[LT] Išradime aprašyta kompozicijos, būdai ir rinkinys, susiję su nauja fermentų šeima, kurie pirmenybiškai rišasi prie hidroksimetilinto citozino arba gliukozilinto hidroksimetilinto citozino ir skaldo dvigrandę DNR nustatytame atstume nuo atpažinimo vietos 3' galo, gaunant suskaldytus fragmentus su 1-3 bazių lipniais galais.
[EN] Compositions, methods and a kit are described relating to a novel family of enzymes which preferentially binds to a hydroxymethylated cytosine or a glucosylated hydroxymethylated cytosine and cleave double-stranded DNA at a defined distance 3' of a recognition site to produce a cleavage fragment with a 1-3 base overhang.
[0001] TECHNIKOS LYGIS
[0002] Pastaruoju metu buvo manoma, kad 5-hidroksimetilcitozinas (hmC) vaidina vaidmenį žinduolių genų ekspresijoje, ypatingai embrioninių kamieninių ląstelių ir neuronų ląstelių vystimesi kaip tarpinė pakopa demetilinimo procese. (Tahiliani et al., Science 324 (5929); 930-5 (2009); Kriaucionis and Heinz, Science 324 (5929): 929-30 (2009)). Aprašyta TET fermentų šeima, kuri katalizuoja 5-metilinto citozino (mC) konversiją į hmC (WO 2010/037001). Hidroksimetilinimo aptikimas patvirtino sunkumus. Cheminiai būdai, dažniausiai natrio bisulfito sekvenavimas naudotas aptikti mC, neatskyrė mC ir hmC (Cokus et al., Nature 452: 215-219 (2008). PCT publikacija WO 2010/037001 aprašo antikūnų, kurie tiesiogiai rišasi prie hmC, panaudojimą. Produktas, kuris apima endonukleazių mišinius, leidžia aptikti hmC subtrakcijos būdu (EpiMarkTM, New England Biolabs, Inc. (NEB) ir PCT/US10/46632). Šis produktas naudoja T4 β-gliukoziltransferazę (BGT) gliukozilinti hmC, kuris tada yra atsparus endonukleazės skėlimui, leidžiančiam diferencijuotis nuo mC. Būtų pageidautina išplėtoti paprastus greitus ir tiesioginius metodus aptikti ir išanalizuoti hmC buvimą polinukleotido sekos kontekste, kuris papildomai įgalina atskirti hemi-hmC nuo simetrinio hmC taip, kad tiksliai identifikuotų citoziną (C), kuris yra hidroksimetilintas.
[0003] IŠRADIMO ESMĖ
[0004] Išradimo įgyvendinime siūlomas preparatas, kuris apima: vieną arba daugiau išgrynintų rekombinantinių baltymų, kuriame baltymai yra ZZYZ baltymų šeimos nariai; ir reakcijos buferį. Išradimo įgyvendinime, kiekvienas ZZYZ baltymų šeimos narys turi katalitinį domeną ir surišimo domeną. Įgyvendinime, surišimo domenas DNR-je pirmenybiškai rišasi prie hmC ir gliukozilinto hidroksimetilinto citozino (ghmC). Įgyvendinime, katalitinis domenas skelia DNR nustatytu atstumu (3') nuo hmC arba ghmC. Nustatytas atstumas dar gali būti charakterizuotas kaip 11-13 nukloeotidai grandinėje, turinčioje hmC arba ghmC ir 9-10 nukloeotidai komplementarioje grandinėje (3'). Kiekvienas ZZYZ baltymų šeimos narys dar gali būti charakterizuotas modifikuoto nukleotido atpažinimu, parinktu iš hmC arba ghmC DNR-je taip, kad ghmC arba hmC su mC skilimo santykis yra mažiausiai 8:1.
[0005] Išradimo įgyvendinime, kiekvienas ZZYZ baltymų šeimos narys turi N-galinį domeną, apimantį aminorūgščių seką su mažiausiai 95 % aminorūgščių sekos homologija su RX7KX2EXYX18QQX11-16DLX2PX6EXDEX2HX6-26DX2RX3I (SEQ ID NO:14). Kitame įgyvendinime, kiekvienas ZZYZ baltymų šeimos narys turi C-galinį domeną, apimantį aminorūgščių seką su mažiausiai 95 % aminorūgščių sekos homologija su WXNX30-40AX12-13FXGX16-18R (SEQ ID NO:15) C-galiniame domene. Dar kitame įgyvendinime, mažiausiai vienas narys apima aminorūgščių seką RX7KX2EXYX18QQX11-16DLX2PX6EXDEX2HX6-26DX2RX3I (SEQ ID NO:14). Dar kitame įgyvendinime, mažiausiai vienas išgrynintas baltymas turi aminorūgščių seką su mažiausiai 95 % sekos homologija su SEQ ID NO: 7. Kitame įgyvendinime, mažiausiai vienas išgrynintas baltymas turi aminorūgščių seką, apimančią mažiausiai 95 % sekos homologija su fermentu, parinktu iš PvuRts1I, PpeHI, EsaSS310P, EsaRBORFBP, PatTI, YkrI, EsaNI, SpeAI, BbiDI, PfrCORF1I80P, PcoORF314P, BmeDI, AbaSDFI, AbaCI, AbaAI, AbaSI, AbaUMB3ORFAP ir Asp6ORFAP. Kitame įgyvendinime, mažiausiai vienas iš išgrynintų baltymų parinktas iš grupės, susidedančios iš: PvuRts1I, PpeHI, EsaSS310P, EsaRBORFBP, PatTI, YkrI, EsaNI, SpeAI, BbiDI, PfrCORF1I80P, PcoORF314P, BmeDI, AbaSDFI, AbaCI, AbaAI, AbaSI, AbaUMB3ORFAP ir Asp6ORFAP ir katalikiškai aktyvių mutantų ir jų darinių.
[0006] Išradimo įgyvendinime, buferis preparate gali apimti druską, turinčią anijoną, parinktą iš sulfato, fosfato, acetato arba citrato. Kitame įgyvendinime, buferis neturi chlorido, nitrato, karbonato arba imidazolo druskos. Druskos koncentracija gali būti 50-500 mM srityje.
[0007] Išradimo įgyvendinime, būdas siūlo hmC aptikimą genominiame DNR mėginyje. Būdas apima pridėjimą preparato, kaip anksčiau aprašyta, į genominės DNR mėginį; leidimą baltymui skelti genominę DNR skilimo saite; nustatymą DNR sekos bent jau vienoje skilimo saito pusėje; pasirinktinai, DNR sekos kartografavimą ant referencinės genominės DNR sekos; ir hmC aptikimą. Preparatas, naudojamas būde, gali apimti: vieną arba daugiau DNR polimerazių, pradmenų ir adaptorių.
[0008] Dar kitame įgyvendinime, būdas apima skilusios genominės DNR amplifikavimą prieš nustatant DNR seką. Aukščiau minėtuose būdo įgyvendinimuose, genominė DNR gali pirma sureaguoti su β-gliukoziltransferaze (BGT) arba pažymėta BGT arba BGT dariniu prieš sumaišant reakcijos inde genominę DNR su aukščiau apibūdintu preparatu. Įgyvendinime, būdas gali būti įvykdytas viename reakcijos inde arba mikrofluidiniame įtaise.
[0009] Papildomame išradimo įgyvendinime, siūlomas būdas išgryninti ZZYZ šeimos baltymą, kuris apima: klonavimą ir ekspresavimą sulieto baltymo, apimančio ZZYZ šeimos baltymą, inteiną ir afiniškai surišantį baltymą, pailiustruotą chitiną surišančiu domenu (CGD), maltozę surišančiu domenu (MBP) arba bet kuriuo tinkamu baltymu, galinčiu pririšti prie matricos; priversti sulietam baltymui prisijungti prie matricos afiniškai surišančio baltymo priemonėmis; atskelti ZZYZ šeimos baltymą nuo inteino; ir išgryninto baltymo regeneravimą eliuate. Viename įgyvendinime, afiniškai surišantis baltymas yra chitiną surišantis domenas.
[0010] Išradimo įgyvendinime, siūlomas fragmentų rinkinys, kuris apima mažiausiai vieną iš a) oligonukleotidų fragmentų, turinčių 20-23 nukleotidų dydį su patalpintu centre hmC arba ghmC; arba b) didelės DNR arba oligonukleotidų fragmentų, turinčių hmC arba ghmC, patalpintų DNR dvigubos spiralės vienguboje grandinėje 11-13 nukleotidų lokacijoje nuo grandinės 3' galo.
[0011] Išradimo įgyvendinime, siūlomas rinkinys, kuris apima: vieną arba daugiau išgrynintų ZZYZ baltymų šeimos rekombinantinių baltymų, jų funkcinių darinių arba jų katalitinių fragmentų efektyviame buferyje, sudarančiame galimybę fermento aktyvumui; ir naudojimo instrukciją. Rinkinys dar gali turėti BGT ir UDP-gliukozę. Rinkinys dar gali turėti pradmenų. Rinkinys dar gali turėti adaptorių, skirtų panaudoti sekvenavimo platformose.
[0012] TRUMPAS BRĖŽINIŲ FIGŪRŲ APRAŠYMAS
[0013] Fig. 1 parodo pavyzdinio fermento iš ZZYZ šeimos išgrynintą produktą ant 10-20 % denatūruoto poliakrilamido gelio. 1 juosta yra dydžio žymuo. 2 juosta yra PvuRts1I, 3 juosta – PpeHI, 4 juosta – AbaSDFI, 5 juosta – PatTI, 6 juosta – EsaNI ir 7 juosta –YkrI.
[0014] Fig. 2 parodo DNR substrato (SEQ ID NO:1) seką, naudojamą 3-5 figūrose. Substratas pagamintas polimerazinės grandininės reakcijos (PGR) amplifikacija taip, kad kiekvienas citozinas buvo arba nemodifikuotas arba pakeistas per mC, hmC arba ghmC. mCs ir hmCs buvo įjungti į substratą PGR metu, to tarpu ghmC buvo gliukoziltransferazės reakcijos su hmCs produktas substrate. Pradmens seka tarp fragmento citozino neturi. Išorinis MfeI saitas buvo sukonstruotas į PGR seką tam, kad kontroliuotų gliukozilinimo statusą.
[0015] Fig. 3-5 parodo reakcijos produktą tarp pavyzdinių fermentų ZZYZ šeimoje 2-kartinio serijinio praskiedimo ir substrato iš Fig. 2, kurioje visi Cs yra nemodifikuoti, visi Cs pakeisti į mCs, visi Cs pakeisti į ghmCs (βghmCs) ir visi Cs pakeisti į hmCs. Pirma ir paskutinė juostos turi PGR žymenį. Juostos tarp žymenų parodo atskiro fermento du-kartinį serijinį praskiedimą. Reakcijos sąlygos buvo 23ºC, 20 min NEB4 buferyje (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA (NEB)) su galutine KOAc 250 mM koncentracija.
[0016] Fig. 3 parodo PvuRts1I rezultatus, kur santykis hmC:ghmC:mC:C = 2000:2000:8:1. Fermento kiekis pirmoje juostoje, gretimoje kairės pusės žymeniui, yra 33 µg.
[0017] Fig. 4 parodo PpeHI rezultatus, kur santykis hmC:ghmC:mC:C = 128:256:2:1. Fermento kiekis pirmoje juostoje, gretimoje kairės pusės žymeniui, yra 123 µg.
[0018] Fig. 5 parodo AbaSDFI rezultatus, kur santykis hmC:ghmC:mC:C = 500:8000:1:ND (neaptiktas). Fermento kiekis pirmoje juostoje, gretimoje kairės pusės žymeniui, yra 52 µg.
[0019] Fig. 6A ir 6B parodo, kad ZZYZ fermentų šeima skelia pilnai hidroksimetilintus oligosubstatus.
[0020] Fig. 6A parodo išgryninto rekombinantinio PpeHI aktyvumą 56 bazių porų sintetinio nukleotido substrate, turinčiame AhmCGT. 1 juosta: tik DNR, 2-8 juostos: fermento 2-gubą praskiedimą. Reakcijos buvo inkubuotos 37ºC temperatūroje 1 valandai ir atskirtos 20 % TBE poliakrilamido gelyje.
[0021] Fig. 6B parodo schematinį oligonukleotido substrato skaldymo vaizdą, rodantį skėlimo produktus. PpeHI skelia bet kurioje atpažinimo saito (parodyta strėlėmis) pusėje, kad sukurtų 20 bazių porų fragmentą.
[0022] Fig. 7 parodo ZZYZ fermentų aktyvumą simetriškai hidroksimetilintuose oligonukleotiduose ir hemi-hidroksimetilintuose oligonukleotiduose. Gelis parodo rezultatus naudojant PpeHI. Skaldymo produktai buvo analizuoti 20 % poliakrilamido denatūruotame gelyje su 7M karbamidu. Sunumeruotos juostos gelyje atitinka skėlimo vaizdams, parodytiems piešiniu dešinėje gelio pusėje. Pavyzdžiui, 1 juosta atitinka skėlimo vaizdui, gautam iš hmCG/GhmC viršutinėje ir apatinėje grandinėse tik su pažymėta viršutine grandine.
[0023] Fig. 8A-B parodo ZZYZ šeimos fermentų skėlimo saitus kaip atskirai nustatytus dvigubos grandinės DNR kiekvienai grandinei, turinčiai vienoje grandinėje hmC arba ghmC.
[0024] Fig. 8A parodo skėlimo produktą dviguboje grandinėje, komplementarios grandinei, turinčiai hmC, atitinkančiai 3 ir 4 juostoms gelyje. Naudojamų oligonukleotidų sekos yra parodytos gretimai geliui. Gelis yra toks pat kaip parodytas Fig. 7. Sintetiniai oligonukleotidų žymenys (M1, M5 ir M2, M3) siūlo gidą skėlimo saitų aptikimui. Oligonukleotidų substratai ir sintetiniai žymenys buvo pažymėti FAM fluorescuojančia grupe ir atskirti denatūruoto 20 % poliakrilamido gelyje su 7M karbamidu. Skėlimo fragmentai atitinka M2 ir M3 (3 juosta) ir M1 ir M5 (4 juosta) ir pažymėti oligonukleotido sekoje (SEQ ID NO:2), sekančioje geliui.
[0025] Fig. 8B parodo skėlimo produktą dviguboje grandinėje, turinčioje ghmC. Substratas (R2), turintis parodytas sekas (SEQ ID NO:3 ir 4), kiekviename gale (*) buvo pažymėtas su alfa-33P dATP. Žymenys (M1 ir M2) pažymėti su gama-33P ATP naudojant polinukleotidkinazę.
[0026] Fig. 8C parodo, kad ZZYZ baltymas skelia DNR, turinčią ghmC arba hmC tame pačiame 3' atstume nuo modifikuoto nukleotido. Gliukozilinimas neveikia skėlimo atstumo. Reakcijoje buvo naudojami skirtingi substratų rinkiniai, arba su hmC (1 ir 3 juostos) arba su ghmC (2 ir 4 juostos). Fluorescentiniai žymenys (FAM) Figūroje parodyti kaip užpildyti apskritimai. Laukiamos skėlimo vietos pažymėtos linijomis. Čia buvo naudotas fermentas AbaSDFI. Lyginant 3 ir 4 juostas, gali būti padaryta išvada, kad skėlimo atstumai modifikacijų dviejų tipų priešingose grandinėse yra tokie pat.
[0027] Fig. 9 parodo hmC vietų identifikavimo būdą žiurkių smegenyse genominėje DNR. Genominė DNR buvo paveikta su T4 BGT, kad gliukozilintų bet kuriuos hmCs ir po to skaldoma ZZYZ fermentu (pvz. AbaSDFI). Skaldyti produktai buvo liguoti su sintetiniu dvigubos grandinės oligonukleotido adaptoriumi, kaip pailiustruota. Ligatabilus galas turi 2 bp degeneruotų nukleotidų. Liguoti fragmentai buvo atrinkti pagal dydį nuo maždaug 1 kb-3 kb. Šie buvo PGR amplifikuoti naudojant įprastą pradmenį, specifinį adapteriui. Po to amplifikuoti PCR produktai gali būti klonuoti į įprastą klonavimo vektorių ir sekvenuoti, kad nustatytų, kuris iš gretimų citozinų yra hidroksimetilintas.
[0028] Fig. 10 parodo klonuotų fragmentų iš žiurkių smegenų genominės DNR, gautos pagal Fig. 9, pavyzdinę logo seką. Visi klonuoti fragmentai atitiko pavyzdiniam žiurkės genomui. Skaldymo saito 40 bp langai kairėje ir dešinėje buvo išekstrahuoti ir įvertinti, kaip pailiustruota Figūroje.
[0029] Fig. 11 aprašo didelio našumo sekvenavimo protokolą, kad nustatytų, kuris iš citozinų, gretimuose CpG motyvuose yra hidroksimetilinti ir tarnauja kaip substratas ZZYZ šeimos narių skėlmui. (A): DNR fragmento laisvieji galai apklausai yra užblokuoti. Skėlimas įvyksta saite, esančiame tarp dviejų identifikuotų citozinų su ZZYZ fermentu, besibaigiančiu 1-3 baze lipniame gale. (B): Lipnus DNR galas pašalinamas DNR fragmento buku galu. (C): Žinomos sekos adapteris yra liguotas prie abiejų skėlimo fragmentų bukų galų, kur adapteris turi nemodifikuotą CC/GG viename gale ir žymenį X - kitame. Neliguotas adapteris pašalinamas sukinio kolonėle. (D): Adapteris, liguotas DNR, yra skeliamas antrą kartą su ZZYZ fermentu, kad išlaisvintų adapterį, liekantį už CC kaip lipnusis galas nuo fragmento, turinčio hmC. Fragmentas, kuris turi nemodifikuotą citoziną, yra neskeliamas. Yra naudojama sukinio kolonėlė, kad pašalintų skeltą adapteri. (E): Antrasis adapteris pridedamas skelti fragmentą su CC lipniu galu. Antras adapteris turi Y žymenį. Citozinas, kuris yra modifikuotas, gali būti nustatytas iš sekvenavimo fragmento su Y žymeniu. Nemodifikuotas citozinas gali būti patvirtintas sekvenuojant fragmentą su X žymeniu. (F): Nesuskaldytas fragmentas sekvenuojamas transkripcijos kryptimi nuo hmC (5-hmC) saitų. (G): hemi-hmC (5-hmC) yra kartografuotas ant referencinio genomo.
[0030] Fig. 12 parodo sekvenavimo schemos pavyzdį hidroksimetilomos dekodavimui. Genominė DNR yra pirmiausiai paveikiama su BGT, o po to skaldoma su ZZYZ šeimos fermentu (pvz. AbaSDFI). Atskiri adapteriai, arba su 2-degeneruotos bazės 3' lipniu galu arba su 3-degeneruotos bazės 3' lipniu galu, tada yra liguojami prie suskaldytų produktų. DNR adapteris turi žymę (tokią kaip biotinas), kad palengvintų gryninimą transkripcijos kryptimi. Liguota DNR yra sukarpoma į mažesnius fragmentus. Šie fragmentai su adapteriais, liguotais prie galų, yra ištempiami naudojant avidino rutuliukus. Po to fragmentai liguojami su antru sekvenuojančiu adapteriu. Liguoti produktai yra PGR-amplifikuoti naudojant sekvenavimui specifinius pradmenis.
[0031] Fig. 13 parodo Promals'o (Pei, Grishin, Bioinformatics, 23(7):802-808 (2007)) naujos fermentų šeimos narių pirminę struktūros sulyginamąją analizę, čia identifikuotą kaip ZZYZ šeimą (SEQ ID NO: 5-13). Parodyti devyni šeimos nariai, kur kiekvienas fermentas turi hmC arba ghmC pirmenybinį skėlimo aktyvumą, palyginus su mC arba nemodifikuotu citozinu dvigrandėje DNR (dsDNR).
[0032] Fig. 14 parodo, kad PvuRts1I gali išskirti DNRs su hmC skirtingais lygiais skirtingose ląstelėse. Čia hmC lygiai embrioninėse kamieninėse ląstelėse buvo sulyginti su fibroblastais. E-14 genominė DNR buvo suskaldyta į lipnią klampią medžiagą, tuo tarpu kai NIH3T3 DNR buvo suskaldyta tik truputį, patvirtinant žymų hemi-metilinto hmC buvimą E-14 ląstelėse ir žymiai mažesnius bet kurio hmC lygius fibroblastuose.
[0033] DETALUS ĮGYVENDINIMŲ APRAŠYMAS
[0034] Čia aprašyti fermentų šeimos unikalūs požymiai yra jų rišamosios savybės ir specifinis skėlimas, kuris pirmiausiai siūlo tiesioginį fermentinį būdą aptikti hmC genome, apimant hemi-hidroksimetilintuoses saituose, kiekybiškai ir sekų kontekste.
[0035] Čia aprašyti naujai apibrėžtų ZZYZ šeimos fermentai yra ypatingo dėmesio dėl priežasčių, kurios apima jų gebėjimą atskirti hmC (taip pat ir ghmC) liekanas nuo mCs arba nemetilinto citozino, kad gautų DNR fragmentų rinkinį, kur skėlimas įvyksta pagrindinai fiksuoto atstumo transkripcijos kryptimi nuo fermento atpažinimo saito DNR-je. Fragmentų narių dydis fragmentų rinkinyje, atsiradusių iš skėlimo su ZZYZ fermentais, gali būti pilnai heterogeninis. Kai DNR turi hemi-hmC arba hemi-ghmC, dviguba grandinė trūksta tik ant modifikuoto nukleotido vienos pusės(3'), kad generuotų kintamo ilgio dsDNR fragmentus. dsDNR fragmentai bus generuojami 20-23 nukleotidų dydžio, kai hmC arba ghmC yra simetriškai išsidėstę CpG saituose.
[0036] Tam tikri terminai aprašyti žemiau.
[0037] "Didelė DNR" skirtas nurodyti bet kuriai natūralios kilmės arba sintetinei DNR, turinčiai dydį, didesnį negu 100 nukleotidų iki genomo dydžio.
[0038] "Panašus dydis" su nuoroda į fragmentų "rinkinys" skirtas nurodyti fragmentams, kurie kinta ne daugiau negu apie ± 5 nukleotidai pagal ilgį.
[0039] "Patalpintas centre" skirtas nurodyti modifikuoto nukleotido atitikimui lokacijai vienoje grandinėje, kuri yra apytiksliai centruota dsDNR fragmento toje pačioje grandinėje. Lokacija pagrindinai yra tarp 5 centre nustatytų nukleotidų skaičiuojant nukleotidus nuo fragmento bet kurio galo.
[0040] "N-galinis domenas" nurodo į sritį, ištęstą iki baltymo aminorūgščių sekos apie 50 %. "C-galinis domenas" nurodo į sritį, ištęstą iki baltymo aminorūgščių sekos apie 50 %.
[0041] "Matrica" skirtas įjungti bet kurią struktūrą, turinčią paviršių, tinkamą imobilizuoti molekulę, kuri turi giminingumą matricai ir apima, pavyzdžiui, granules (rutuliukus), kolonėles, plokščius paviršius, tokius kaip popierius arba stiklas, viso paviršiaus vidus arba tuščia forma, ir t.t.
[0042] "Fragmentų rinkinys" gaunamas skeliant didelę dsDNR su ZZYZ šeimos fermento nariu. Fragmentų rinkinys apima dvigubos grandinės oligonukleotidus, kurie yra didelės DNR skėlimo produktas simetrinėje hmC arba ghmC (hmCG/GhmC) abiejose pusėse ir kintamo dydžio fragmentus, kuriuose hemi-hmC arba hemi-ghmC yra išsidėstęs fiksuotoje padėtyje nuo skaldymo saito (pvz., 9-13 nukleotidai). Jeigu genomas, kuris susideda iš daugybinių didelių DNR (pvz., chromosomų), yra suskaldytas, tai kiekviena didelė DNR turės duoti daug fragmentų rinkinių. Fragmentų mišinys, gautas iš viso žmogaus genomo, gali būti laikomas kaip daugybė fragmentų rinkinių, kai kiekvienas rinkinys išvestas iš chromosomos arba kaip fragmentų vienas rinkinys, priklausomai nuo konteksto. Įgyvendinime, fragmentų rinkinys apima mažiausiai 6 nukleotidų fragmentus su skirtingomis DNR sekomis. Pavyzdžiui, nukleotidų rinkinys gali apimti mažiausiai 10 fragmentų su skirtingomis sekomis arba mažiausiai 20 fragmentų su skirtingomis sekomis. Viename įgyvendinime, nukleotidų rinkinys apima vieną arba daugiau panašaus dydžio fragmentų su centre patalpintu hmC arba ghmC.
[0043] "Fermento preparatas" skirtas nurodyti reagentui ir niekam kitam, kilusiam jo natūralioje būsenoje in vivo.
[0044] "X", kai naudojamas aminorūgščių sekoje, reiškia bet kurią aminorūgštį.
[0045] Čia identifikuota DNR skelianti nauja šeima kaip ZZYZ šeima, kur šeimos nariai pirmenybiškai atpažįsta hmC ir ghmC ir nemetilintą (mC) arba nemodifikuotus citozinus dsDR-je ir po to skelia DNR neatstikitiniame atstume transkripcijos kryptimi (3' krytimi) nuo hmC arba ghmC nukleotido kiekvienoje DNR grandinėje, kuri turi hmC arba ghmC. Šios šeimos nariai apima, bet yra neapriboti bakterinių restrikcijos endonukleazių.
[0046] Šeimos nariai gali būti apibūdinti struktūriškai skirtingu skėlimo domenu ir surišimo domenu ir ypatingai N-galiniu konservatyviu domenu su didesniu negu 85 % aminorūgščių sekos homologiškumu, pavyzdžiui, didesniu negu 90 % aminorūgščių sekos homologiškumu, pavyzdžiui, didesniu negu 98 % aminorūgščių sekos homologiškumu su RX7KX2EXYX18QQX11-16DLX2PX6EXDEX2HX6-26DX2RX3I (SEQ ID NO:14) N-galiniame domene, ir/arba daugiau negu 85 % arba 90 % arba 98 % aminorūgščių sekos homologiškumu su WXNX30-40AX12-13FXGX16-18R (SEQ ID NO:15) C-galiniame domene. Viename įgyvendinime, baltymas (pailiustruotas per AbaSDFI) su RX7KX2EXYX18QQX11-16DLX2PX6EXDEX2HX26DX2RX3I (SEQ ID NO:16) su N-galine seka, turi didelį selektyvumo laipsnį tarp ghmC/hmC/ ir mC.
[0047] ZZYZ šeimos nariai (pavyzdžiui, žiūr. Fig. 13) apima rekombinantinius baltymus, variantus ir darinius. Variantų pavyzdžiai apima mutantus, kuriuose, pavyzdžiui, katalitinis domenas buvo modifikuotas arba pašalintas iš baltymo ir liko tik DNR surišantis domenas, skirtas hmC ir ghmC. Variantų papildomi pavyzdžiai yra sulieti baltymai. Šie sulieti baltymai gali tarnauti kaip reagentai arba gali būti tarpiniai junginiai fermentų gryninime arba hidroksimetilintų nukleotidų kartografijoje.
[0048] Sulietų baltymų variantai ZZYZ baltymų šeimoje gali būti sulieti su antru baltymu arba daugybe baltymų, kurie tarnauja kaip žymė, žymelė arba žymuo vizualizacijai in situ baltymui, prijungtam prie hmC arba ghmC arba afininiam gryninimui. Sulietų partnerių pavyzdžiai apima inteinus (JAV patentas Nr. 5643758), maltozę surišančius baltymus (MBPs) (JAV patentas Nrr. 5643758 ir 7825218; ir PCT publikacija WO 2010/114532), SNAP-TAG® (JAV publikacija Nr. US-2004-0115130) arba gali turėti pakaitą, kuris veikia kaip žymė, pavyzdžiui, pakeičiant cisteiną į selenocisteiną (žiūr. JAV patentas Nr. 7141366). Alternatyviai, sulietas baltymas gali apimti nukleorūgšties aptamerą žymėjimui arba gryninimui (pavyzdžiui, žiūr. JAV patentus 5670637; 5696249; 5874557; 5693502).
[0049] Šeimos nariai dalijasi vienas su kitu mažiausiai 30 % aminorūgščių sekos identiškumu, pavyzdžiui mažiausiai 40 %, pavyzdžiui mažiausiai 50 %, pavyzdžiui mažiausiai 60 %, pavyzdžiui mažiausiai 70 %, pavyzdžiui mažiausiai 80 %, pavyzdžiui mažiausiai 90 %, arba mažiausiai 95 % aminorūgščių sekos tapatumo kaip pareikšta Promals'o pirminės struktūros sulyginamojoje analizėje (Pei, Grishin, Bioinformatics, 23(7):802-808 (2007)) ir apima PvuRts1I, PpeHI, AbaSDF1, EsaSS310P, EsaRBORFBP, PatTI, YkrI, EsaNI, SpeAI, BbiDI, PfrCORF1I80P, PcoORF314P ir BmeD1, kai kurie iš jų aprašyti 1 lentelėje ir Fig. 13. Pavyzdžiui, vienas šeimos narys yra AbaSDF1, kur variantai AbaCI (GenBankas:ACQB1000053), AbaI (GenBankas: ABXK01000045), AbaSI (GenBankas: NC_009085), AbaUMB3ORFAP (GenBankas: AEPM01000006) ir Asp6ORFAP (GenBankas: ACYS1000207) dalijasi mažiausiai 95 % sekos tapatumu su AbaSDF1. Šie fermentai neįtraukti į 1 lentelę. Jų savybės yra iš esmės tokios pat kaip ir AbaSDFI. Nuoroda į šeimos atskirus narius yra skirtas apimti jo darinius ir katalikiškai aktyvius fragmentus.
[0050] Antikūnai gali būti pakelti iki ZZYZ fermentų šeimos narių naudojant standartines technikas, skirtas sukurti monokloninius arba poliklonininius antikūnus arba antikūnų fragmentus. Šie antikūnai arba jų fragmentai gali būti panaudoti ZZYZ fermento šeimos nario in situ žymėjimui, prijungtam prie hidroksimetilintos arba gliukozilintos hidroksimetilintos didelės DNR.
[0051] Vienas ZZYZ fermentų šeimos narys yra PvuRts1I. Ši restrikcijos endonukleazė pirmiausia buvo aprašyta Ishaq, Kaji (Biological Chemistry 255(9):4040-4047 (1980)) ir parodyta, kad ji yra hmC-specifinė restrikcijos endonukleazė, koduota plazmide Rts1. PvuRts1I genas buvo klonuotas ir ekspresuotas (Janosi and Kaji, FASEB J. 6:A216 (1992); Janosi et al., Journal of Molecular Biology 242: 45-61 (1994)) ir Rts1 plazmidė buvo pilnai sekvenuota (Murata et al., Journal of Molecular Biology 184 (12):3194-202 (2002)).
[0052] Tačiau nėra atlikta šio fermento gilesnės studijos arba publikacijos. Be to, po pirmųjų publikacijų, šiuo fermentu buvo menkai domimasi. Tai ryškiausiai buvo atsispindėta PCT publikacijoje WO 2010/037001, kuri turėjo skyrių apie hmC ir ghmC aptikimo būdus, bet nebuvo jokių užuominų apie šį fermentą. WO 2010/037001 aprašo būdus, kurie yra cheminės prigimties arba apima baltymų, tokių kaip antikūnai, surišimą. Kur fermentai yra paminėti, tai tokie iliustruoti išimtinai gliukoziltransferazėmis.
[0053] Tam, kad būtų ištirtos šios šeimos savybės kaip specifinės, reikėjo fermentus išgryninti. Po rūpestingų analizių ir išplėstinių eksperimentų atrasta, kad daug įprastai gryninimui naudojamų joninių reagentų, tokių kaip NaCl, fermentus išaktyvuoja. Dar atrasta, kad skirtingų tipų druskų ir jų koncentracijų panaudojimas paveikia aktyvumą. Rasta, kad ZZYZ fermentų šeima buvo išaktyvuota dalyvaujant druskoms, tokioms kaip chloridai, nitratai, karbonatai arba imidazolo druskos. Todėl buvo padaryta išvada, kad šių druskų reikia vengti. Pasirodė, kad kitos druskos, tokios kaip sulfatai, fosfatai, acetatai ir citratai aiškiai slopina fermentų aktyvumą esant didelėms koncentracijoms ir todėl geriau fermentus laikyti arba naudoti 50-500 mM koncentracijų ribose.
[0054] Kitas svarbus svarstymas buvo fermentus skiriančios savybės hmC nuo mC ir C. Nuo tada, kai nustatyta, kad genome hmC pasitaiko labai retai, maži skėlimo lygiai prie mC arba C galėtų išplaukti į didelę genetinę apsuptį, kuri paveiktų galimybę aptikti hmC.
[0055] ZZYZ šeimos narių gryninimas sudarytų galimybę fermentų šeimos skėlimo savybių studijai. Pirminės pastangos išgryninti gamtinį arba rekombinantinį PvuRts1I buvo problematinės, nes visos standartinės kolonėlės, naudojamos gryninimui, vedė į žymų fermento aktyvumo praradimą. Rekombinantinis PvuRts1I buvo gautas kaip sulietas baltymas su 6xHis žymele PvuRts1I N-gale, turėjo fermento labai didėjančio skėlimo aktyvumo ant nemodifikuoto substrato nepageidautiną efektą, kas sumažino fermento pritaikymą aptikti hmC tiesiogiai. C-galinės 6xHis žymelės pridėjimas nepakeitė santykinio aktyvumo skirtingų metilinimo statusų ant kiekvieno substrato, bet fermento specifinis aktyvumas buvo ženkliai sumažintas.
[0056] Rekombinantinis PvuRts1I buvo taip pat sulietas su intein-CBD (IMPACTTM rinkiniu, NEB), kuris po to buvo skeliamas, kad atpalaiduotų gryną fermentą. Šiuo keliu galėjo būti gauta aktyvaus fermento didelė išeiga (žiūr. 1 pavyzdį).
[0057] Rekombinantinis baltymas arba vienas, modifikuotas arba sulietas su žyme gali būti pažymėtas vaizdo gavimo tikslais panaudojant spektroskopinį žymėjimą, tokį kaip fluorescentinį arba chemiliuminescentinį žymėjimą, radioaktyvųjį žymėjimą arba kitą reakcingą cheminį agentą, arba žymėtą cukrų, žymėtą antikūną arba kitą žymėtą baltymo žymę (apimant pavyzdžiui SNAP-TAG®, NEB) (taip pat žiūr. Chung-Xiao Song et al., Nature Biotechnology 29:68-72 (2011)).
[0058] Tyrimo taikymas, parodytas Fig. 3-5, fermentų koncentracijų nustatymui, prie kurių atsiranda maksimalus ghmC- ir hmC-specifinis skėlimas ir aptiktas minimalus mC ir C skėlimas įgalino identifikuoti ZZYZ šeimos narių skėlimo savybes. Rezultatai, gauti iš specifinių analizių (pavyzdžiui, žiūr. 1 lentelę) parodė, kad šios šeimos nariai pateikė žymiai pagerintą ir paprastesnį būdą specifiniam hmC nustatymui ir kartografavimui DNR-je.
[0059] Efektyvesnei hmC analizei genome, reagentų požymiai apima reagentų atskyrimų savybes hmC ir/arba ghmC nuo mC ir C. Taigi, buvo nustatyti santykiai fermento skėlimo specifiškumui. Santykių pavyzdžiai skirtingiems fermentams ZZYZ šeimoje pateikti 1 lentelėje.
[0060] Rasta, kad išgryninti fermentai ZZYZ šeimoje turi hmC arba ghmC:mC minimalų skėlimo santykį mažiausiai 8:1, pavyzdžiui, 50:1, pavyzdžiui, mažiausiai 100:1, pavyzdžiui mažiausiai 200:1 arba pavyzdžiui mažiausiai 250:1; ir hmC arba ghmC:C minimalų skaldymo santykį mažiausiai 50:1, pavyzdžiui, mažiausiai 100:1, pavyzdžiui mažiausiai 200:1 arba pavyzdžiui mažiausiai 250:1. Šie santykiai gali būti nustatyti pagal tiriamąjį pavyzdį, aprašytą 1 pavyzdyje ir Fig. 3-5.
[0061] Tiriamojo pavyzdžio konsistencijos pagerinimui, PGR DNRs buvo naudoti kaip substratas vietoje fago T4 ir λDNR, hmC-, mC- ir C-, turintys DNR substratus buvo gauti simetrinių oligonukleotidų, gautų komerciškai, PCR būdu (Integruotos DNR technologijos (IDT), Coralville, IA), kuriame hidroksimetilintas deoksicitidino trifosfatas (hmdCTP) arba metilintas deoksicitidino trifosfatas (mdCTP) buvo pakeistas į dCTP kaip aprašyta. hmC PGR fragmentas toliau buvo gliukozilintas naudojant BGT, kad taptų ghmC PGR DNR fragmentu. Šio tyrimo rezultatai parodė, pavyzdžiui, kad PvuRts1I turi hmC:ghmC:5-mC:C=2000:2000:8:1 aktyvumo santykį; PpeHI jis yra 12:250:2:1; AbaSDFI jis yra 500:8000:1:ND. ND čia reiškia, kad skėlimas nestebimas net prie didžiausių fermento koncentracijų.
[0062] ZZYX šeimos narių požymis yra tas, kad tikslus hmC arba ghmC skėlimo saitas gali kisti 3' transkripcijos kryptimi nuo hmC arba ghmC ne daugiau kaip 5 nukleotidais, pavyzdžiui, ne daugiau kaip 3 nukleotidais. Pavyzdžiui, naudojant sintetinius substratus (žiūr., pavyzdžiui, 3 pavyzdį ir Fig. 6-8) parodyta, kad nors ZZYX šeimos nariai daugiausia skėlė dsDNR viename nustatytame atstume nuo hmC arba ghmC, skėlimo saitas gali būti stebimas 11-13 nukleotidų atstumu nuo hmC arba ghmC vienoje grandinėje ir 9-10 nukleotidų atstumu nuo hmC arba ghmC priešingoje grandinėje (ghmCN11-13/N9-10). Apie 20-23 bp skėlimo fragmentas atsiranda iš skėlimo simetriniame hmC saite (hmCG/GhmC) dviejų grandinių DNR.
[0063] Įvairovės įvertinimas dėl skėlimo atstumo ZZYZ fermentų šeimos pagalba yra svarbus hmC bazių lokacijos kartografavimui genome. Fig. 8C taip pat atskleista, kad ghmC buvimas hmC vietoje neturi pastebimo efekto skėlimo atstumui. Atkreiptas dėmesys, vis dėlto, kad skėlimo aktyvumas gali būti padidintas, jeigu G yra fiksuotas prie 21-22 nukleotidų iš ZZYZ atpažinimo saito priešingoje vijoje, net jei čia nėra absoliutaus reikalavimo, skirto G šioje lokacijoje, net jei čia yra bet koks žymus arba net aptinkamas nukleotido nuokrypis tuojau pat flankuojantis ghmC arba hmC.
[0064] hmC arba ghmC lokacija didelėje DNR gali būti nustatyta klonuojant skėlimo produktus ir/arba sekvenuojant, pavyzdžiui, ultra didelio našumo sekvenavimo platformomis (žiūr. 7 pavyzdį). Naudojant ZZYZ šeimos narius, yra galimybė nustatyti ir kartografuoti hmC arba ghmC ir juos diferencijuoti iš mCs vienoje fermento reakcijoje. Kur du hemi-metilinti CpG saitai yra arti vienas kito, yra galimybė nustatyti, kuri iš 4 galimų pozicijų turi hmC (pavyzdžiui, Fig. 9-11).
[0065] ZZYZ fermentų šeimos narių panaudojimas generuoti fragmentų rinkinius hidroksimetilinimo genominei analizei arba kitiems tikslams, galima pasikliauti pavieniu fermentu arba galima įjungti fermentų gausybę, kur keli arba visi iš fermentų yra: ZZYZ šeimos nariai; kildinti iš ZZYZ šeimos narių; MspJI fermentų šeimos įjungti nariai (PCT publikacija WO2010/075375) ir/arba MmeI-kaip endonukleazių restrikcijos šeima; ir/arba endonukleazių restrikcijos kiti tipai.
[0066] Vienas iš požymių, kuris charakterizuoja ZZYZ baltymų šeimą yra surišimo domeno (C-galinio) ir katalitinio domeno buvimas. ZZYZ panašių fermentų surišimo domenas gali būti panaudotas abiems in vivo ir in vitro pritaikymams. Surišimo domeno panaudojimo pavyzdžiai apima: hmC turinčio DNR in vitro praturtinimą, pavyzdžiui, kaip reagentą afininiam gryninimui arba hmC in vitro taiknį. Pastarasis gali būti pasiektas pažymint surišimo domeną arba suliejant surišimo domeną su kitais domenais įvedant jį į hmC saitus genome. Surišimo domenas taip pat gali būti sulietas su nukleazės domenu, kad iššauktų dvigubos grandinės trūkius gretimuose hmC saituose, kad aktyvuotų DNR reparacijos kelią taip, kad šių saitų epigenetinis statusas galėtų būti pakeistas.
[0067] Epigenetinėms studijoms yra svarbus DNR pavyzdžių hidroksimetilinimo lygio nustatymas. Genomo epigenetinė reguliacija apima chromatino remodeliavimą, kuris dalinai liečia mC konvertavimą į hmC. Skirtumai hidroksimetilinimo modeliuose gali būti lemiamas indikatorius netinkamų vystimosi procesų, pavyzdžiui, embrioninėms kamieninėms ląstelėms. Dabar šie skirtumai gali būti tiriami įprastu būdu panaudojant fermentus iš ZZYZ baltymų šeimos, kuri selektyviai nukreipia taikinį į hmC ir ghmC. Šios nukleotido modifikacijos tada gali būti kartografuotos ant metilomos arba genomo.
[0068] PCT paraiška PCT/US2010/046632, kuri čia įtraukta visa apimtimi, toliau detaliau aiškina apie kartografavimo reikšmę hidroksimetilintų nukleotidų genome, kad būtų suprastas ląstelės šeimininkės ir organizmo fenotipas. ZZYZ šeima viena arba kartu su kitais fermentais (pavyzdžiui, MspJI šeimos nariu arba MspI arba fermentų, funkciškai giminingų MspI) gali būti panaudota pateikti metilomą arba hidroksimetilomą kartu panaudojant sekvenavimo techniką, aprašytą čia arba kitas sekvenavimo technikas, žinomas iš technikos lygio.
[0069] Fragmentų rinkinys(iai), gautas(ti) iš fermentų skaldymo su vienu arba daugiau fermentų iš ZZYZ šeimos ir pasirinktinai kitų DNR skėlimo fermentų, kurie skelia modifikuotus nukleotidus, gali būti sekvenuojami panaudojant didelio našumo įvairių rūšių sekvenavimo būdus, kurie šiuo metu prieinami naudojant, pavyzdžiui, NextGen sekvenavimo metodus, kad identifikuotų ir kartografuotų hmCs arba ghmCs DNR-je. Specifinių skaldymo produktų parinkimas, kurie genome hibridizuoja tam tikrus regionus, gali būti panaudoti greitiems diagnostikos būdams, atskleidžiantiems nenormalų hmCs arba ghmCs buvimą arba nebuvimą, koreliuojantį su liga, tokia kaip vėžys. Individo konkretaus fenotipo nustatymui gali būti panaudoti specifiniai oligonukleotidai. Pavyzdžiui, fragmentų rinkinio hibridizacija apibrėžtai sekai arba sekų rinkiniui, esančioms ant kieto paviršiaus (hibridizacijos nustatymas) arba pažymėtoms tirpale (arba visa versa) gali atskleisti skirtumus tarp fragmentų rinkinyje ir standartinių fragmentų rinkinių, kurie charakterizuoja metilomą. qPGR arba hibridizacijos nustatymas taip pat gali būti panaudoti detaliai ištirti vieną arba daugiau žinomų tiriamų lokacijų kopijavimui. hmCs arba ghmC arba surišimo domenas gali būti pažymėti fluorescentine arba chemiliuminescentine žyme arba kitais žymėjimo būdais, žinomais technikos lygyje, kad palengvintų aptikimą.
[0070] ZZYZ fermentų šeimos narių gryninimas ir jų skaldymo specifiškumo charakterizavimas ir jų gebėjimas atskirti hemi-hmC nuo simetrinio hmC pirmiausiai pateikia duomenų generacijos tipą, kuris reikalingas tyrime, medicininėje diagnostikoje ir gydyme, kad būtų suprasta hidroksimetilintos DNR rolė ir prasmė bet kuriam specialiam fenotipui.
[0071] Medicininių sąlygų detalus aprašymas pateiktas PCT publikacijoje WO2010/037001, kuri čia įtraukta kaip nuoroda visa apimtimi. Kiekvienu atveju, kur TET baltymai yra įtraukti į genų ekspresiją, bus būtina nustatyti, kur hmC, kuri yra sukurta TET baltymų, yra lokalizuota, ir tokiu būdu bus pageidautina panaudoti ZZYZ šeimą, čia aprašytą.
[0072] 1 Lentelė: ZZYZ baltymų šeimos narių pavyzdžiai
[0073]
[0074] Pateikti eksperimentų protokolai nenumatyti, kad būtų apribojami. Bet kuris, patyręs šioje srityje, galėtų panaudoti eksperimentinį planą kaip pasiūlymą bet kuriam naujai nustatytos šeimos papildomam nariui.
[0075] Visos čia cituojamos nuorodos, įskaitant JAV atskirtas paraiškas 61/376932, pateiktą 2010 metų rugpjūčio 25 dieną ir 61/296630, pateiktą 2010 metų sausio 20 dieną, yra įtrauktos kaip nuorodos.
[0076] PAVYZDŽIAI
[0077] 1 pavyzdys: ZZYZ baltymų gryninimas ir aktyvumo bei specifiškumo tyrimas
[0078] Pasirinktos sekos atpažįstamos BLAST paieškos sistema (Zhang et al., J. Comput. Biol. 7(1-2): 203-214 (2000)) ir tiriamasis yra ZZYZ šeimos narys, kuris gali būti ekspresuotas dabar žinomomis technikomis, pavyzdžiui in vitro transkripcija-transliacija (PURExpress®, NEB). Genas gali būti pasirinktinai kodono optimizuotas ir po to klonuotas kaip aprašyta žemiau PvuRts1I baltymui.
[0079] PvuRts1I buvo išgrynintas sekančiu būdu: A genas, koduojantis PvuRts1I, buvo įterptas į pTXB1 vektorių (NEB), klonuotas į ER2566 (T7 ekspresijos šeimininkas) ir augintas LB kultūroje su Ampicilinu (100 µg/ml) 30ºC temperatūroje 4×10 ml, kad gautų naktinę kultūrą. 4×10 ml naktinės kultūros buvo pasėtos į 2×1L LB su Ampicilinu (100 µg/ml). Po to 1L kultūros buvo augintas 30ºC temperatūroje 6 valandas, į kultūrą pridėtas IPTG iki galutinės 500 µM koncentracijos. Kultūra dar buvo inkubuota 16ºC temperatūroje per naktį. PvuRts1I buvo išgrynintas naudojant chitino granulių gravitacinę kolonėlę. Po to PvuRts1I buvo patalpintas į kolonėlę druskingame buferyje (10 mM tris-acetatas, 500 mM, KOAc, pH 8.0), kolonėlė buvo plaunama vėl druskingu buferiu. Druskingo buferio, turinčio 30 mM DTT, trys kolonėlės tūriai buvo panaudoti perpilti per kolonėlę. Kolonėlė buvo inkubuota 16 valandų 4ºC temperatūroje druskingame buferyje su DDT. Baltymas buvo eliuotas ir sukoncentruotas. Bendrai buvo gauta apie 10 mg PvuRts1I. Baltymas buvo pridėtas į 50 % glicerolį ir laikytas -20ºC temperatūroje tolimesniam gelio charakterizavimui. Kai 1 µg eliuanto nubėgo ant nuo 10 % iki 20 % poliakrilamido gelio, buvo aptiktos išgryninto fermento juostos, patvirtinančios fermentų grynumą (žiūr. Fig. 1). Šis būdas buvo taip pat pritaikytas išgryninti kitus ZZYZ šeimos narius, tokius kaip PpeHI, AbaSDFI, PatTI, EsaNI ir YkrI.
[0080] Išgryninto fermento substrato aktyvumui ir specifiškumui ištirti, sintetinis substratas buvo amplifikuotas panaudojant PGR kaip aprašyta Fig. 2. Citozinas, mC arba hmC buvo panaudoti PGR reakcijoje, kad gautų produktą su arba nemodifikuotu C, arba pilnai modifikuotu C. PGR produktas su hmC vėliau įvestas į reakciją su BGT ir UDP-gliukoze, kad konvertuotų hmC į ghmC.
[0081] Substrato specifiškumo ir aktyvumo analizės buvo atliktos sekančiai: buvo sudarytas reakcijos mišinys, kuris turėjo fermentą (3 µl, turintį 33-123 µg fermento), 3 µl kalio acetato (galutinė koncentracija 250 mM) ir NEB4 buferio (NEB), 50 ng DNR substrato, kuriame citozinas yra nepakeistas arba pakeistas į hmC, ghmC arba mC, ir pridėta 30 µl vandens iki galutinio reakcijos tūrio.
[0082] Fermentas buvo nuosekliai praskiestas ir pridėtas į reakcijos mišinį, kuris buvo inkubuotas 20 minučių kambario temperatūroje (23ºC) ir po to patalpintas į 1,8 % agarozės gelį. Reakcija buvo sustabdyta stop-reagentu, o rezultatai parodyti Fig. 3-5 ir susumuoti 1 lentelėje.
[0083] Skėlimo sritis 1 lentelėje parodo, kad hmC buvo atpažintas ir suskaldytas mažiausiai 50 kartų aktyviau negu citozinas ir daugiau negu 8 kartus už mC. Kas dėl AbaSDFI, tai jo santykinis skėlimo aktyvumas buvo 8000 kartų aktyvesnis ghmC atžvilgiu, negu hmC ir 500 kartų aktyvesnis hmC atžvilgiu, negu mC ir nebuvo aptiktas aktyvumas C atžvilgiu.
[0084] Priedui prie aktyvumo ir santykinio specifiškumo (greičių) tyrimo, ZZYZ šeimos nariams gali būti nustatyta disociacijos pusiausvyros konstanta (Kd). Atitinkamai, fermentų reakcijos greitis su skirtingai modifikuotais substrato oligonukleotidais gali būti nustatytas panaudojant gelio mobiliojo poslinkio tyrimus panaudojant mikrogrynas-EZ kolonėles (Millipore, Billerica, MA). Pavyzdžiui, žymėtų oligonukleotidų pastovūs kiekiai gali būti sumaišyti su fermento didėjančiais kiekiais neskėlimo sąlygose, pvz. be Mg2+, ir fermento-DNR mišinys analizuotas ant gamtinio poliakrilamido gelio, arba panaudojant sukinio kolonėles, kurios tik atpalaiduoja DNR oligonukleotidus (skėlimo produktus), kai fermentas yra prijungtas. Kd duomenys gali būti panaudoti įmirkymo eksperimentuose, kad įgytų kokristalus. Priedo, C-galinio domeno Kd , kuris tarnauja kaip surišimo modulis hidroksimetilintai bazei ir jo flankuojančios sekos substrate gali būti paprastai nustatytos.
[0085] 2 pavyzdys: Skėlimo lokacijos nustatymas substrate ZZYZ šeimos nariais
[0086] Patvirtinimui, kad ZZYZ baltymų šeima skelia dsDNR, pažinimo nukleotido 3' transkripcijos kryptimi fiksuotoje padėtyje, buvo sukurti sintetiniai nukleotidai, kurie buvo pažymėti vienoje grandinėje arba abiejose grandinėse, ir kurie turėjo simetrinius hmC arba ghmC nukleotidus arba buvo hemi-hidroksimetilinti kaip parodyta Fig. 7. Visi nukleotidai su fluorescentinėmis žymėmis buvo pagaminti panaudojant organinės sintezės standartines metodikas panaudojant hmC fosforamiditą (Glen Research, sterling,VA). dsDNRs buvo gautos leidžiant dviems oligonukleotidams aneliuoti į 10 µM tirpalą. Visi skaldymai buvo atlikti NEB4 buferyje (NEB). Kiekviename skaldyme 10 pmol substrato buvo inkubuota su 1 PpeHI vienetu 37ºC temperatūroje 1 valandai. Vienas vienetas yra apibrėžtas kaip fermento kiekis, reikalingas suskaldyti T4gt DNR 1 µg į stabilų mažų fragmentų vaizdą 37ºC temperatūroje 1 valandai. Tada 2 µl kiekvieno reakcijos mišinio buvo patalpinta į 20 % poliakrilamido gelį su 7M karbamido. Rezultatai yra parodyti Fig. 7. Strėlės rodos juostas, atitinkančias suskilusiems fragmentams, parodytiems gelio dešinėje. Rezultatai rodo, kad fermentai gali skelti atpažinimo sekos abiejose pusėse apytiksliai iš esmės fiksuotame atstume nuo atpažinimo saito.
[0087] 3 pavyzdys: Skėlimo atstumo nustatymas kiekvienoje dviguboje DNR grandinėje
[0088] Taip pat buvo nustatytas skėlimo atstumo specifiškumas. Pažymėti ir nepažymėti nukleotidai, turintys hmC, buvo susintetinti panaudojant organinės sintezės standartines metodikas kaip aprašyta 2 pavyzdyje. Oligonukleotido dydžio žymuo buvo taip susintetintas, kad nustatytų skėlimo saitus kaip parodyta Fig. 8A. 3 ir 4 juostos parodo, kad skėlimo saitai hmC turinčios grandinės komplementarioje grandinėje buvo 9-10 nt ant 3' pusės nuo hmC.
[0089] Kad būtų nustatyti skėlimo saitai hmC toje pačioje grandinėje, dsDNRs buvo sudaryti leidžiant oligonukleotidams, turintiems hmC, aneliuoti į oligonukleotidus, turinčius nemodifikuotą citoziną į 20 µM tirpalą. 40 µl aneliuotos DNR buvo paveikta su T4 BGT (NEB) pagal gamintojo protokolą. Po reakcijos DNR buvo išgryninta per QIAquick® nukleotido pašalinimo rinkinį (Quigen, Germantown, MD) ir eliuuota 30 µl tūryje. 3' žymėjimo reakcija atlikta panaudojant Taq polimerazę (NEB) dalyvaujant alfa-33P dATP pagal standartinius protokolus. Apie 10 pmol substrato buvo inkubuota su AbaSDFI 1 vienetu 4 buferyje 37ºC temperatūroje 1 valandai. 2 µl reakcijos turinio, kartu su žymenimis, buvo patalpinti į 20 % poliakrilamido gelį su 7M karbamido. Žymenys buvo pagaminti sintetiškai ir pažymėti su gama-33P ATP naudojant T4 polinukleotido kinazę (NEB). Gelis buvo išdžiovintas, eksponuotas į fosforo ekraną ir nuskenuotas. Rezultatai yra parodyti Fig. 8B. Fig. 8B skėlimo vietos gali būti išvestos, kad yra 12-13 nukleotidai nuo hmC toje pačioje grandinėje.
[0090] Nors specifiniai dydžio skėlimo fragmentai vyrauja FIg. 8A ir 8B, rasta, kad sekos kontekstas ir fermento koncentracija gali sukelti abejones dėl fermento skėlimo saito, tokias kaip skėlimo saitai gali kisti vienu arba dviem nukleotidais.
[0091] 4 Pavyzdys: Nustatymas, ar ghmC turi skirtingą ar tokį pat poveikį į hmC skėlimo vaizdus
[0092] Naudojant metodus, aprašytus aukščiau, buvo palygintas skėlimo specifiškumas saitams, modifikuotiems su hmC ir ghmC.
[0093] Visi nukleotidai su fluorescentiniais žymenimis ir hmC buvo gauti organinės sintezės būdu, kaip aprašyta aukščiau. hmC turintys substratai buvo konvertuoti į ghmC turinčius substratus naudojant T4 BGT (NEB) pagal gamintojo instrukcijas. Rezultatai Fig. 8C parodė, kad hmC turinti DNR 1 ir 3 juostose turi tokį pat skėlimo atstumo specifiškumą kaip ir ghmC 2 ir 4 juostose.
[0094] 5 Pavyzdys: hmC fragmentų klonavimas iš žiurkės smegenų genominės DNR
[0095] Buvo ištirtas ZZYZ fermentų naudingumas atskleidžiant hmC saitus žiurkės smegenų genominėje DNR. 1 µg žiurkės smegenų genominės DNR pradžioje buvo paveiktas su T4 BGT, kad hmC konvertuotų į ghmC. DNR po reakcijos buvo išsodinta ir buvo pajungta AbaSDFI skaldymui. Suskaldyti DNR produktai buvo vėl išgryninti ir pateikti ligavimo reakcijai su sintetiniu dsDNR adapteriu. Vienas adapterio galas turėjo 3' lipnų galą su dviem degeneruotomis bazėmis taip, kad ji galėjo liguoti skeltų produktų galus su 2-bazės 3'-lipniu galu. Tada liguoti produktai nupilti ant žemai besilydančios agarozės gelio ir parinktas dydis buvo nuo 1 kb iki 3 kb. Tada parinkto dydžio DNR PGR amplifikuota naudojant specifinį pradmenį liguotam adapteriui. PGR pradmuo gali būti suplanuotas turėti daug restrikcijos saitų. Šiame pavyzdyje XbaI buvo naudojamas klonavimo palengvinimui. PGR produktai buvo išgryninti ir suskaldyti su XbaI ir liguoti iki atitinkamo vektoriaus, skirto transformacijai. Kolonijos buvo augintos ir sekvenuotos, kad nustatytų klonuotus įterpimus.
[0096] Vėlesnėje kompiuterinėje analizėje klonuotų įterpimų sekose viskas atitiko nurodytam žiurkės genomui. Šių sekų galai, pažymėti 2 bp 3'-lipniu galu, kuriuos generavo AbaSDFI. Tada mes išekstrahavome 40 bp sekos langą abiems - kairiam ir dešiniam aplink skėlimo saitą ir išdėstėm sekas atskleisdami potencialų kosensusą, kaip parodyta Fig. 10. Buvo stebimi du matomi CG klasteriai prie abiejų skėlimo saitų dešinės ir kairės pusės. Atstumas tarp šių CG klasterių ir skėlimo saito atitiko AbaSDFI fermento skėlimo atstumui. Kol nenorima, kad būtų apribota teorijos, siūloma, kad AbaSDFI dimerizacija gali realizuotis apie 22 nukleotidų skėlimų atstume modifikuoto citozino vienoje pusėje. Taigi, gali būti padaryta išvada, kad mažiausiai vienas iš CG saitų yra hidroksimetilintas.
[0097] 6 Pavyzdys: Hidroksimetilintų bazių genominėje DNR aptikimas
[0098] E14 pelės embrioninės kamieninės ląstelės ir NIH3T3 pelės genominės DNR ~ 500 ng buvo pajungta skaldymui su padidintos koncentracijos PvuRts1I 25ºC temperatūroje valandai NEB4 buferyje. Molekulinės masės žymenys buvo pBR322 DNR skaldymo su MspI, su kelių juostų dydžiu, išvardintu dešinėje. Suskaldytas produktas buvo paskleistas ant 20 % TBE gelio 2 valandoms prie 140 V, nudažytas su SYBER®Gold nukleorūgšties gelio dažikliu (Invitrogen, dabar Life Technologies, Carlsbad, CA) ir kiekybiškai nustatytas naudojant Typhoon skanerį (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) naudojant 488 nM lazerį (žiūr. Fig. 15).
[0099] 7 Pavyzdys: Sekų, turinčių hmCs, kartografavimas
[0100] Kai hmC pasitaiko genome, atrodo, kad tai dažniausiai pasitaiko CpG saite. Vis dėl to taip pat tikėtina, kad DNR yra hemi-hidroksimetilinta CpG saite. Jeigu čia DNR sekoje yra du kaimyniniai CpG saitai ir skėlimo vaizdas rodo hemi-hidroksimetilinimą, tai būtina nustatyti, kuris iš dviejų galimų CpGs yra hidroksimetilintas. Sekantis eksperimentas iliustruoja kaip hemi-hidroksimetilinto saito lokacija net gali būti nustatyta kai yra du kaimyniniai CpGs.
[0101] DNR fragmentai yra sukurti po specifinio arba nespecifinio genomo skėlimo. Egzistuojantys trys galai ant šių fragmentų yra blokuoti, pavyzdžiui, "užbukinimu" arba defosforilinimu. Skeliami fragmentai yra liguojami prie oligonukleotidų adapterio, tada fragmentai pajungiami skėlimui fermentu iš ZZYZ šeimos (pavyzdžiui, AbaSDFI). Kad nustatytų, ar DNR skėlimo saito ant abiejų pusių turi hmC ar tik viena pusė turi hmC, skaldyta genominė DNR yra "užbukinama" ir liguojama prie X-kontrolės-koduoto SOLIDTM pradmens ir P1 pradmens naudojant NEBNext® greito ligavimo modulį (NEB M2200). Po ligavimo, DNR yra vėl skaldoma ZZYZ fermentų šeima, ir fragmentai, kurie negali būti nuskelti nuo X-kontrolės-koduoto SOLIDTM pradmens (Applied Biosystems, dabar Life Technologies, Carlsbad, CA) turės seką hmC transkripcijos kryptimi. Fragmentai, kurie gali būti suskaldyti, gamins produktą su specifiniu 2 nt 3' galu, kuris yra iš X-kontrolės-koduoto pradmens. Tada antras Y-kontrolės-koduotas SOLIDTM pradmuo yra liguotas prie laisvojo galo; šis SOLIDTM judantis ratu sekvenavimas atskleis seką, turinčią hmC. Nesvarbu, jeigu šio metodo 5-hmC saitai yra sugrupuoti arba atsitiktinai paskirstyti (Fig. 11).
[0102] hmC pozicijos nustatymas DNR sekoje ir sekos kartografavimas ant genomo žemėlapio įgalina hidroksimetilomos sukūrimą. Tai taip pat įgalina diagnostikos testą nustatyti hmC buvimą ant taikinio DNR ir po to tai palyginti su etalonine hidroksimetiloma, kad nustatytų koreliaciją su fenotipu. Šalia specifinio fermentinio skaldymo su arba be gliukozilinimo, surišto su qPCR, gali būti nustatytas kiekybinis hidroksimetilinimas specifiniuose saituose.
[0103] Identifikuojant poziciją ir hmC kiekį iš skirtingų šaltinių, apimant skirtingus audinius ir ląstelės kultūrą prie skirtingu laiko taškų, galima pateikti svarbių įžvalgų į genų ekspresiją ir reguliaciją.
[0104] 8 Pavyzdys: hmC aptikimo būdas DNR pavyzdyje
[0105] ZZYZ baltymų šeimos charakterizavimas atidaro naujas galimybes didelio skaičiaus mėginių greitai analizei arba diagnostiniams testams, skiriamiems gydytojo priimamajame.
[0106] Kadaise hmCs yra kartografuoti ant hidroksimetilomos ir parinkta hmC pozicija koreliavo su fenotipu, todėl norėsis nustatyti specifinių hmCs buvimą genomo taikinio regionuose. Tai gali būti lengvai pasiekiama naudojant ZZYZ baltymų šeimą. Jeigu DNR yra simetriškai hidroksimetilinta, tai atsiras specifinio dydžio fragmentas (20-30 nt). Jeigu DNR yra hemi- hidroksimetilinta, tai hmC buvimas gali būti nusisytas kaip nurodyta žemiau.
[0107] Genomini DNR yra pasirinktinai gliukozilinama ir po to paveikiama fermentu iš ZZYZ baltymų šeimos atitinkamame buferyje, tokiame kaip 250 mM kalio acetate, kad leistų skėlimą į fragmentus prie nukleotidų 11-13 saitų 3' transkripcijos kryptimi nuo hmC toje pačioje grandinėje ir 9-10 nukleotidų 3' transkripcijos kryptimi nuo hmC komplementarioje grandinėje. Yra parinkti pradmenys, kurie yra komplementarūs sekoms bet kurioje ZZYZ baltymo skėlimo saito pusėje, tokia kaip DNR, kuri nėra skelta yra amplifikuota. Tada aptikti fragmentai atitiks hmC nebuvimui. Kur DNR yra skelta ZZYZ baltymu, nurodančiu hmC buvimą, jokio amplifikacijos produkto nebus aptikta. Sulyginant amplifikacijos produktą genominiame bandinyje paveiktus ir nepaveiktus ZZYZ baltymu, pastarasis gali potencialiai įvertinti hidroksimetilinimo procentinį dydį. Alternatyviai, adapteriai, turintys pradmens seką gali būti liguoti prie pakopinių galų prie 3' skilimo saito arba liguoti prie DNR "užbukintų galų" ir tik tokie fragmentai, turintys hmC, bus amplifikuoti nuo pradmens priklausančia amplifikacija. Taigi, hmC buvimas bus aptiktas kaip amplifikacijos produktas. Šiuo atveju amplifikuoti fragmentai gali būti sekvenuoti.
[0108] Šio metodo pranašumas yra tas, kad visos reakcijos gali būti įvykdytos paprastame reakcijos inde arba mikrofluidiniame įtaise arba luste.
[0109] 9 Pavyzdys: Rinkinys, skirtas aptikti hmC DNR mėginyje
[0110] Pateikiamas rinkinys, kuris turi vieną arba daugiau išgrynintų rekombinantinių baltymų iš ZZYZ baltymų šeimos, jų funkcinių darinių arba jų katalitinių fragmentų, pavyzdžiui AbaSDF1, kartu su atitinkamu reakcijos buferiu ir papildomai BGT ir UDP-gliukoze. Be to, rinkinys turi oligonukleotidų adapterius, kad palengvintų didelio našumo sekvenavimą. Be to, rinkinys dar gali apimti fermentus, tinkančius "galų užbukinimui" ir ligavimui, ir papildomuose įgyvendinimuose gali apimti specifinius pradmenis. Išradimo įgyvendinime, rinkinys dar apima įpakavimo medžiagas ir rinkinių naudojimo instrukcijas.
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
1. Preparatas b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima vieną arba daugiau išgrynintų rekombinantinių baltymų, kuriame baltymai yra ZZYZ baltymų šeimos nariai, kai kiekvienas ZZYZ baltymų šeimos narys turi N-galinį domeną, kur N-galinis domenas turi mažiausiai 95 % homologiją su SEQ ID Nr. 14; ir reakcijos buferį.
2. Preparatas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad vienas arba daugiau išgrynintų baltymų pirmenybiškai rišasi prie hidroksimetilinto citozino (hmC) ir/arba prie glikozilinto hidroksimetilinto citozino (ghmC), palyginus su rišimusi prie DNR metilinto citozino (mC).
3. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 2 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad vienas arba daugiau išgrynintų baltymų pirmenybiškai skelia DNR hmC arba ghmC nustatytu atstumu nuo 3'.
4. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 3 punktų, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad nustatytas atstumas yra 11-13 nukleotidų grandinėje, turinčioje hmC arba ghmC, arba 9-10 nukleotidų komplementarioje grandinėje.
5. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 4 punktų, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad vienas arba daugiau išgrynintų baltymų skelia DNR, turinčią ghmC, hmC ir/arba mC santykiu mažiausiai 8:1 pagal ghmC arba hmC su mC.
6. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 5 punktų b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad buferis apima druską, besiskiriančią anijonu, parinktu iš grupės, susidedančios iš sulfato, fosfato, acetato ir citrato.
7. Preparatas pagal bet kurį nuo 1 punkto iki 6 punktų, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad buferis neturi chlorido, nitrato, karbonato arba imidazolo druskų.
8. Preparatas pagal 6 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad druskos koncentracija yra 50-500 mM.
9. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 8 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad bent vienas narys apima SEQ ID Nr. 14.
10. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 9 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad bent vienas išgrynintas baltymas turi aminorūgščių seką su mažiausiai 95 % sekos homologija su SEQ ID Nr. 7.
11. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 10 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad bent vienas išgrynintas baltymas turi aminorūgščių seką, apimančią mažiausiai 95 % sekos homologiją su fermentu, parinktu iš PvuRts1I, PpeHI, EsaSS310P, EsaRBORFBP, PatTI, YkrI, EsaNI, SpeAI, BbiDI, PfrCORF1I80P, PcoORF314P, BmeD1, AbaSDF1, AbaCI, AbaAI, AbaSI, AbaUMB3ORFAP ir Asp6ORFAP.
12. Preparatas pagal bet kurį iš nuo 1 iki 11 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad bent vienas iš išgrynintų baltymų yra parinktas iš grupės, susidedančios iš: PvuRts1I, PpeHI, EsaSS310P, EsaRBORFBP, PatTI, YkrI, EsaNI, SpeAI, BbiDI, PfrCORF1I80P, PcoORF314P, BmeD1, AbaSDF1, AbaCI, AbaAI, AbaSI, AbaUMB3ORFAP ir Asp6ORFAP ir jų katalitiškai aktyvių mutantų ir jų darinių.
13. hmC aptikimo būdas genominės DNR mėginyje, apimantis:
a) preparato pagal bet kurį iš nuo 1 iki 12 punktų pridėjimą į genominės DNR mėginį;
b) sudarymą galimybės baltymui skelti genominę DNR skėlimo vietoje;
c) skėlimo vietos DNR sekos bent vienos pusės nustatymą;
d) pasirinktinai, DNR sekos kartografavimą ant referencinės genominės DNR sekos; ir
e) hmC aptikimą.
14. Būdas pagal 13 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad preparatas a) pakopoje dar apima: vieną arba daugiau DNR polimerazių, pradmenų ir adapterių.
15. Būdas pagal bet kurį iš nuo 13 iki 14 punktų, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad dar apima: prieš nustatant DNR seką c) pakopoje, suskaldytos genominės DNR amplifikaciją b) pakopoje.
16. Būdas pagal bet kurį iš nuo 13 iki 15 punktų, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad prieš a) pakopą genominė DNR reaguoja su β-gliukoziltransferaze (BGT).
17. Būdas pagal bet kurį iš nuo 13 iki 16 punktų imtinai, dar apimantis: a)-c) pakopų vykdymą viename reakcijos inde arba mikrofliuidiniame įtaise.
18. Rekombinantinio ZZYZ šeimos baltymo gryninimo būdas, apimantis:
klonavimą ir ekspresavimą sulietų baltymų, apimančių ZZYZ baltymus, inteiną ir afininio surišimo baltymą;
sukėlimą sulieto baltymo rišimosi prie matricos afininio surišimo baltymo priemonėmis;
ZZYZ baltymo atskėlimą nuo inteino; ir
išgryninto baltymo regeneravimą eliuate.
19. Būdas pagal 18 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad afininio surišimo baltymas yra chitiną surišantis domenas.
20. Fragmentų rinkinys, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima mažiausiai vieną iš a) oligonukleotido fragmentą, turintį 20-23 nukleotidų dydį su patalpintu centre hmC arba ghmC; arba b) didelę DNR arba oligonukleotidų fragmentus, turinčius hmC arba ghmC, patalpintus DNR duplekso vienguboje grandinėje prie 11-13 nukleotidų padėtimi nuo grandinės 3' galo.
21. Rinkinys, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima: vieną arba daugiau išgrynintų rekombinantinių ZZYZ baltymų šeimos baltymų, jų funkcinių darinių arba jų katalitinių fragmentų veiksmingame buferyje fermento aktyvumui; ir naudojimo instrukciją.
22. Rinkinys pagal 21 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad dar apima BGT ir UDP-gliukozę.
23. Rinkinys pagal 21 arba 22 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad dar apima pradmenis.
24. Reakcijos indas, apimantis: preparatą pagal bet kurį iš 1-12 punktų, pradmenis ir/arba adapterius ir termostabilią polimerazę.
25. Preparatas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad apima: ZZYZ baltymų šeimos nario baltymo funkcinius darinius arba katalitinius fragmentus; ir reakcijos buferį.