gradientą. Visi TPO variantai (proteolitiškai nesuskaldyti) pasi-žymėjo biologiniu aktyvumu, vertinant Ba/F3 analizėje, jų pusiau maksimalus aktyvumas buvo nuo 2 iki 5 pM.
[0641] B. Variantų ( 2) ir ( 3) proteolitinis skaldymas, gaunant TPO su gamtiniu N baltymo galu ( 1- 155)
[0642] Aprašyti aukščiau TPO variantai (2) ir (3) buvo sukonstruoti su papildoma fermetais nuskeliama lyderine seka prieš normalaus TPO baltymo N galinę amino rūgščių liekaną. Po struktūros atstatymo ir išgryninimo apra-šyti aukščiau (2) ir (3) TPO variantai buvo skaldomi jiems tinkamais proteolitiniais fermentais. Iš kiekvieno varianto eliuatų nuo C4 kolonėlės acetonitrilas buvo pašalinamas prapučiant tirpalus nestipria azoto srove. Po to variantai buvo paveikti arba Faktoriumi Xa, arba trombinu.
[0643] TPO varianto (2) atveju buvo pridedama į tirpalą, iš kurio buvo pašalintas acetonitrilas, 1 M Tris buferinio tirpalo, pH 8,0 iki galutinės jo koncentracijos 50 mM ir tirpalo pH buvo koreguojamas, kad būtų lygus 8. NaCl ir CaCl2 buvo atitinkamai įdedama iki 0,1 M ir 2 mM. Faktoriaus Xa (New England Biolabs) buvo įdedama, kad molinis fermento ir TPO baltymo varianto santykis būtų nuo 1:25 iki 1:100. Mėginys buvo inkubuojamas 1-2 valandas kambario temperatūroje, siekiant maksimalaus nuskėlimo, šis procesas buvo kontroliuo-jamas SDS PAGE analize pagal baltymo migraciją gelyje. Po to reakcijos mišinys buvo gryninamas C4 atvirkščių fazių chromatografija, naudojant tokį pat gradientą ir chromatografijos sąlygas, kaip aprašyta aukščiau gryninant taisyklingos struktūros baltymus. Nesuskaldy-tas variantas B buvo atskiriamas nuo skaldyto varianto (2) šiomis sąlygomis. Po skaldymo buvo nustatyta baltymo N galo seka - SPAPP, tai įrodo, kad sėkmingai buvo pašalinta lyderinė baltymo seka. Faktorius Xa taip pat gali skelti ir kitoje TPO baltymo sekos vietoje; gali nuskelti ties 118 arginino liekana, tuo atveju baltymo N gale seka yra TTAHKD- (SEQ ID Nr.:88). Atie-kant skaldyto Faktoriumi Xa varianto SDS PAGE analizę neredukuojančiomis sąlygomis, stebima viena baltymo juosta, atitinkanti 17000 D molekulinę masę; atliekant SDS PAGE analizę redukuojančiomis sąlygomis, stebimos dvi baltymo juostos, atitinkančios 12000 ir 5000 D molekulinę masę, jei baltymas buvo suskaldytas ties 118 arginino liekana. Šis rezultatas paaiškinamas tuo, kad dvi molekulės dalys yra sujungtos tarpusavyje disulfi-diniu tilteliu tarp 1 ir 4 cisteino liekanos, tai buvo nustatyta analizuojant baltymo tripsininį žemėlapį, kaip aprašyta ankščiau. Matuojant biologinį aktyvumą su Ba/F3 ląstelėmis, buvo nustatyta, kad išgrynintam TPO (1-155) variantui, pašalinus N gale lyderinę seką ir perskėlus baltymą viduryje, pusė maksimalaus aktyvumo sudarė nuo 0,2 iki 0,3 pM.
[0644] TPO varianto (3) atveju skaldymo buferinis tirpalas buvo 50 mM Tris, pH 8, 2 % CHAPS, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA ir žmogaus ar jaučio trombinas (Calbiochem) santykiu nuo 1:25 iki 1:50 (fermento masė su TPO varianto baltymo kiekiu). Baltymo skaldymas buvo vykdomas 2-6 valandas kambario temperatūroje. Skaldymo eiga buvo įvertinama SDS PAGE analize, kaip aprašyta skaldant baltymą Faktoriumi Xa. Šiuo atveju buvo pasiekiama didesnė nei 90 % skaldymo išeiga. Gautas TPO baltymas buvo chromatografuoj amas C4 atvirkščių fazių kolonėlė-je, kaip aprašyta aukščiau, po chromatografijos buvo nustatyta, kad baltymas turi N galo baltymo seką. Tik nedidelė (<5 %) baltymo dalis buvo suskaldyta vidinėje baltymo sekos dalyje ties ta pačia arginino ir treonino jungties vieta, kaip ir skaldant faktoriumi Xa. Galutinis TPO baltymas pasižymėjo dideliu biologiniu aktyvumu, jo 0,2 - 0,4 pM sukėlė pusę maksimalaus atsako Ba/F3 ląstelėse. Analizuojant ELISA metodu, kuris paremtas sąveika su mpl receptoriumi,šis baltymas sukėlė pusę maksimalaus atsako, esant jo koncentracijai 2 - 4 ng/ml (120-240 pM išgryninto baltymo). Tuo tarpu neskaldyto baltymo, turinčio lyderinę seką, aktyvumas abiejose analizėse buvo 5-10 kartų mažesnis. Atliekant tyrimus su gyvulėliais, HPLC išgrynintas suskaldytas baltymas buvo dializuojamas fiziologiniame buferiniame tirpale su 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 80 ir 10 mM natrio sukcinato, pH 5.5 arba 10 mM natrio acetato, pH 5,5, arba 10 mM natrio fosfato, pH 7,4. Analizuojant HPLC ir SDS PAGE analize, buvo nustatyta, kad išgrynin-tas baltymas stabilus keletą savaičių, kai saugomas 4°C temperatūroje. Normaliuose ir mielosupresuotuose pelėse šis išgrynintas TPO baltymas su natyviu N galu labai efektyviai stimuliavo naujų trombocitų susidarymą, aktyvumas buvo pastebimas net esant jo dozei 30 ng/pelei.
[0645] Nors žmogaus mpl ligandas (hML) paprastai gaunamas naudojant rekombinantinius metodus, šis baltymas taip pat gali būti gaunamas, fermentais liguojant sintetinius baltymo fragmentus aprašytais žemiau metodais. Sintetinat hML galima įvesti nenatūralias amino rūgščių liekanas ar sintetinius elementus, tokius, kaip polietilenglikolis. Anksčiau buvo nustatyta, kad mutantinė serininė proteinazė subtilizinas BPN, subtiligazė
[0646] (S221C/P225A), efektyvi liguojant peptidų esterius vandeniniuose tirpaluose (Abrahmsen et al., Biochem. , 30:4151-4159 [1991] ) . Buvo parodyta, kad sintetiniai peptidai gali būti fermentiniu būdu nuosekliai liguojami, ir gaunami ilgi polipeptidai, pasižymintys fermentiniu aktyvumu, ar baltymai, tokie kaip ribo-nukleazė A (Jackson et al., Science, [1994]). Šis
[0647] metodas, žemiau aprašytas detaliau, įgalina mus cheminiu būdu sintetinti baltymus, kurie ankščiau buvo gaunami tik rekombinantinės technologijos būdu.
[0648] hML153 sintezės, naudojant subtiligazę, strategija pateikta Schemoje 1. Pradedant nuo pilnai deblokuoto peptido, atitinkančio baltymo C galą, subtiligazę pri-jungiamas N gale apsaugoto ir C gale aktyvuoto sekančio peptido esteris. Kai reakcija pasibaigia, produktas išskiriamas chromatografuoj ant HPLC atvirkščiose fazė-se, pašalinama apsauginė grupė N gale. Sekantis peptido fragmentas liguojamas, pašalinamos apsauginės grupės ir procesas kartojamas, naudojant taisyklingus peptidus, kol susintetinamas norimo ilgio baltymas. Procesas panašus į kietafazinį metodą, bet šiuo atveju peptido N galas yra apsaugomas, C galas aktyvuojamas, peptidas liguojamas prie N galo, baltymas sintetinamas C—»N kryptimi. Kadangi kiekvienoje prijungimo stadijoje peptidą galima pailginti iki 50 amino rūgščių liekanų, šie tarpiniai produktai yra išskiriami po kiekvieno ligavimo ir todėl ilgesni išgryninti baltymai gali būti sintetinami priimtinomis išeigomis.
[0649]
[0650] Remiantis žiniomis apie subtiligazės specifiškumą., o taip pat biologiškai aktyvaus hML "epo-domeno" amino rūgščių liekanų seka, mes padalijom hML153 i septynis 18 -15 amino rūgščių liekanų ilgio fragmentus. 18 - 15 amino rūgščių liekanų ligavimo efektyvumas buvo patik-rintas, naudojant sintetinius tetrapeptidus. Lentelė-je' 13 pateikti bandomojo ligavimo rezultatai.
[0651] hML bandomasis ligavimas. Donoras ir nukleofili-niai peptidai (10 mM) buvo ištirpinti 100 mM
[0652] Tricine (pH 7,8) 22°C temperatūroje. Ligazės buvo pridedama iki galutinės jos koncentracijos 10 įiM (naudojamas buvo 1,6 mg/ml tirpalas [apie 70 fiM] ) , ligavimas buvo vykdomas per naktį. Išeigos nurodytos ligavimo % nuo peptidų donorų hidrolizės.
[0653] Remiantis šiais eksperimentais, lentelėje 14 iš-vardinti peptidai turi efektyviai liguotis su subtiligaze. Tinkamos apsauginės grupės kiekvieno donorinio peptidinio esterio N gale reikalingos, norint išvengti peptidų tarpusavio ligavimosi. Mes pasirinkome izonikotinilo (iNOC) apsauginę grupę (Veber et al., J. Org. Chem., 42:3286-3289 [1977]), nes ji tirpi vandenyje, ir gali būti naudojama paskutinėje ketafazinėje peptidų sintezės stadijoje, taip pat ji atspari HF, kai ši rūgštis naudojama apsauginių grupių nuėmimui ir atske-liant peptidus nuo sintezės matricos. Papildomai ji gali būti pašalinta nuo peptidų po kiekvienos ligavimo stadijos švelniomis redukcinėmis sąlygomis (Zn/CH3CC>2H) ir taip gaunamas neblokuotas peptido N galas sekančiam ligavimo žingsniui. Esteris glikolat-lizil-amidas (glc-K-NH2) buvo naudojamas aktyvuoti peptidų C galą. Šis pasirinkimas buvo paremtas parengtiniais eksperimentais, kuriuose buvo parodyta, kad jis yra efektyvus liguojant subtiligaze (Abrahmsen et al., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). Peptidai, apsaugoti iNOC grupe ir aktyvuoti glc-K-amidine grupe, gali būti sintetinami standartiniais kietafaziniais metodais, kurie yra pateikti Schemoje 2. Peptidai nuosekliai buvo liguojami, kol buvo susintetinamas pilno ilgio baltymas, galutinio produkto struktūra buvo atstatoma in vitro. Pagal homologiją su EPO, disulfidiniai tilteliai turi būti sudaryti tarp 7 - 151 ir 18 - 85 cisteino liekanų. Disulfidinių jungčių oksidavimas gali būti atliktas tiesiog maišant tirpalą deguonies atmosferoje keletą valandų. Atstatytos struktūros produktas gali būti išgryninamas, naudojant HPLC, o frakcijos, kuriose yra aktyvus baltymas, surenkamos ir liofilizuotos. Alter-natyviu būdu disulfidinės jungtys gali būti skirtingais būdais apsaugotos, siekiant kontroliuoti disulfidinių tiltelių oksidaciją tarp specifinių disulfidinių porų. Apsaugant 7 ir 151 cisteino liekanas acetamidometilo grupe (acm) , galima oksiduoti 28 ir 85 cisteino liekanas atskirai. Nuo blokuotų liekanų acm grupės pašali-namos, o 7 ir 151 cisteino liekanos oksiduojamos. Ir atvirkščiai - 28 ir 85 cisteino liekanos gali būti blokuojamos acm, jeigu oksidacija reikalinga tam, kad susidarytų taisyklingos struktūros baltymas. Papildomai 28 ir 85 cisteino liekanos gali būti pakeistos kitomis natūraliomis arba sintetinėmis liekanomis, ne cisteinu, tam kad būtų galima atlikti taisyklingą oksidaciją tarp 7 ir 151 cisteino liek.anų.
[0654] Peptidų ligavimas buvo atliekamas 25°C tempera-tūroje 10 mM tricino buferiniame tirpale, pH 8 (švie-žiai paruoštas ir degazuotas filtruojant vakuume per 5 fim filtrą) . Paprastai C galo peptidinis fragmentas buvo ištirpinamas buferiniame tirpale (2-5 mM peptido) ir buvo pridedamas 10x subtiligazės pradinis (1 mg/ml subtiligazės 100 mM tricino buferiniame tirpale, pH 8) tirpalas iki galutinės fermento koncentracijos apie 5 j-iM. 3-5 kartų molinis perteklius glc-K-NH2 aktyvuoto donorinio peptido buvo pridedama arba kaip sausa medžiaga, arba kaip tirpias, ir reakcijos mišinys buvo paliekamas 25°C temperatūroje. Ligavimo eiga buvo įvertinama C18 atvirkščių fazių HPLC chromatografija (CH3CN/H2O gradientas su 0,1 % TFA) . Ligavimo produktai buvo gryninami preparatyvine HPLC ir liofiiizuojami. Izonicotinilo (INOC) apsauginės grupės buvo pašalinamos maišant su HC1 aktyvuotomis Zn dulkėmis, apsaugant peptidą acto rūgštimi. Nesureagavusios cinko dulkės buvo pašalinamos filtruojant, o acto rūgštis - garinant vakuume. Gautas polipeptidas gali būti iš karto naudojamas ligavimui ir procesas vėl kartojamas. Sintetinis hMLi53 gali būti gautas, liguojant aukščiau aprašytu būdu, su sintetiniu ar rekombinantiniu hMLi54-332 baltymu, ir taip gaunamas sintetinis arba pusiau sintetinis viso ilgio hML.
[0655] Sintetinis hML baltymas yra pranašesnis už rekom-binantinį. Sintetinio baltymo sudėtyje gali būti padaromi įvairūs pakeitimai, siekiant padidinti aktyvumą ar specifiškumą. Polimerinai dariniai, pvz., polietilenglikolis gali būti įjungti į baltymą, kad prolonguotų baltymo veikimą. Pavyzdžiui, polietilenglikolis gali būti prijungtas prie lizino liekanos kuriame nors individualiame fragmente (Lentelė 14) prieš arba po vieno ar kelių ligavimo žingsnių. Proteinazėms jautrios peptidinės jungtys gali būti pašalinamos arba pakeičia-mos tam, kad būtų padidintas baltymo stabilumas in vivo. Papildomai gali būti įvedami sunkiųjų metalų atomai, kad būtų galima palengvinti baltymo struktūros nustatymą.
[0656] a) Lysil-parametylbenzhidrilamino (MBHA) matrica 1 (0,63 mekv/g, Chemtech) buvo maišoma su bromacto
[0657] rūgštimi (5 ekv.) ir diizopropilkarbodiimidu (5 ekv.) vieną valandą 25°C temperatūroje dimetilacetamido (DMA)
[0658] b) Matrica buvo gerai atplaunama DMA ir individualios Boc-blokuotos (3 ekv., Bachem) amino rūgštys buvo
[0659] esterifikuojamos, maišant su natrio hidrokarbonatu (6 ekv.) dimetilformamide (DMF) 24 valandas 50°C temperatūroje, kad būtų galima jas prijungti prie glikolatfenilalanilamidinės matricos 3. Aminoaceti-
[0660] linta matrica 3 buvo po 3 kartus praplaunama DMF ir dichlormetanu (CH2CI2)• Taip paruoštą matricą galima saugoti kambario temperatūroje keletą mėnesių. Matrica 3 gali būti naudojama automatiniame peptidų sin-tezatoriuje (Applied Biosystems 430A), peptidai gali būti prijungiami pagal standartinius kietafazės peptidų
[0661] c) N-a-Boc grupės pašalinamos 45 % trifluoracto rūgš-ties tirpalu dichlormetane. d) Po to Boc-apsaugotos amino rūgštys (5 ekv.) yra preaktyvuojamos su benzotriazol-l-il-oksi-tris-(di-metilamino)fosfonio heksafluorfosfatu (BOP, 4 ekv.) ir N-metilmorfolinu (NMM, 10 ekv.) DMA tirpale ir
[0662] e) N-a-Boc grupės visiškai pašalinamos (TFA/CH2CI2), gaunamas 4 darinys, įvedama izonikotinilo (iNOC)
[0663] apsauginė grupė, kaip aprašyta aukščiau (4), maišant su 4-isonikotinil-2-4-dinitrofenilkarbonatu (3 ekv.) ir NMM (6 ekv.) DMA tirpale 25°C temperatūroje 24
[0664] f) Peptidas atskeliamas nuo matricos ir nuimamos blokavimo grupės, paveikiant bevandeniu HF (5 % ani-zolo/5 % etilmetilsulfido) 0°C temperatūroje 1 valan-dą. Gaunamas iNOC-apsaugotas, glikolat-lys-amid aktyvuotas peptidas 5, kuris išgryninamas C18 atvirkščių fazių HPLC (CH3CN/H2O gradientas, 0,1 % TFA). Visų gautų fragmentų tapatumas buvo tikrinamas masės spektrometrij a.
[0665] Pateiktas išradimas gali būti atkartotas, remiantis aukščiau pateiktu aprašymu ir prieinamomis publika-cijomis ir pradinėmis medžiagomisa. Be to pareiškėjo atidavė saugoti American Type Culture Collection (ATCC) muziejui, esančiam Rockville, Md., USA ,ląstelių linijas, išvardytas žemiau: Escherichia coli , DHlOB-pBSK-hmpII 1.8, ATCC saugojimo Nr. CRL 69575, priimtas saugojimui 1994 m. vasario mėn. 24 d.
[0666] Plazmidė pSVI.ID.LL.MLORF, ATCC saugojimo Nr. CRL 75958, priimta saugojimui 1994 m. gruodžio mėn.
[0667] CHO DP-12 ląstelės, ML 1/50 MCB (pažymėtos Nr. 1594), ATCC saugojimo Nr. CRL 11770, priimtos saugojimui 1994 m. gruodžio mėn. 6 d.
[0668] Šis muziejus buvo sudarytas pagal Budapešto Sutar-tį, reguliuojančią Tarptautines Mikroorganizmų Muziejų Sudarymo taisykles patentavimo tikslams, ir atitinkamus poįstatyminius aktus. Tai užtikrina gyvybingų kultūrų palaikymą 30 metų nuo priėmimo saugojimui datos. Mikroorganizmai gali būti paimami iš ATCC pagal tvarką, nurodytą Budapešto Sutartyje, ir yra susitarimo objektas tarp pateikėjo ir ATCC, kuris garantuoja neribotą galimybę naudotis kultūromis, nepažeidžiant JAV patento. Galimybė naudotis saugomomis kultūromis nereiškia teisės naudoti šį išradimą, pažeidžiant patento savininko teises, kurios yra garantuojamos kiekvienos Vyriausybės pagal jos Patentų įstatymus.
[0669] Kadangi aprašant išradimą būtina pateikti geriausius išradimo įgyvendinimo būdus ir konkrečius darbinius pavyzdžius, tai kiekvienas eilinis specialistas, perskaitęs šį aprašymą, galės padaryti įvairius pakeitimus, naudoti medžiagų analogus, ir kitaip pakeisti išradimą, nepakeičiant esmės. Tai yra, šis išradimas gali būti panaudojamas kitaip, nei čia aprašyta. Todėl laikoma, kad patentu suteikiama apsauga ribojama išradimo apibrėžtimi, taikant ekvivalentus.
[0670]
1. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame (i) žmogaus genominę biblioteką tikrina su oligonukleotidu, sudarytu pagal genominę seką, pateiktą Fig. 9, siekiant išskirti genominę DNR, kurioje būtų mpl ligando egzoną koduojanti seka, pateikta Fig. 9, ir likusieji geno egzonai;(ii) DNR įterpia į ekspresijos vektorių;(iii) žinduolių ląsteles transfekuoja šiuo vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(iv) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
(ii) DNR įterpia į ekspresijos vektorių;(iii) žinduolių ląsteles transfekuoja šiuo vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(iv) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.2. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame:(i) iš genominės bibliotekos išskiria genominę DNR, kuri hibridizuojasi, esant silpno griežtumo sąlygoms, su DNR seka5' - GCC CTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG CAG TTT ATT TAG GAG TCG -3'ir kurios sudėtyje yra egzonai, koduojantys mpl ligando polipeptidą;(ii) DNR įterpia į ekspresijos vektorių;(iii) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(iv) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
(i) iš genominės bibliotekos išskiria genominę DNR, kuri hibridizuojasi, esant silpno griežtumo sąlygoms, su DNR seka5' - GCC CTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG CAG TTT ATT TAG GAG TCG -3'ir kurios sudėtyje yra egzonai, koduojantys mpl ligando polipeptidą;5' - GCC CTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG CAG TTT ATT TAG GAG TCG -3'ir kurios sudėtyje yra egzonai, koduojantys mpl ligando polipeptidą;(ii) DNR įterpia į ekspresijos vektorių;(iii) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(iv) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.3. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame:(i) tinkamas ląsteles - žmogaus mpl ligandą koduo-jančios RNR šaltinį - identifikuoja ir paruošia vieną ar kelias kDNR bibliotekas iš šios RNR;(ii) siekiant identifikuoti ir išskirti kloną, kuriame būtų mpl ligandą koduojanti seka, vykdo bibliotekos ar bibliotekų atranką,hibridizacijai naudojant žymėtą oligonukleotidą, paruoštą pagal koduojančią seką, pateiktą Fig. 9;(iii) koduojančią DNR įterpia į ekspresijos vektorių, tinkamą ekspresijai žinduolių ląstelėse;(iv) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(v) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
(i) tinkamas ląsteles - žmogaus mpl ligandą koduo-jančios RNR šaltinį - identifikuoja ir paruošia vieną ar kelias kDNR bibliotekas iš šios RNR;(ii) siekiant identifikuoti ir išskirti kloną, kuriame būtų mpl ligandą koduojanti seka, vykdo bibliotekos ar bibliotekų atranką,hibridizacijai naudojant žymėtą oligonukleotidą, paruoštą pagal koduojančią seką, pateiktą Fig. 9;(iii) koduojančią DNR įterpia į ekspresijos vektorių, tinkamą ekspresijai žinduolių ląstelėse;(iv) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(v) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.4. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame:(i) iš iRNR, išskirtos iš žmogaus inkstų ląstelių, paruošia kDNR biblioteką ar bibliotekas;(ii) siekiant identifikuoti ir išskirti kloną, kuriame būtų mpl ligandą koduojanti seka, vykdo bibliotekos ar bibliotekų atranką, hibridizacijai naudojant žymėtą oligonukleotidą, paruoštą pagal koduojančią seką, pateiktą Fig. 9;(iii) koduojančią DNR įterpia į ekspresijos vektorių, tinkamą ekspresijai žinduolių ląstelėse;(iv) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(v) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
(i) iš iRNR, išskirtos iš žmogaus inkstų ląstelių, paruošia kDNR biblioteką ar bibliotekas;(ii) siekiant identifikuoti ir išskirti kloną, kuriame būtų mpl ligandą koduojanti seka, vykdo bibliotekos ar bibliotekų atranką, hibridizacijai naudojant žymėtą oligonukleotidą, paruoštą pagal koduojančią seką, pateiktą Fig. 9;(iii) koduojančią DNR įterpia į ekspresijos vektorių, tinkamą ekspresijai žinduolių ląstelėse;(iv) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir(v) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.5. Išskirtas, iš esmės homogeninis mpl ligandas, charakterizuojamas šiais požymiais:(a) ligandas stimuliuoja žymėtų nukleotidų (^H-timidino) įsijungimą į Ba/F3 ląstelių, transfekuotų žmogaus mpl P ir priklausomų nuo IL-3, DNR;(b) ligandas stimuliuoja 35g įsijungimą į cirku-liuojančius trombocitus, naudojant atsakomosios trombocitozės metodą;(c) ligandas yra stabilus, esant pH iki 2,5, 0,1 % SDS, ir 2 M karbamido;(d) ligandas yra glikoproteinas;(e) polipeptido N galo amino rūgščių liekanų seka yra SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR arba SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL.
(a) ligandas stimuliuoja žymėtų nukleotidų (^H-timidino) įsijungimą į Ba/F3 ląstelių, transfekuotų žmogaus mpl P ir priklausomų nuo IL-3, DNR;(b) ligandas stimuliuoja 35g įsijungimą į cirku-liuojančius trombocitus, naudojant atsakomosios trombocitozės metodą;(c) ligandas yra stabilus, esant pH iki 2,5, 0,1 % SDS, ir 2 M karbamido;(d) ligandas yra glikoproteinas;(e) polipeptido N galo amino rūgščių liekanų seka yra SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR arba SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL.6. mpl ligandas, gaunamas, išskiriant jį iš aplastinės plazmos hidrofobinės sąveikos chromatografija, imobi-lizuotų dažų chromatografija ir mpl-afinine chromatografija, turintis molekulinę masę, nustatytą SDS PAGE analize redukuojančiomis sąlygomis, 18-22 kD, 28 kD arba 30 kD srityje.
7. Išskirtas mpl ligando polipeptidas, koduojamas nukleino rūgštimi, kuri hibridizuojasi, esant vidutiniškai griežtom sąlygom, su nukleino rūgštimi, kurios seka prasideda 119 nukleotidu ir yra pateikta Fig. 9 (ID Nr.:4 ar ID Nr.:5)
8. Išskirtas mpl ligandas pagal bet kurį ankstesnį punktą, besiskiriantis tuo, kad jis pasižymi biologiniu aktyvumu.
9. mpl ligando polipeptidas, kurio sekos identiškumas yra bent 70 %, lyginant su polipeptidu pagal bet kurį iš 1-7 punktų.
10. mpl ligando polipeptidas, kuris yra alelinis arba kitoks polipeptido pagal 1-7 punktus variantas, pasižymintis mpl ligando biologiniu aktyvumu.
11. mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad yra išskirtas iš žmogaus.
12. mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad yra išskirtas ne iš žmogaus.
13. mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad yra ne glikozilintas.
14. Sulietas baltymas, kurio sudėtyje yra mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų ir heterologinis polipeptidas.
15. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, koduojanti polipeptidą pagal bet kurį iš ankstesnių punktų.
16. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, pasirenkama iš:(a) kDNR klono, gaunamo pagal 3 punkto (iii) dalį arba pagal 4 punkto (ii)dalį;(b) DNR sekos, galinčios hibridizuotis, esant griežtoms sąlygoms, su klonu, gautu pagal šio punkto (a) dalį; ir(c) bet kurio genetinio DNR sekos, gautos pagal šio punkto (a) arba pagal šio punkto (b) dalis, varianto, kuris koduoja polipeptidą, turintį gamtoje aptinkamo mpl ligando biologines sąvybes.
(a) kDNR klono, gaunamo pagal 3 punkto (iii) dalį arba pagal 4 punkto (ii)dalį;(b) DNR sekos, galinčios hibridizuotis, esant griežtoms sąlygoms, su klonu, gautu pagal šio punkto (a) dalį; ir(c) bet kurio genetinio DNR sekos, gautos pagal šio punkto (a) arba pagal šio punkto (b) dalis, varianto, kuris koduoja polipeptidą, turintį gamtoje aptinkamo mpl ligando biologines sąvybes.17. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, kuri hibridizuojasi, esant vidutiniškai griežtom sąlygom, su nukleino rūgštimi, kurios seka prasideda 119 nukleotidu ir yra pateikta Fig. 9 (ID Nr. :4 ar ID Nr.:5), ir koduoja mpl ligandą.
18. Genominė DNR arba kDNR, atitinkanti bent dalį mpl ligando geno, ir kuri hibridizuojasi, esant sąlygoms nuo vidutiniškai griežtų iki labai griežtų, su gamtoje aptinkama nukleino rūgšties molekule, koduojančia mpl ligandą pagal bet kurį iš 1-7 punktų.
19. Nukleino rūgštis pagal bet kurį iš 15-18 punktų, besiskirianti tuo, kad yra funkcionaliai sujungta su promotoriumi.
20. Ekspresijos vektorius, kurio sudėtyje yra nukleino rūgštis pagal bet kurį iš 15-18 punktų, funkcionaliai sujunta su kontroliuojančiomis sekomis, atpažįstamomis ląstelės - šeimininko.
21. Ląstelės-šeimininkai, transformuotos nukleino rūgštimi pagal bet kurį iš 15-20 punktų, sugebančios ekspresuoti nurodytas nukleino rūgšties sekas ir produkuoti mpl ligando polipeptidą.
22. Nukleino rūgšties ekspresijos būdas, besiskiriantis tuo, kad rekombinantinės nukleino rūgšties pagal bet kurį iš 15-20 punktų ekspresiją vykdo ląstelėj e-šeimininke, kuri sugeba produkuoti rapl ligando polipeptidą
23. Būdas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad rapl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių-šeimininkų arba iš ląstelių-šeimininkų kultivavimo terpės.
24. Ekspresijos būdas, besiskiriantis tuo, kad vykdo laukinio mpl ligando geno ekspresiją ląstelėje, ir ekspresija yra kontroliuojama promotoriumi/sustip-rintoju, supresoriumi ar egzogeniniu transkripciją moduliuojančiu elementu, kurie buvo įterpti į ląstelės genomą tinkamu atstumu ir tinkama orientacija, kad galėtų įtakoti DNR, koduojančios mpl ligando polipeptidą, transkripciją.
25. Kompozicija, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra mpl ligandas pagal bet kurį iš 1-14 punktų, arba gautas būdu, pagal 22 arba 23 punktą, ir vaistų gamybai tinkamas nešiklis.
26. mpl ligando polipeptido pagal bet kurį iš 1-14 punktų, arba gauto būdu pagal 22 arba 23 punktą panaudojimas medikamentų gamybai.
27. Kompozicija pagal 25 punktą, arba gaunama pagal 26 punktą, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra terapiškai efektyvus agento, pasirinkto iš citokinų, kolonijas stimuliuojančių faktorių ir interleukinų, kiekis.
28. Kompozicija pagal 27 punktą, besiskirianti tuo, kad agentas pasirinktas iš: LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8,IL-9 ir IL-11.
IL-9 ir IL-11.29. Mėginio nukleino rūgšties amplifikacijos būdas, besiskiriantis tuo, kad nukleino rūgšties poliraerazinę reakciją inicijuoja naudojant nukleino rūgštį, atitinkančią bent dalį genominės ar kDNR pagal 18 punktą.
30. mpl ligando polipeptido nustatymo būdas, besiskiriantis tuo, kad DNR pagal 18 punktą hibridizuoja su mėginių nukleino rūgštimi ir nustato mpl ligando polipeptido nukleino rūgštį.
31. mpl ligandui specifinių antikūnų gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad naudoja mpl ligando polipeptidą pagal bet kurį iš 1-14 punktų, arba gautą būdu pagal 22 arba 23 punktą.
32. Būdas pagal 31 punktą, besiskiriantis tuo, kad gaunami antikūnai yra monokloniniai.
33. Antikūnai, gaunami būdu pagal 31 arba 32 punktą.
34. Antikūnai, sugebantys jungtis su mpl ligando polipeptidu pagal bet kurį iš 1-14 punktų.
35. Antikūnai, pagal 34 punktą, besiskiriantys tuo, kad jie yra monokloniniai.
36. Hibridominė ląstelių linija, produkuojanti antikūnus pagal 33 punktą arba 35 punktą.