[LT] Išradimas priklauso biotechnologijos, ekologinės mikrobiologijos ir aplinkos apsaugos sritims ir tinka naudoti vandens ir grunto užterštumo lygiui įvertinti, naujų naftos telkinių paieškai, vandens ir grunto, užteršto nafta bei jos produktais, biologinio valymo ex situ arba in situ sąlygomis intensyvumui įvertinti. Naftą oksiduojančių mikroorganizmų (NOM) terpės gavimui į ją įneša naftos produktus, pagrindinius biogeninius mitybos elementus, mikroorganizmus kultivuoja aerobinėmis sąlygomis esant palankiam temperatūros režimui bei NOM, pasižyminčių skirtingomis fiziologinėmis-biocheminėmis savybėmis, geram vystymuisi užtikrinti į terpę įdeda naftą ir karbohidratus kaip anglies šaltinį, subalansuoja anglies, azoto, fosforo, kalio tarpusavio kiekius, įterpia mikroelementus, vitaminus, kompleksonus, svarbius naftą skaidančių mikroorganizmų veiklai intensyvinti. NOM terpė, pavadinta 'Liužino-GVT' terpė, apima naftos produktus, pagrindinius biogeninius mitybos elementus, azotą, fosforą, kalį, magnį, kalcį, naftą, sacharozę (arba melasa), sojos miltus, alaus misą, NaNO3, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4x7H2O, CaCl2x6H2O, FeSO4x7H2O; mikroelementus druskų pavidalu: ZnSO4x6H2O, MnSO4x4H2O, KJ, H3BO4, (NH4)6Mo7O24x7H2O, CuSO4x5H2O, CoCl2x6H2O; vitaminus: tiaminą (B1), riboflaviną (B2), pantoteno rūgštį (B5), nikotino rūgštį (PP), piridoksiną (B6); kompleksoną EDTA (etilendiamintetraacto rūgštį) ir vandenį.
[EN] The invention belongs to biotechnology environmental microbiology and environmental protection areas and the appropriate use of water and soil pollution levels to assess, to search for new oil fields, water and soil contaminated oil and petroleum products, ex situ biological treatment or in situ conditions to evaluate the intensity. Oil-oxidising microorganisms (OOM) obtained getting into the media petroleum products, the main biogenic elements of nutrition. Microorganisms cultivate under aerobic conditions and favorable temperature regime and OOM with their different physiological-biochemical characteristics, the good development of the medium is attached to the oil and carbohydrate as a carbon source, carbon balance, nitrogen, phosphorus, potassium between the quantities, adding trace elements, vitamins, chelating agents, those are basic to intensity the activities of resolving microorganisms. OOM medium, called medium 'Liužino-GVT', include oil products, the main dietary biogenic elements, nitrogen, phosphorus, potassium, magnesium, calcium, oil, sucrose (or molasses), soybean meal, beer wine, NaNO3, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4x7H2O, CaCl2x6H2O, FeSO4x7H2O; trace elements salts: ZnSO4x6H2O, MnSO4x4H2O, KJ, H3BO4, (NH4)6Mo7O24x7H2O, CuSO4x5H2O, CoCl2x6H2O; vitamins: thiamine (B1), riboflavin (B2), pantothenic acid (B5), nicotinic acid (PP), pyridoxine (B6); chelating agents EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and water.
[0001] Išradimas priklauso biotechnologijos, ekologinės mikrobiologijos ir aplinkos apsaugos sritims ir tinka naudoti vandens ir grunto užterštumo lygiui įvertinti, naujų naftos telkinių paieškai, vandens ir grunto, užteršto nafta bei jos produktais, biologinio valymo ex situ arba in situ sąlygomis intensyvumui įvertinti.
[0002] Pastaraisiais metais identifikuota apie 100 naftą oksiduojančių mikroorganizmų (NOM) rūšių (prieš keliasdešimt metų jų buvo žinoma tik kelios rūšys). Šios rūšys priklauso Achromobacter, Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Bacterium, Brevibacterium, Chromobacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus, Candida, Debaromyces, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Cladosporium, Penicillium, Trichoderma ir kt. gentims (sud. Jankevičius K., Liužinas R., Aplinkos biologinis valymas, V. 2003, 343 p.). Jų fiziologinės-biocheminės savybės yra skirtingos. Vienos rūšys (Trichoderma lignorum) bei smulkesni jų taksonai įsisavina gliukozę, sacharozę, manitą, krakmolą ir kitokius karbohidratus, nitratus, amonio druskas, baltymų hidrolizatus, aminorūgštis. Kitos rūšys (Acetobacter pasterianus) nesugeba fermentuoti gliukozės, sacharozės bei daugelio kitų angliavandenių. Skirtinga NOM mityba išryškėja ne tik vartojant anglies (C) bei azoto (N) mitybos šaltinius, bet ir kitą jų mineralinę mitybą.
[0003] Šiuo metu NOM kiekiui aplinkoje nustatyti naudojamos kelios dešimtys mitybinių terpių. Buvo atlikta dažniausiai naudojamų NOM kiekiui nustatyti Čapeko, Raimondo ir kaupiamosios kultūros mineralinės mitybinės terpės (žiūrėti - sud. Jankevičius K., Liužinas R., Aplinkos biologinis valymas, V. 2003, p 123, p. 136), bei 13-os mitybinių agarizuotų terpių, parinktų pagal įvairius mikrobiologinės literatūros šaltinius, revizija, įvertinant jų mitybines galias pagal išaugusių NOM (bakterijų ir mikromicetų) skaičių. Atlikti bandymai parodė nagrinėtų NOM mitybinių terpių tinkamumą ir jų trūkumus. Tai parodyta toliau pateiktais bandymų pavyzdžiais.
[0004] Atliktais bandymais parodyta (1 pavyzdys), kad identifikuojant NOM įvairovę (jų štamus) tinkamesnė yra Čapeko (palyginti su Raimondo) mineralinė mitybinė terpė. Čapeko terpėje išaugo 38 štamai, kai Raimondo - tik 10 (kontroliniame variante - be angliavandenilių išaugo išaugo 38 štamai, kai Raimondo - tik 10 (kontroliniame variante - be angliavandenilių išaugo 97 kultūros). Tas paaiškinama NOM citoplazmos koloidų ir mitybinės terpės jonų sąveika. Į NOM ląsteles iš terpės patenka ne vienos, o kelių rūšių jonai. Vyrauja tie jonai, kurių kinetinė energija yra didesnė. Kai terpėje santykis tarp jonų yra subalansuotas (fiziologiškai išlygintas), tokia terpė NOM vystymuisi yra tinkamesnė.
[0005] Tolesni tyrimai (2 pavyzdys) parodė, kad dar geriau subalansuota nei Čapeko mitybinė terpė yra kaupiamosios kultūros terpė. Pastarojoje išauginta NOM 10 kultūrų, kai Čapeko terpėje tik 3 (panaudotas kitoks nei 1 pavyzdyje atveju naftinės taršos šaltinis).
[0006] Žinomų 13 mitybinių terpių tinkamumą NOM auginti įvertinome tokiu būdu. Naftą oksiduojančių mikroorganizmų šaltiniu (inokuliatu) naudojome nuo naftos produktų dalinai apvalytą gruntą. Jis imtas iš 7 vietų (maždaug po 100 g) ir sudarytas bendras mėginys. Prieš bandymą gruntas pertrinamas ir gerai sumaišomas. Atsveriama 10 g grunto, patalpinama į kolbutę su 90 ml sterilaus vandentiekio vandens ir kratoma 10 min. Pirmas skiedimas atitinka 1:10 arba 10-1 skiedimą. Gauta suspensija skiedžiama pernešant 1 ml suspensijos į mėgintuvėlį su 9 ml sterilaus vandens. Taip paruošiamas keletas praskiedimų 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 (iki 10-5). Iš pasirinkto suspensijos praskiedimo po 1 ml pilama į Petri lėkštelę ir užpilama ištirpinta praaušusia agarizuota mitybinė terpe. Kai kuriais atvejais sėta paviršiniu būdu, kai 0,1 ml suspensijos paskleidžiama sustingusios terpės paviršiuje špateliu. Petri lėkštelės su mikroorganizmais inkubuojamos termostate 26°C temperatūroje 5-10 parų. Suskaičiuojamos išaugusios mikroorganizmų kolonijos ir apskaičiuojamas jų pradų (kolonijas sudarančių vienetų - ksv) kiekis 1 g sauso grunto.
[0007] Analitinėmis svarstyklėmis atsveriamas 1 g tiriamo grunto, patalpinamas į stiklinius biuksus ir džiovinamas 105°C temperatūroje iki pastovaus svorio. Mikroorganizmų skaičius skaičiuojamas pagal formulę n = abc/d, kur n - mikroorganizmų (ląstelės arba kolonijas sudarantys vienetai - ksv) skaičius 1 g sauso grunto, a - lėkštelėje išaugusių kolonijų skaičius, b - suspensijos praskiedimas, c - pasėtos suspensijos tūris (ml), d - sauso dirvožemio svoris. Vidurkis skaičiuojamas iš trijų pakartojimų (LST ISO 10381-6, 1998). Tyrimai atlikti naudojant 13 standžių terpių (pridedant po 2 % agaro), parinktų pagal įvairius mikrobiologinės literatūros šaltinius. Tyrimų rezultatai pateikiami 3-5 pavyzdžiuose. Juose nurodoma terpės eilės numeris, pavadinimas, literatūros šaltinis ir tyrimų duomenys. Terpės surikiuotos (didėjančia tvarka) pagal mikroorganizmų (bakterijų, mielių, mikromicetų), išaugusių ant tiriamųjų mitybinių terpių, skaičių (ksv x 104).
[0008] NOM minimalus skaičius (nuo 33,2 - 4 terpė iki 99,4 ksv x 104 - 8 terpė) išaugo 2, 4, 8, 12 terpėje. Tarpinę padėtį užėmė 1, 3, 9, 10, 11, 13 terpė (nuo 131,0 - 1 terpė iki 177,7 ksv x 104 - 3 terpė). Didžiausias NOM skaičius rastas 5, 6, 7 terpėse (nuo 244, 2 - 5 terpė iki 322,9 ksv x 104 - 6 terpė). Skirtumas tarp NOM mažiausio ir didžiausio skaičiaus, rasto mitybinėse terpėse, yra didžiulis (33,2 ksv x 104 - 4 terpė ir 322,9 ksv x 104 - 6 terpė). Jis sudaro beveik 970 % (9,7 karto). Šį skirtumą galima paaiškinti tuo, kad 4 terpės jonų santykis nėra subalansuotas. 4 terpėje daugiau fosforo (P) nei azoto (N). 6 terpėje N:P santykis yra normalus, atitinka NOM ląstelėse esantį N:P santykį. NOM ląstelėse azoto randama nuo 10 iki 12 %, (bakterinėse ląstelėse 12 %, mikromicetų 10 %). Fosforo kiekis NOM sausoje biomasėje siekia 1,5 %. Tokiu būdu N:P = 10-12 : 1,5. Tokio šių pagrindinių mitybos elementų santykio nėra 2,4,8, 12 terpėse (3 pavyzdys); 3, 9, 10, 11, 13 terpėse (4 pavyzdys). Daugelyje aptariamųjų terpių 2, 4, 12 (3 pavyzdys); 1, 3, 9, 13 (4 pavyzdys); 5, 6 (5 pavyzdys) naudojamos amonio druskos. Autoklavuojant šias terpes, kai pH esti žemiau 7, dalis amoniako išgaruoja, ir terpės azoto deficitas dar labiau padidėja.
[0009] Terpėse, išskyrus 2 terpę, nėra mikroelementų Zn, Mn, Cu, Co, J, B, Mo. Šie mikroelementai esti NOM oksidacinių-redukcinių fermentų sudėtyje, vadinami kofaktoriais, ir terpėje reikalingi.
[0010] Terpėse (išskyrus 4 terpę, kai panaudojamas tik vienas vitaminas - tiaminas) nėra vitaminų. Tokie vitaminai kaip tiaminas (B1), riboflavinas (B2), pantoteno rūgštis (B5), nikotino rūgštis (PP), piridoksinas (B6) įeina į NOM fermentų sudėtį, sudaro jų sudėtinę dalį - kofermentus, ir turi būti naudojami.
[0011] Nei vienoje (iš 13) terpėje nepanaudoti kompleksiniai organiniai junginiai, sudarantys su metalų katijonais kompleksinius junginius. Mikroelementų iškritimo į nuosėdas išvengiama tuo atveju, kai juos sujungiama į ciklinius kompleksinius junginius vadinamus chelatus (žnyplinius junginius). Ypač svarbu išsaugoti terpėje geležį (Fe). Ji įeina į daugelį NOM fermentų (kofaktorių) sudėtį. Šiam reikalui naudojami kompleksus sudarantys junginiai:
[0012] EDODA - etilendinitril-N,N'-bis(2'-oksifenil)-N,N'-diacto rūgštis; DCTA diaminocikloheksano - N,N-tetracetatas; NTA - nitriltriacetatas; polifosfatas - [PnO3n+l](n+2), kur n ≈ 5; SSR - 5-sulfosalicilo rūgštis ir EDTA - etilendiamintetraacto rūgštis.
[0013] Aptariamose terpėse naudojamos (kaip anglies šaltinis) didelės naftos produktų (angliavandenilių mišinys, benzinas, mazutas, nafta) koncentracijos. Dažniausiai jos siekia 10,0 ml/l (3, 4, 5 pavyzdžiai), kai kuriose terpėse (2, 4) net 50,0 ml/l, ir tik vienintelėje 3-oje Bushnell-Haas terpėje (žiūrėti - sud. Jankevičius K., Liužinas R., Aplinkos biologinis valymas, V. 2003, p. 123) panaudota 0,5 ml/l angliavandenilių. Naftos produktai NOM taip pat, kaip ir kitus mikroorganizmus bei makroorganizmus, dalinai apnuodija (inhibuoja).
[0014] Naftą oksiduojančius mikroorganizmus (NOM) skirstomi i dvi grupes - hidrofilinius ir lipofilinius mikroorganizmus. Dvifazėje sistemoje vanduo - angliavandeniliai (nafta ar jos produktai), hidrofiliniai mikroorganizmai telkiasi vandens, o lipofiliniai - angliavandenilių (naftos) fazėje. Hidrofiliniai mikroorganizmai skaido tik tuos naftos junginius, kurie ištirpę vandenyje, lipofiliniai - vystosi pačioje naftoje, jos plėvelėje, naftai yra atsparūs. Gamtinėmis sąlygomis vyrauja hidrofiliniai NOM, lipofiliniai NOM mažiau išplitę, priklauso Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia, Arthrobacter, Rhodococcus gentims. Naftos bei jos produktų slopinamąjį poveikį NOM hidrofilams matome palyginę mikroorganizmų, išaugusių 3 ir 13 terpėse (4 pavyzdys). Terpės savo sudėtimi yra vienodos, skiriasi tik naftos produkto kiekis jose (3 terpėje - 0,5 g/l, o 13-oje - 100 g/l). 3-oje terpėje NOM skaičius yra didesnis (177,7 ksv x 104) nei 13-oje (160,0 ksv x 104). Kur kas išsamiau NOM augimo priklausomybė nuo naftos produkto ir jo koncentracijos parodyta specialiu tyrimu (6 pavyzdys). Didžiausias NOM skaičius nustatytas terpėse (6 ir 13 terpės), kai anglies šaltiniu naudojama nafta. Geriausiai NOM vystosi, esant mažiausiai naftos produkto koncentracijai (6-je terpėje, esant 5 g/l naftos produkto NOM skaičius siekia 129,7 ksv x 104, o esant 50 g/l naftos produkto NOM skaičius - tik 27,8 ksv x 104, taigi naftos produkto kiekį terpėje padidinus 10 kartų, NOM skaičius terpėje sumažėja 4,7 karto). Tokią pat NOM skaičiaus kaitą stebima, naudojant 13-ąją terpę. NOM skaičius, padidinus naftos kiekį terpėje nuo 5,0 g/l iki 50,0 g/l, sumažėja 7,3 karto. Ši dėsninga NOM skaičiaus kaita priklausomai nuo naftos ar jos produktų kiekio terpėje matoma anglies šaltiniu naudojant dyzeliną ir mazutą (6 pavyzdys).
[0015] Šie duomenys yra svarbūs ne tik analizuojant 1-13 mitybines terpes, bet ir valant naftos produktais užterštą gruntą ex situ sąlygomis. Valomas gruntas, siekiant sudaryti palankesnes NOM fermentinei veiklai sąlygas, turi būti maišomas su jau išvalytu gruntu taip, kad valomajame grunte naftos produktų (pvz., mazuto) kiekis neviršytų 30,0 g/kg grunto. Tokio grunto biovalymas vidutinio klimato sąlygomis (Lietuvoje) užtrunka apie 90-100 parų (užtenka vieno vegetacinio periodo).
[0016] Artimiausia iš 13-os NOM auginimui naudojamų terpių, kaip prototipas, pasirinkta Bushnell-Haas terpė (jos sudėtis pateikta 4 pavyzdyje). Joje gerai auga naftą oksiduojančios bakterijos, mieliagrybiai ir mikromicetai. Tai parodyta specialiu bandymu (7 pavyzdys).
[0017] Šios terpės trūkumas yra tas, kad joje nepanaudotas molibdenas (Mo), kuris svarbus NOM mitybai. Taip pat nepanaudoti mikroelementai Zn, Mn, Cu, Co ir kt., vitamininės medžiagos (tiaminas, riboflavinas, pantoteno rūgštis ir kt.), įeinančios į NOM oksidazių-reduktazių ir kitų fermentų sudėtį. Terpėje nėra kompleksonų, kurie sudaro su metalų katijonais kompleksinius junginius ir neleidžia jiems iškristi į nuosėdas.
[0018] Išradimo uždavinys - pagerinti nafta bei jos produktais užterštoje aplinkoje NOM kiekiui nustatyti vartojamų terpių sudėtį, parengti NOM augimui tinkamesnę, nei iki šiol naudojamos, mitybinę terpę, kai aerobinėmis sąlygomis išauginama didesnis NOM skaičius, tiksliau parodantis aplinkos (grunto, vandens) taršos naftos produktais lygį.
[0019] Uždavinys išsprendžiamas panaudojant NOM augimui būtinus elementus ir biologiškai aktyvias medžiagas, įeinančias į NOM fermentų, skaidančių naftą ir jos produktus, sudėtį.
[0020] Naftą oksiduojančių mikroorganizmų terpės gavimui į ją įneša naftos produktus, pagrindinius biogeninius mitybos elementus, mikroorganizmus kultivuoja aerobinėmis sąlygomis esant palankiam temperatūros režimui, taip pat į terpę įdeda neapdorotą naftą ir karbohidratus kaip anglies šaltinį, subalansuoja anglies, azoto, fosforo, kalio tarpusavio kiekius, įterpia mikroelementus, vitaminus, kompleksonus, svarbius naftą skaidančių mikroorganizmų veiklai intensyvinti.
[0021] Siūlomoje terpėje greta naftos produktų kaip anglies šaltinį naudoja naftą 1,0-5,0 ml/l ir sacharozę 2,0-10,0 g/l, o tam, kad būtų sudarytas buferinis tirpalas, palaikantis terpės vandenilio jonų koncentraciją pH lygią 7, fosforo šaltiniu naudoja KH2PO4 0,9-1,0 g/l ir K2HPO4 0,4-0,5 g/l, be to palaiko optimalų terpės C:N:P:K santykį, atitinkantį mikroorganizmų ląstelės elementų sudėtį, kuris sudaro 100:5-7:1:1.
[0022] Į terpė įveda cinko (Zn), mangano (Mn), jodo (J), boro (B), molibdeno (Mo) mikroelementus, kiekvieno 0,004-0,005 g/l koncentracijos ir vario (Cu), kobalto (Co) mikroelementus, kiekvieno maždaug 0,001 g/l koncentracijos.
[0023] Be minėtų mikroelementų į terpę įdeda vitaminus, tokius kaip tiaminą (B1), riboflaviną (B2), pantoteno rūgštį (B5), nikotino rūgštį (PP), piridoksiną (B6), kiekvieno jų ne daugiau kaip 0,2 mg/l, o naftą oksiduojančių mikroorganizmų grupes, platų jų spektrą, kultivuoja agarizuotoje terpėje 23-26°C temperatūroje, geriau 25-26°C temperatūroje.
[0024] Taip paruoštoje terpėje ir esant subalansuotiems anglies, azoto, fosforo, kalio tarpusavio kiekiams įterpus mikroelementus, vitaminus, kompleksonus, svarbius naftą skaidančių mikroorganizmų veiklai intensyvinti ir palaikant optimalia terpės temperatūra, užtikrinamas NOM gyvybingumas, geras vystymasis ir intensyvus dauginimasis, o tuo pačiu ir pasiekiamas tikslas - aerobinėmis sąlygomis išauginama didesnis NOM skaičius.
[0025] NOM augimui būtinus elementus skirstomi į 3 grupes. Jas sudaro augimui būtini elementai - be pagrindinių C, H, O, N, P, K, S, Mg, reikalingi Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn elementai; mažesnio poreikio elementai - B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo, Sn, J; ir elementai, kurių poreikis visai menkas - Be, F, Se, Ti, Ga, Ge, Br, Zr, W.
[0026] NOM naudoja įvairias azoto (N) formas - organinį ir neorganinį azotą. Kai kurios aminorūgštys veikia kaip augino faktoriai. Asparagino rūgštis ir alaninas įjungiamas į bakterijų ląstelių sieneles. Formuojamoje terpėje naudojamas nitratas (NaNO3), o aminorūgščių šaltiniu - sojos miltai.
[0027] Fosforas (P) NOM terpėje naudojamas neorganinių fosfatų pavidalu (glicerofosfatas bei fosfolipidai beveik nenaudojami). Naudojamas KH2PO4 ir K2HPO4, kas leidžia terpės pH išlaikyti neutralioje (pH - 7) būklėje.
[0028] Kalis (K) susijęs su ribonukleino rūgščių gamyba. Jo poreikis priklauso nuo terpės pH. Kai pH sumažėja nuo 7 iki 6 (terpė parūgštėja), tuomet K kiekis ląstelėse padidėja 30 %.
[0029] Magnis (Mg) svarbus NOM augimui. Kai jo trūksta, sumažėja NOM augimo intensyvumas. Mg į terpę įvedamas MgSO4 pavidalu. Siera (S) NOM naudojama aminorūgščių cisteino ir metionino sintezei, o taip pat kai kurių vitaminų (tiamino, biotino) gamybai.
[0030] NOM augimui reikalingi mikroelementai (įeina į fermentų sudėtį) Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Mo, J, B ir vitaminai - tiaminas (B1), riboflavinas (B2), pantoteno rūgštis (B5), nikotino rūgštis (PP), piridoksinas (B6) (dalyvauja kofermentų sudėtyje). Šios biologiškai aktyvios medžiagos terpėje panaudojamos. Jų kiekis terpėje nustatomas remiantis NOM sausoje biomasėje esama šių junginių koncentracija.
[0031] Sudarytoje terpėje, siekiant išvengti Fe nuostolių, naudojamas kompleksonas EDTA - etilendiamintetraacto rūgštis, kuri sudaro kompleksinius junginius su mikroelementais ir taip pašalina jų iškritimą ir nusėdimą. Kompleksono į terpę įdeda maždaug 0,15 g/l.
[0032] Siūloma naftą oksiduojančių mikroorganizmų terpė apima naftos produktus, pagrindinius biogeninius mitybos elementus, azotą, fosforą, kalį, magnį, kalcį, ir jos turinį sudaro: nafta - 1,0-5,0 ml/l, sacharozė (arba melasa) - 2,0-10,0 g/l, sojos miltai - 5,0 g/l, alaus misa - maždaug 5,0 ml/l; makroelementai druskų pavidalu: NaNO3 - 3,0 g/l, KH2PO4 - 0,9-1,0 g/l, K2HPO4 - 0,4-0,5 g/l, MgSO4 x 7H2O - 0,5 g/l, CaCl2 x 6H2O - 0,1 g/l, FeSO4 x 7H2O - 0,02 g/l; mikroelementai druskų pavidalu: ZnSO4 x 6H2O, MnSO4 x 4H2O, KJ, H3BO4, (NH4)6Mo7O24 x 7H2O, kiekvieno jų ne daugiau kaip po 0,005 g/l; CuSO4 x 5H2O, CoCl2 x 6H2O, kiekvieno jų ne daugiau kaip po 0,001 g/l; vitaminai: tiaminas (B1), riboflavinas (B2), pantoteno rūgštis (B5), nikotino rūgštis (PP), piridoksinas (B6), kiekvieno jų ne daugiau kaip po 0,2 mg/l; kompleksonas EDTA (etilendiamintetraacto rūgštis) - maždaug 0,15 g/l ir vanduo iki 1000 ml.
[0033] Tokios sukurtos kompozicijos NOM mitybinė terpė (jos sudėtis pateikiama 7 pavyzdyje) užtikrina naftą oksiduojančių mikroorganizmų (įvairių bakterijų, mieliagrybių, mikromicetų rūšių), pasižyminčių skirtingomis fiziologinėmis-biocheminėmis savybėmis, gerą vystymąsi ir yra tinkamas taršos naftos produktais indikatorius.
[0034] Naujai sukurtai naftą oksiduojančių mikroorganizmų (NOM) terpei išradimo autorių kolektyvas nusprendė suteikti pavadinimą "Liužino-GVT terpė".
[0035] Didelis siūlomos Liužino-GVT terpės privalumas bei pranašumas, o kartu ir išradimo esmė yra ta, kad ją sudarančiais veiksniais (C:N:P:K santykis, atitinkamos koncentracijos 7 mikroelementų, 5 vitaminų panaudojimas, kompleksono EDTA įvedimas į terpę, pH reguliavimas) užtikrinamas terpės stabilumas. Ją sudarantys ingredientai, jų kiekiai ir tarpusavio sąveika pilnai atitinka įvairius NOM fiziologinių grupių mitybinius reikalavimus.
[0036] 1 pavyzdys.Naftą oksiduojančių mikroorganizmų (NOM) mitybinių terpių privalumų, identifikuojant NOM, vertinimas
[0037] Eksperimentiškai vertinamos Čapeko ir Raimondo terpės.
[0038]
[0039] Identifikuojant NOM, terpėse sacharozė (kaip anglies šaltinis) pakeista mazutu 10,0 g/litrui.
[0040] Naudotos agarizuotos terpės.
[0041] Naftą oksiduojančių mikroorganizmų (kultūrų, štamų) identifikavimo rezultatai:
[0042]
[0043] Išvada: Čapeko terpė-yra tinkamesnė NOM identifikavimui. Mikroorganizmai (eil. Nr. 5, 7, 8, 10) augo tik kontrolėje be naftos angliavandenilių.
[0044] 2 pavyzdys.Naftą oksiduojančių mikroorganizmų (NOM) mitybinių terpių, naudojamų NOM identifikuoti, palyginimas
[0045] Panaudotos 3 skirtingos sudėties mitybinės terpės:
[0046]
[0047] Naftą oksiduojančių mikroorganizmų identifikuojant rezultatai.
[0048]
[0049] Tyrimo rezultatai parodė, kad naudojant Čapeko ir Jamados terpes išskirtas negausus NOM kultūrų skaičius. Kur kas gausesnis NOM (mikromicetų ir bakterijų) kultūrų skaičius išskirtas kaupiamajam metodui naudota terpe.
[0050] 3 pavyzdys.Mikroorganizmų, išaugusių 2, 4, 8 ir 12 terpėje (sudėtis nurodoma), skaičius (ksv x 104).
[0051] 2. Mineralinė druskų terpė bakterijoms (Appl. Environm. Microbiol. 1982,43), g/l:
[0052]
[0053] Mikroelementų druskos pavidalu tirpalas, g/100 ml: FeSO4 x 7H2O - 0,1; ZnSO4 x 7H2O - 0,88; CuSO4 x 5H2O - 0,04; MnSO4 x 4H2O - 0,015; Na2B4O7 - 0,01; (NH4)6MoO2 x 4H2O - 0,005.
[0054]
[0055]
[0056]
[0057] 12. Jamados terpė grybams (Aplinkos biologinis valymas, Mikroorganizmų atranka ir panaudojimas, V., 2003), g/l:
[0058] KH2PO4-2,5
[0059] NH4NO3-5,0
[0060] MgSO4 x 7H2O - 1,0
[0061] Mazutas - 10,0
[0062]
[0063] 4 pavyzdys.Mikroorganizmų, išaugusių 1, 3, 9,10,11, 13 terpėje (sudėtis nurodoma), skaičius (ksv x 104)
[0064]
[0065]
[0066] 11. Grybams (Soil sampling and methods of analyses, London, Tokyo, 1993), g/l:
[0067] Čapeko terpė be sacharozės, naftos produktų - 1 %.
[0068] 13. Bushnell-Haas terpė (nuo terpės Nr. 3 skiriasi angliavandenilio kiekiu), g/l:
[0069] Bushnell-Haas Broth (Difco),
[0070] Pridedama l0 % naftos produkto.
[0071] Gaminama distiliuotame vandenyje (1000 ml).
[0072] MgSO4 x 7H2O 0,2
[0073] K2HPO4 1,0
[0074] KH2PO4 1,0
[0075] FeCl3 0,05
[0076] NH4NO3 1,0
[0077] CaCl2 0,02
[0078] Nustatomas pH 7-7.2, rūgštinant su HCl arba šarminant su NaOH ir autoklavuojama 15 min.
[0079]
[0080] 5 pavyzdys.Mikroorganizmų, išaugusių 5, 6, 7 terpėje (sudėtis nurodoma) skaičius (ksv x 104)
[0081] 5. Mielės (Methody eksperimentaljnoj mikologii, spravočnik, Kiev, 1982), g/l:
[0082] (NH4)2HPO4 3,5
[0083] K2HPO4 0,5
[0084] KH2PO4 0,5
[0085] MgSO4 x 7H2O 0,5
[0086] NaCl 0,5
[0087] Benzino ar kito naftos produkto 10,0
[0088] pH 6,5
[0089] 6. Mielėms (Soil sampling and methods of analyses, London, Tokyo, 1993), g/l:
[0090] (NH4)2SO4 5,0
[0091] K2HPO4 0,15
[0092] KH2PO4 0,85
[0093] MgSO4 x 7H2O 0,5
[0094] NaCl 0,1
[0095] CaCl2 0,1
[0096] Mazuto 10,0
[0097] 7. Mielėms (Biodegradation of crude oil in sando sediment, International biodeteration, vol. 44, 1999), g/l:
[0098] Mielių azotinis pagrindas (Difco) 6,7
[0099] Mazutas 10
[0100]
[0101] 6 pavyzdys.Naftą oksiduojančių mikroorganizmų (NOM), skaičius (ksv x 104), išskirtas ant dviejų mitybinių terpių, naudojant skirtingus angliavandenilius ir skirtingas jų koncentracijas
[0102]
[0103] Pastaba: n/s - nepavyko suskaičiuoti dėl didelio paviršinio mazuto kiekio.
[0104] NOM (suminis - bakterijos+mielės+mikromicetai), skaičius (ksv x 104), 6 ir 13 terpėje, kai panaudota skirtingi naftos produktai ir skirtingos jų koncentracijos:
[0105]
[0106] 7 pavyzdys.Naftą oksiduojančių mikroorganizmų (NOM) siūloma naujos sudėties Liužino-GVT terpė:
[0107] makroelementai druskų pavidalu, g/l:
[0108] NaNO3 3,0
[0109] KH2PO4 1,0
[0110] K2HPO4 0,5
[0111] MgSO4 x 7H2O 0,5
[0112] CaCl2 x 6H2O 0,1
[0113] FeSO4 x 7H2O 0,02
[0114] Mikroelementai druskų pavidalu, g/l:
[0115] ZnSO4 x 6H2O 0,005
[0116] MnSO4 x 4H2O 0,005
[0117] KJ 0,005
[0118] H3BO4 0,005
[0119] (NH4)6Mo7O24 x 7H2O 0,005
[0120] CuSO4 x 5H2O 0,001
[0121] CoCl2 x 6H2O 0,001
[0122] vitaminai, mg/l:
[0123] tiaminas (B1) 0,2
[0124] riboflavinas (B2) 0,2
[0125] pantoteno rūgštis (B5) 0,2
[0126] nikotino rūgštis (PP) 0,2
[0127] piridoksinas (B6) 0,2
[0128] EDTA (etilendiamintetraaceto rūgštis) 0,15 g/l
[0129] Alaus misa 5,0 ml/l
[0130] Nafta (arba dyzelinas) 1,0-5,0 ml/l
[0131] Sojos miltai 5,0 g/l
[0132] Sacharozė (arba melasa) 2,0-10,0 g/l
[0133] Vanduo 1000 ml
[0134] Terpės tinkamumui įvertinti sudaryti tokie 4 variantai (terpėje panaudota 1,0 ml/l nattos ir sacharozės 2,0 g/l):
[0135] A. Pilna sterili terpė,
[0136] B. Pilna nesterili terpė,
[0137] C. Vietoje vitaminų į terpę dedama tik 5,0 ml alaus misos; ir
[0138] D. Terpė be vitaminų, sojos miltų, sacharozės, paliekant alaus misos 5,0 ml/l.
[0139] Kontroliniu variantu (prototipas) panaudota stabili, plačiai naudojama Bushnell-Haas terpė (jos sudėtis parodyta 4 pavyzdyje, tik šiame bandyme vietoje 0,5 g/l angliavandenilių - terpė Nr. 3 bei 10 % naftos produktų - terpė Nr. 13, į šią tyrimo terpę įterpta 1,0 ml/l naftos).
[0140] Naftą oksiduojančių mikroorganizmų skaičius (ksv x 104), išskirtas iš naftos produktais užteršto grunto ant naujosios universalios mitybinės terpės ir nurodytų variantų.
[0141] Rezultatai pateikiami lentelėje:
[0142]
[0143] Gauti rezultatai rodo, kad naujoji terpė beveik 3 kartus yra efektyvesnė nei kontrolinė Bushnell-Haas terpė. Kai terpėje sumažinamas karbohidratų, kaip anglies šaltinio (sojos miltai, sacharozė) kiekis bei terpėje nėra vitaminų, jos efektyvumas smarkiai sumažėja (D variantas) ir prilygsta kontrolei.
[0144] Atlikti bandymai akivaizdžiai parodo, kad tokios sukurtos kompozicijos NOM mitybinė terpė (jos sudėtis pateikiama 7 pavyzdyje) užtikrina naftą oksiduojančių mikroorganizmų (įvairių bakterijų, mieliagrybių, mikromicetų rūšių), pasižyminčių skirtingomis fiziologinėmis-biocheminėmis savybėmis, gerą vystymąsi ir yra tinkamas taršos naftos produktais indikatorius.
[0145] Didelis siūlomos Liužino-GVT terpės privalumas bei pranašumas, kad ją sudarančiais veiksniais (C:N:P:K santykis, atitinkamos koncentracijos 7 mikroelementų, 5 vitaminų panaudojimas, kompleksono EDTA įvedimas į terpę, pH reguliavimas) užtikrinamas terpės stabilumas. Ją sudarantys ingredientai, jų kiekiai ir tarpusavio sąveika pilnai atitinka įvairius NOM fiziologinių grupių mitybinius reikalavimus ir gali būti efektyviai naudojama aplinkos užterštumo nafta ir jos produktais lygiui įvertinti, naftą oksiduojančių mikroorganizmų atrankai, naujų naftos telkinių paieškai.
1. Naftą oksiduojančių mikroorganizmų terpės gavimo būdas, kai į ją įneša naftos produktus, pagrindinius biogeninius mitybos elementus, mikroorganizmus kultivuoja aerobinėmis sąlygomis esant palankiam temperatūros režimui, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad į terpę įdeda naftą ir karbohidratus kaip anglies šaltinį, subalansuoja anglies, azoto, fosforo, kalio tarpusavio kiekius, įterpia mikroelementus, vitaminus, kompleksonus, svarbius naftą skaidančių mikroorganizmų veiklai intensyvinti.
2. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad kaip anglies šaltinį naudoja naftą 1,0-5,0 ml/l ir sacharozę 2,0-10,0 g/l,
3. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad sudaryti buferiniam tirpalui, palaikančiam terpės vandenilio jonų koncentraciją pH lygią 7, fosforo šaltiniu naudoja KH2PO4 0,9-1,0 g/l ir K2HPO4 0,4-0,5 g/l.
4. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad palaiko optimalų terpės C:N:P:K santykį, atitinkantį mikroorganizmų ląstelės elementų sudėtį, kuris sudaro 100:5-7:1:1.
5. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad į terpę įveda cinko (Zn), mangano (Mn), jodo (J), boro (B), molibdeno (Mo) mikroelementus, kiekvieno 0,004-0,005 g/l koncentracijos ir vario (Cu), kobalto (Co) mikroelementus, kiekvieno maždaug 0,001 g/l koncentracijos.
6. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad į terpę įdeda vitaminus, tokius kaip tiaminą (B l), ribof1aviną (B2), pantoteno rūgštį (B5), nikotino rūgštį (PP), piridoksiną (B6), kiekvieno jų ne daugiau kaip 0,2 mg/l.
7. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad į terpę įterpia kompleksoną EDTA maždaug 0,15 g/l, kuris sudaro kompleksinius junginius su mikroelementais ir taip pašalina jų iškritimą ir nusėdimą.
8. Būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad naftą oksiduojančių mikroorganizmų grupes, platus jų spektras, kultivuoja agarizuotoje terpėje 23-26°C temperatūroje, geriau 25-26°C temperatūroje.
9. Naftą oksiduojančių mikroorganizmų terpė, apimanti naftos produktus, pagrindinius biogeninius mitybos elementus, azotą, fosforą, kalį, magnį, kalcį, b e s i s k i r i a n t i tuo, kad Liužino-GVT terpės turinį sudaro: nafta - 1,0-5,0 ml/l, sacharozė (arba melasa) - 2,0-10,0 g/l, sojos miltai - 5,0 g/l, alaus misa -maždaug 5,0 ml/l, makroelementai druskų pavidalu: NaNO3- 3,0 g/l, KH2PO4- 0,9-1,0 g/l, K2HPO4 - 0,4-0,5 g/l, MgSO4 x 7H2O - 0,5 g/l, CaCl2 x 6H2O - 0,1 g/l, FeSO4 x 7H2O - 0,02 g/l; mikroelementai druskų pavidalu: ZnSO4 x 6H2O, MnSO4 x 4H2O, KJ, H3BO4, (NH4)6Mo7O24 x 7H2O, kiekvieno jų ne daugiau kaip po 0,005 g/l; CuSO4 x 5H2O, CoCl2 x 6H2O, kiekvieno jų ne daugiau kaip po 0,001 g/l; vitaminai: tiaminas (B1), riboflavinas (B2), pantoteno rūgštis (B5), nikotino rūgštis (PP), piridoksinas (B6), kiekvieno jų ne daugiau kaip po 0,2 mg/l; kompleksonas EDTA (etilendiamintetraacto rūgštis) - maždaug 0,15 g/l ir vanduo iki 1000 ml.