[LT] Išradime aprašytas storosios žarnos vėžio (SŽV) nustatymo būdas. Šis būdas apima biologinio mėginio paėmimą, laisvai cirkuliuojančios DNR išskyrimą iš biologinio mėginio (kraujo plazmos), Staphylococcaceae ir Staphylococcus hominis bakterijų sekų nustatymą laisvai cirkuliuojančioje DNR naudojant naujos kartos sekoskaitą, Staphylococcaceae ir Staphylococcus hominis bakterijų sekų santykinio skaičiaus biologiniame mėginyje paliginimo su referentinėmis reikšmėmis (atitinkamai 9,0 proc. ir 0.3 proc.), jei Staphylococcaceae ir Staphylococcus hominis bakterijų sekų santykinis skaičius paciento biologiniame mėginyje viršija referentinę reikšmę, pacientui nustatomas SŽV. Būdas pasižymi aukštu jautrumu ir specifiškumu, todėl jis yra perspektyvi alternatyva ankstyvajai SŽV diagnostikai.
[EN] The invention describes a method for detecting colon cancer. This method includes taking a biological sample, isolating free-circulating DNA from the biological sample (blood plasma), determining the sequences of Staphylococcaceae and Staphylococcus hominis bacteria in free-circulating DNA using next-generation sequencing, comparing the relative number of Staphylococcaceae and Staphylococcus hominis bacterial sequences in the biological sample with reference values (respectively 9.0 percent and 0.3 percent), if the relative number of Staphylococcaceae and Staphylococcus hominis bacterial sequences in the patient's biological sample exceeds the reference value, the patient is diagnosed with colon cancer. The method is characterized by high sensitivity and specificity, which makes it a promising alternative for early diagnosis of colon cancer.
[0001] TECHNIKOS SRITIS
[0002] Šis išradimas priklauso medicinos mokslų sričiai, onkologijai.
[0003] TECHNIKOS LYGIS
[0004] Storosios žarnos vėžys (SŽV) yra vienas dažniausių vėžio susirgimų pasaulyje. Kasmet diagnozuojama daugiau nei pusė milijono naujų šio susirgimo atvejų. SŽV yra trečia pagal dažnumą onkologinė liga Lietuvoje. Siekiant sumažinti pacientų mirtingumą nuo SŽV svarbu diagnozuoti ligą ankstyvoje stadijoje. Prevencinės SŽV patikros programos vakarų šalyse ir Lietuvoje yra paremtos slapto kraujo nustatymo išmatose testais ir, esant teigiamam rezultatui, po to sekančiu endoskopiniu storosios žarnos tyrimu. Pastarasis tyrimas yra invazinis ir susijęs su dideliais sveikatos priežiūros sistemos kaštais. Šiuo metu SŽV ankstyvos patikros programose naudojami imunocheminiai slapto kraujavimo išmatose testai pasižymi žema diagnostine verte - jų tikslumas nėra pakankamas. Todėl būtina ieškoti naujų molekulinių biožymenų, pasižyminčių lengvu pritaikomumu klinikinėje praktikoje ir aukštu jautrumu bei specifiškumu. Vienas iš išradimo analogų yra metodas, skirtas nustatyti SŽV, naudojant išmatų tyrimą, aprašytas patento paraiškoje WO2019151515A1. Šis metodas pagrįstas subjekto genų esančių išmatose tyrimu tačiau jo jautrumas bei specifiškumas nėra aukštas. Kitas išradimo analogas aprašomas patento paraiškoje WO03059150A2 yra metodas, skirtas nustatyti SŽV, naudojant endoskopinį tyrimą. Šis metodas yra invazinis ir susijęs su dideliais sveikatos priežiūros sistemos kaštais.
[0005] Šioje paraiškoje aprašytas metodas yra naujas išradimas, įgalinantis aptikti SŽV ankstyvoje stadijoje, turi aukštą jautrumą ir specifiškumą.
[0006] IŠRADIMO ESMĖ
[0007] Patentuojamas metodas yra skirtas aptikti SŽV ankstyvoje stadijoje, taip mažinant žmonių mirtingumą nuo šio naviko bei trumpinant gydymo laiką ir mažinant sveikatos apsaugos 2 sistemos ir pacientų išleidžiamus gydymui kaštus. Metodas paremtas naujos kartos sekoskaitos metu nustatytų bakterijų šeimos Staphylococcaceae ir bakterijų genties Staphylococcus hominis 16S rRNR geno V1-V2 regiono sekų santykinio skaičiaus padidėjimu (atitinkamai daugiau nei 9 proc. ir daugiau nei 0.3 proc.) kitų bakterijų atžvelgiu panaudojus pacientų kraujo plazmą. Esminiai techniniai reikalavimai siekiant įgyvendinti metodą: paciento kraujo plazma, komercinis DNR gryninimo rinkinys, komercinis PGR atlikimo rinkinys, specifiniai 27F ir 338R pradmenys skirti 16S rRNR geno V1-V2 pagausinimui, komercinis Illumina sekoskaitos rinkinys, kompiuteris su dada2, phyloseq, vegan, R įrankiais.
[0008] DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
[0009] Storosios žarnos vėžiui nustatyti yra naudojamas paciento kraujo plazmos mėginys, iš kurio išgryninama laisvai cirkuliuojanti DNR. PGR būdu, naudojant 27F ir 338R pradmenis, pagausinamas 16S rRNA geno V1-V2 regionas.
[0010] NAUJOS KARTOS SEKOSKAITA ATLIEKAMA MISEQ ILLUMINA APARATU
[0011] Pasitelkiant bioinformatinius įrankius (dada2, phyloseq, vegan, R) prijungiama naujausia bakterijų duomenų bazė (Silva 132). Visom nustatytoms bakterijų sekoms priskiriami taksonominiai lygiai (tipas, klasė, eilė, šeima, gentis, rūšis). Vėliau sekos apjungiamos į atitinkamas grupes pagal nustatytus taksonominius lygius.
[0012] Iš visų nustatytų šeimų išskiriama Staphylococcaceae, o iš visų nustatytų rūšių išskiriama Staphylococcus hominis. Apskaičiuojamas jų santykinis gausumas (procentais) kitų bakterijų atžvelgiu. Staphylococcaceae santykinis gausumas skaičiuojamas Šeimos lygmeniu, o Staphylococcus hominis – Rūšies lygmeniu.
[0013] Storosios žarnos vėžys yra identifikuojamas, jeigu tirtame mėginyje Staphylococcaceae bakterijų šeima, atsižvelgiant į kitas bakterijų šeimas taip pat nustatytas tame mėginyje, viršija 9,0 proc. o Staphylococcus hominis bakterijų rūšis, atsižvelgiant į kitas bakterijų rūšis taip pat nustatytas tame mėginyje, viršija 0,3 proc.
[0014] Šis būdas pasižymi aukštu jautrumu ir specifiškumu (AUC = 73 proc.), todėl jis yra perspektyvus naujas būdas ankstyvai SŽV diagnostikai.
[0015] SŽV sergančiųjų ir kontrolinių asmenų kraujo mėginiai buvo surinkti 2013-2022 metais Gastroenterologijos ir Chirurgijos skyriuose (Kauno klinikos, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė) ir saugoti biobanke – 80 ˚C temperatūroje. Kraujo plazmos bakterijų 16S rRNR analizei buvo panaudoti 56 SŽV ir 66 kontrolinės grupės pacientų mėginiai. Kontrolinę grupę sudarė pacientai, kuriems nenustatyti jokie piktybiniai navikai, SŽV grupės pacientams liga buvo diagnozuota atlikus histologinį tyrimą.
[0016] BAKTERINĖS DNR GRYNINIMAS IŠ KRAUJO PLAZMOS
[0017] Siekiant išgryninti bakterinės kilmės DNR frakciją, esančią žmogaus kraujyje, pirmiausiai buvo skiriama visa laisvai kraujyje cirkuliuojanti DNR (lc-DNR). Lc-DNR buvo išgryninta iš periferinio kraujo plazmos (500 µl) naudojant QIAamp MinElute ccfDNA Mini Kit (Qiagen) rinkinį pagal gamintojo pateiktą protokolą. DNR koncentracija išmatuota Bioanalyzer 2100 (Agilent) bei Qubit analizatoriais.
[0018] 16S RRNR GENO SEKOSKAITOS BIBLIOTEKŲ PARUOŠIMAS IR SEKOSKAITA
[0019] Siekiant iš visos išskirtos laisvai cirkuliujanti DNR (lc-DNR) atskirti tik bakterinę frakciją, PGR metodu, naudojant 27F-338R pradmenis, buvo pagausintas tik bakterijoms būdingas 16S rRNR genas. PGR reakcijos efektyvumas (produkto susidarymas) buvo įvertinti agarozės gelyje. Tolimesnei analizei tinkantys mėginiai, siekiant suvienodinti koncentraciją, buvo normalizuoti naudojant SequalPrep rinkinį (Thermo Fisher). Po normalizacijos mėginiai buvo apjungti į vieną biblioteką ir pasinaudojant Illumina MiSeq (Illumina) platforma buvo atlikta paruoštos bibliotekos sekoskaita. Lc-DNR mėginių taršai įvertinti kiekvieną kartą gryninant tiriamųjų mėginių seriją, kaip neigiama kontrolė, buvo panaudoti vandens mėginiai, iš kurių buvo gryninama DNR bei atlikta PGR ir sekoskaita.
[0020] 16S RRNA SEKOSKAITOS DUOMENŲ BIOINFORMATINĖ IR STATISTINĖ ANALIZĖ
[0021] Sekoskaitos duomenys išanalizuoti naudojant dada2 ir phyloseq algoritmus R programoje. Nustatytos sekos buvo kiekybiškai ir kokybiškai įvertintos ir tolimesnei analizei paliktos tik kokybės rekomendacijas atitinkančios sekos. Sekos, rastos kontroliniuose vandens mėginiuose, įtariant užterštumą buvo pašalintos iš tyrimo, naudojant decontam paketą. Nustatytoms sekoms buvo priskirta taksonominė klasifikacija, naudojant naujausią SILVA bakterijų duomenų bazę (138 versija). Mėginiai su nuskaitymo lygiu mažesniu nei 500 buvo 4 pašalinti iš analizės. Duomenų normalizavimas ir β-įvairovės analizė buvo atlikta naudojant DESeq2 paketą. β-įvairovės analizė buvo atlikta tik su bakterijomis, kurios buvo aptinkamos daugiau nei 25 proc. mėginių, bent vienoje iš lyginamųjų grupių. Visuose testuose skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingais, kai koreguota dauginio palyginimo p vertė (p.adj) buvo < 0,05.
[0022] REZULTATAI
[0023] Vertinant kraujo plazmoje esančias bakterijas, kaip biožymenį, rinkinys iš dviejų bakterijų taksonominių vienetų – Staphylococcus hominis sekos (ASV 8) ir šeimos Staphylococcaceae kaip biožymens jautrumas siekė 68 proc., o specifiškumas – 83 proc., jautrumo ir specifiškumo sąryšis 73 proc.. Sergančiųjų kraujo plazmos mėginiuose Staphylococcaceae bakterijų šeima atsižvelgiant į kitas bakterijų šeimas viršijo 9 proc. o Staphylococcus hominis bakterijų rūšis atsižvelgiant į kitas bakterijų rūšis viršijo 0.3 proc. tai traktuojama kaip SŽV požymis.
1. Storosios žarnos vėžio (SŽV) nustatymo būdas, naudojant tikslinius molekulinius žymenis, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad būdas apima Staphylococcaceae ir Staphylococcus hominis bakterijų 16S rRNR geno V1-V2 regiono nustatytų sekų santykinio skaičiaus procentais nustatymą, naudojant naujos kartos sekoskaitą.
2. Storosios žarnos vėžio (SŽV) nustatymo būdas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad yra nustatomas Staphylococcaceae (daugiau nei 9 proc.) ir Staphylococcus hominis (daugiau nei 0,3 proc.) bakterijų sekų santykinis skaičius, pagal kurį yra identifikuojamas storosios žarnos vėžys (SŽV).
3. Storosios žarnos vėžio (SŽV) nustatymo būdas pagal 1 ir 2 punktus, skirtas panaudoti nustatant storosios žarnos vėžį (SŽV).