[LT] Aprašomas chemofermentinis būdas gaminti funkciškai aktyvius S-adenozil-L-metionino analogus su prailgintomis pernešamomis grupėmis, kurių struktūrinė formulė (I) ir (II), iš atitinkamų alkilbromidų ir S-adenozil-L-homocisteino.
[EN] A method is disclosed for chemo-enzymatic production of the functionally active stereoisomer of Sadenosyl-L-methionine analogs with extended transferable moieties of formula (I) and (II) from corresponding alkylbromides and S-adenosyl-L-homocysteine.
[0001] IŠRADIMO SRITIS
[0002] Šis išradimas yra susijęs su S-adenozil-L-metionino (AdoMet) analogų (nuo AdoMet priklausomų metiltransferazių kofaktorių), turinčių prailgintus struktūrinius fragmentus, naudingus biotechnologiniams taikymams, gamyba chemofermentiniu būdu; būtent susijęs 5 su halogenidų metiltransferazės nukreipta stereomeriškai grynų AdoMet analogų sinteze, naudojant atitinkamus alkilhalogenidus ir S-adenozil-L-homocisteiną.
[0003] TECHNIKOS LYGIS
[0004] DNR citozinų, histonų aminorūgščių ir RNR adeninų arba ribozių metilinimas yra pagrindiniai epigenetiniai mechanizmai, dalyvaujantys daugelyje svarbių biologinių procesų, įskaitant embriono vystymąsi, transkripciją, chromatino struktūrą, ligų patogenezę ir kt. Šias fermentines reakcijas katalizuoja gausi klasė nuo S-adenozil-L-metionino (AdoMet) priklausomų metiltransferazių (MTazių), kurios perneša metilo grupę iš ko-substrato (kofaktoriaus) AdoMet ant N-, C-, O- arba S-nukleofilų (Moore et al. 2013). Pastaraisiais metais sukonstruotos MTazės, pasižyminčios alkiltransferaziniu aktyvumu, leidžia perkelti prailgintu struktūrinius fragmentus su funkcinėmis arba reporterinėmis grupėmis nuo AdoMet analogų ant specifinių molekulių ar taikinių ir turi didžiulį potencialą cheminės ir sintetinės biologijos srityse (Struck et al. 2012; Tomkuvienė et al. 2019). Šie fermentai naudojami kaip įrankiai epigenetinių/epitranskriptominių/biologinių procesų ir jų reguliavimo dekodavimui, ar netgi ir mažų cheminių junginių, tokių kaip vaistai, maisto produktai ir kiti natūralūs produktai, sintezei (Mickutė et al. 2021; Stankevičius et al. 2022; Mo et al. 2017; Kunjapur et al. 2016).
[0005] Įvairūs funkciniai AdoMet analogai buvo sukurti ir panaudoti DNR, RNR, baltymų ar mažų molekulių žymėjimui, kad būtų galima izoliuoti, vizualizuoti ir analizuoti šias pažymėtas biomolekules, naudojant naujos kartos sekoskaitą ir kitas technologijas (Lukinavičius et al., 2012 ir 2013; Stankevičius et al. 2022; Mickutė et al. 2021; Staševskij et al. 2017; Osipenko et al. 2017). Dauguma dabartinių metodų naudoja AdoMet analogus su ilga pernešama dalimi su trigubuoju ryšiu šalia reaktyvaus anglies atomo, kad būtų užtikrinta efektyvi DNR MTazės reakcija (Lukinavičius et al., 2013; Tomkuvienė et al. 2019).
[0006] Deja, negamtinių AdoMet analogų cheminė sintezė yra brangi, dažnai labai sudėtinga ir pasižymi prastu stereoselektyvumu, maža išeiga, o daugeliui biologinių taikymų reikia miligraminių kiekių. Dėl cheminės sintezės metu kylančių sunkumų, chemofermentinė kofaktorių gamyba būtų pranašesne, nes ji siūlo: geresnį saito-, stereo- ir chemoselektyvumą; didesnį stabilumą dėl aplinkos temperatūros, švelnių ir vandens aplinkos sąlygų, kurios yra labai svarbios ferment veikimui; didesnį tvarumą ir bioortogonalumą; mažesnius kaštus (Bennett et al. 2017; Mordhorst et al. 2017; Zhang et al. 2021; Liao and Seebeck 2020; Doyon and 35 Narayan 2020).
[0007] Paskutiniu metu chemofermentinei sintezei buvo naudojami du skirtingi fermentai. Metionino adenosiltransferazės gali pagaminti platų kofaktorių asortimentą, naudodamos ATP ir L-metionino (L-Met) analogus (Huber et al. 2020; Shu et al. 2020; Hartstock et al. 2018).
[0008] Halogenazės – adenosil-chlorido sintazė ir adenosil-fluorido sintazė – katalizuodamos atvirkštinę reakciją gamina kofaktorius, naudojant L-Met arba jo darinius ir 5'-chloro- arba 5'-fluoro-5'-deoksiadenoziną (Davis et al. 2018; Bennett et al. 2017; Thomsen et al. 2013).
[0009] Tačiau šių chemoenziminiai metodikų taikymas susiduria su reikšmingomis kliūtimis, įskaitant sudėtingą cheminę L-Met analogų sintezę; ląstelinio L-Met konkurenciją su L-Met analogais biologinėje aplinkoje, kuri reikalauja ląstelių kultivavimo nenatūralioje metionino neturinčioje terpėje (Tang et al. 2021b).
[0010] Halidinių metiltransferazių (HMT) taikymas leidžia naudoti S-adenozil-L-homocisteiną (AdoHcy) ir haloalkanus, kurių sintezė yra paprastesnė (Liao and Seebeck 2019); Bengel et al. 2021; Tang et al. 2021a; Hoffmann et al. 2023). Anksčiau skelbtame AdoMet analogų serijos kūrime, naudojant Aspergillus clavatus HMT (Schülke et al. 2022) pademonstruota, kad alkilhalidams su ilgesnėmis nei 5 anglies atomų grandinėmis konversijos išeiga yra mažesnė nei 10%. Artimiausiame žinomame išradime (Hoffmann et al. 2023), alkilinimo išeiga su benzilo jodidu pasiekė 29% (naudojant 2,5 ekvivalento haloalkano, 0,1 ekvivalento fermento AdoHcy atžvilgiu ir inkubuojant 2 valandas 37°C temperatūroje), tačiau junginys taip pat suteikė didelį (10%) nespecifinį foninį reaktyvumą (cheminį nestereoselektyvų alkilinimą) kontrolinėse reakcijose. Bendrai, kiti ankstesni išradimai pranešė apie kofaktorių su prie sulfonio prijungtomis ilgesnėmis nei 5 anglies atomų grandinėmis gamybą su išeigomis mažesnėmis nei 50%.
[0011] Šios techninės problemos sprendimas pasiekiamas pateikiant 1-5 paveiksluose parodytus pavyzdžius, kurie demonstruoja, kaip pagaminti funkciškai aktyvius AdoMet analogų stereoizomerus su prailgintomis šoninėmis grandinėmis ilgesnėmis nei 5 anglies atomai, pasiekiant konversijos išeigas, viršijančias 60–95%.
[0012] IŠRADIMO ESMĖ
[0013] Pristatomas išradimas pateikia chemofermentinį būdą gamybai AdoMet analogų su struktūriniais fragmentais, tinkamais efektyvioms modifikavimo reakcijoms, naudojant AdoMet-priklausomas metiltransferazes. Būdas apima AdoMet analogų su struktūriniais fragmentais, turinčiais reporterinę grupę arba funkcinę grupę, sintezę, kurie gali būti naudojami tiksliniam DNR metiltransferazės nukreiptam specifinių taikinių baltymuose, RNR ar DNR žymėjimui;
[0014] Chemofermentinis S-adenozil-L-metionino (AdoMet) analogų, turinčių struktūrinius fragmentus su funkcine grupe arba reporterine grupe, gavimo būdas, naudojant I ir II formulių junginius
[0015]
[0016]
[0017] būdas, apimantis III formulės AdoMet pirmtako molekulės reakciją
[0018]
[0019] su alkilhalogenidu R-Hal ir halidine metiltransferaze (HMT) tokiomis sąlygomis, kurios tinkamos AdoHcy arba SeAdoHcy paversti į AdoMet analogus,
[0020] kur
[0021] n yra 0, 1, 2, 3 arba 4
[0022] Z yra S arba Se
[0023] X yra funkcinė arba reporterinė grupė: N3, C≡CH, NH2, arba 4-Y-2,3,5,6-tetrazin-1-il, 4-(4'Y-2,3,5,6-tetrazin-1'-il)-W-1-il
[0024] kur
[0025] W yra para-arilenas, kurio struktūrą sudaro bet koks skaičius ir bet koks šių struktūros elementų derinys: N, CH, C-Oalkil (C1-C12).
[0026] Y yra H, CH3, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2, CH2CH3, CH(CH3)2, CH2CH2CH3, fenil, 4-CH3Ofenil, 3,4-diCH3Ofenil, arba 2,6-diCH3Ofenil.
[0027] R yra CH2-(CH2)n-X arba CH2-C≡C-(CH2)n-X ir yra sujungtas su Z (I, II, III formulės junginiai). Mokslininkai parodė, kad grybo Aspergillus clavatus halidinė metiltransferazė gali tiesiogiai pernešti ilgesnius struktūrinius fragmentus nuo tam tikrų halogenalkanų (R-Hal) ant S-adenozil- L-homocisteino S atomo. Vienas iš variantų halogenidas R-Hal1, bromidas su 6-azidoheks-2-inilo fragmentu, turintis galinę funkcinę azido grupę, kuri gali būti naudojama RNR arba DNR metiltransferazių ssRNR, dsRNR ir DNR taikinių analizei, naudojant click chemijos reakcijas. Antras variantas halogenidas R-Hal2, bromidas su prailgintu fragmentu, turintis galinę 1,2,4,5- tetrazino grupę. 1,2,4,5-tetrazinai tapo plačiai naudojami bioortogonaliose click chemijos reakcijose (Oliveira ir kt., 2017).
[0028] TRUMPAS BRĖŽINIŲ APRAŠYMAS
[0029] Paveikslai yra pateikiami kaip nuoroda į galimus įgyvendinimo planus ir nėra skirti apriboti išradimo apimtį. Pateikti paveikslai ir grafikai neturėtų būti interpretuojami kaip ribojantys išradimo apimtį, jie pateikiami kaip galimo įgyvendinimo pavyzdys.
[0030] 1 pav. Bendra schema, kuri vaizduoja S-adenozil-L-homocisteino (AdoHcy) stereoselektyvų S-alkilinimą arba Se-adenozil-L-homoselenocisteino (SeAdoHcy) stereoselektyvų Se-alkilinimą, kurį katalizuoja grybo Aspergillus clavatus halidinė metiltransferazė (HMT), panaudojant alkilhalogenidus (R-Hal), turinčius ilgesnius struktūrinius fragmentus.
[0031] 2 pav. HMT katalizuoja AdoMet kofaktoriaus analogo Ado-6-azido sintezę, pernešant ilgesnį struktūrinį fragmentą nuo halogeno atomo azido-1-bromheks-2-ine (R-Hal1) ant AdoHcy sieros atomo. A. Ado-6-azido sintezė skirtingais laiko taškais, panaudojant AdoHcy ir HMT sistemą, HPLC analizė. B. Chromatogramų AdoHcy, C14H21N6O5S (teorinė 385,1294; nustatyta 385,1291) ir produkto Ado-6-azido, C20H28N9O5S+ (teorinė 506, 1929; nustatyta 506,1929) MS analizė. C. HMT sintezė iš AdoHcy į Ado-6-azidą, turintį 6-azidoheks-2-inilo grupę, skirtingais laiko taškais. Visos reakcijos buvo atliktos naudojant 1 mM AdoHcy, 10 mM R-Hal1 ir 100 µM fermento 25 °C temperatūroje. Reakcijos inaktyvuotos 0,5 M fosforo rūgštimi ir centrifuguotos 20000 g 30 min. 4 °C temperatūroje. Paruošti mėginiai buvo įnešti į integruotą HPLC/ESI-MS/MS sistemą (Agilent 1290 Infinity/6410 Triple Quad LC/MS), turinčią Supelco Discovery®HS C18 kolonėlę (7,5 cm × 2,1 mm, 3 µm), ir eliuoti su linijiniu tirpiklių gradientu (A) 0,02 % skruzdžių rūgšties tirpale vandenyje ir (B) 0,02 % skruzdžių rūgšties tirpale acetonitrile po 0-2 min., 0 % B; 2-8 min., 0-15 % B; 8-9 min., 15-95 % B; 9-14min 100 % B; 14-15 min., 100-0 % B; 15-20 min., 0 % B. Masių spektrometras veikė teigiamų jonų režimu ir buvo užfiksuoti šių jonų perėjimų MRM skaičiavimai: AdoHcy 385,1 → 136,1; Ado-6-azidas 506,2 → 250,1 arba 506,2 → 136,1.
[0032] 3 pav. HMT perneša ilgesnį struktūrinį fragmentą nuo halogeno atomo 3-(2-bromoetil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazinas (R-Hal2) ant AdoHcy sieros atomo ir katalizuoja AdoMet kofaktoriaus analogo Ado-2-Tet sintezę. A. Ado-2-Tet sintezė, panaudojant AdoHcy ir HMT sistemą, HPLC analizė. Pateikta chromatograma rodo AdoHcy konversiją į Ado-2-Tet per 60 min. B. Chromatogramų AdoHcy, C14H21N6O5S (teorinė 385,1294; nustatyta 385,1291) ir produkto Ado-2-Tet, C19H27N10O5S+ (teorinė 507,1881; nustatyta 507,1891) MS analizė. C. HMT sintezė iš AdoHcy į Ado-2-Tet, turintį metil-tetrazino-etilo grupę, skirtingais laiko taškais. Visos reakcijos buvo atliktos naudojant 1 mM AdoHcy, 10 mM R-Hal2 ir 100 µM fermento 25 °C temperatūroje. Reakcijos inaktyvuotos 0,5 M fosforo rūgštimi ir centrifuguotos 20000 g 30 min. 4 °C temperatūroje. Paruošti mėginiai buvo įnešti į integruotą HPLC/ESI-MS/MS sistemą (Agilent 1290 Infinity/6410 Triple Quad LC/MS), turinčią Supelco Discovery®HS C18 kolonėlę (7,5 cm × 2,1 mm, 3 µm), ir eliuoti su linijiniu tirpiklių gradientu (A) 0,02 % skruzdžių rūgšties tirpale vandenyje ir (B) 0,02 % skruzdžių rūgšties tirpale acetonitrile po 0-2 min., 0 % B; 2-8 min., 0-15 % B; 8-9 min., 15-95 % B; 9-14min 100 % B; 14-15 min., 100-0 % B; 15-20 min., 0 % B. Masių spektrometras veikė teigiamų jonų režimu ir buvo užfiksuoti šių jonų perėjimų MRM skaičiavimai: AdoHcy 385,1 → 136,1; Ado-2-Tet 507,2 → 250,1 arba 507,2 → 136,1.
[0033] 4 pav. HMT Ado-6-azido sintezė yra stereospecifinė, nes susidaro tik funkciškai aktyvus S140 epimeras (sulfonio epimerų pasiskirstymas remiasi AdoMet). Chemofermentinė reakcija buvo atlikta naudojant 1 mM AdoHcy, 10 mM 6-azido-1-bromheks-2-ino (R-Hal1), 100 µM AclHmt 25 °C temperatūroje 30 min. (2 eilutė). Kontrolinis mėginys – chemiškai susintetintas Ado-6-azido kofaktorius, turintis sulfonio S- ir R-epimerų mišinį (Lukinavičius ir kt., 2013) (1 eilutė). Paruošti mėginiai buvo įnešti į integruotą HPLC/ESI-MS/MS sistemą (Agilent 1290 Infinity/6410 Triple Quad LC/MS), turinčią Supelco Discovery®HS C18 kolonėlę (7,5 cm × 2,1 mm, 3 µm), ir eliuoti su linijiniu tirpiklių gradientu (A) 0,0075 % skruzdžių rūgšties tirpale vandenyje ir (B) 0,0075 % skruzdžių rūgšties tirpale acetonitrile po 0-5 min., 0 % B; 5-15 min., 0-10 % B; 15-20 min., 10-100 % B; 20-24 % min., 100 % B; 24-24,5 min., 100-0 % B; 24,5-30 min., 0 % B. Masių spektrometras veikė teigiamų jonų režimu ir buvo užfiksuoti Ado-6-azido 506,2 → 250,1 jonų perėjimo skaičiai.
[0034] 5 pav. HMT susintetintas Ado-6-azido kofaktorius in situ naudojamas eM.HhaI DNR citozino-5 metiltransferazės specifinio GCGC taikino DNR sekoje alkilinimui, 2`-deoksicitidiną verčiant 5-(6- azidoheksynyl)-2`-deoksicidinu (N3-m5dC). Kaskadinės reakcijos buvo atliktos naudojant 50 µM AclHmt, 100 µM AdoHcy, 10 mM 6-azido-1-bromheks-2-ino (R-Hal1), 500 ng pUC19 plazmidinės DNR, 1 µM eM.HhaI (Q842A/Y254S/N304A HhaI DNR citozino-5 metiltransferazės 155 mutantas, kaip aprašyta Lukinavičius ir kt., 2012) ir inkubuotos 1 val. 37 °C temperatūroje, inaktyvacija kaitinant 10 min. 80 °C temperatūroje (2 linija). Neigiama kontrolė atlikta be AclHmt baltymo (3 linija); teigiama kontrolė atlikta naudojant tik 500 ng pUC19 plazmidinės DNR, 1 µM eM.HhaI ir 100 µM chemiškai susintetinto Ado-6-azido (1 linija), kaip aprašyta Lukinavičius ir kt. 2013. Išgryninus mėginius, 500 ng modifikuotos DNR buvo hidrolizuota iki nukleozidų su 0,01 U/µL P1 nukleazės 4 val. 50 °C temperatūroje, po to inkubuojama per naktį su 0,01 U/µL šarmine fosfataze 37 °C temperatūroje. Reakcijos buvo sustabdytos kaitinant 10 min. 80 °C temperatūroje ir centrifuguojant 20000 g 30 min. 4 °C temperatūroje. Paruošti mėginiai buvo įnešti į integruotą HPLC/ESI-MS/MS sistemą (Agilent 1290 Infinity/6410 Triple Quad LC/MS), sumontuotą su Supelco Discovery®HS C18 kolonėle (7,5 cm × 2,1 mm, 3 µm), ir eliuoti linijiniu tirpiklių gradientu (A) 0,0075 % skruzdžių rūgšties tirpale vandenyje ir (B) 0,0075 % skruzdžių rūgšties tirpale acetonitrile po 0-5 min., 0 % B; 5-15 min., 0-10 % B; 15-20 min., 10-100 % B; 20-24 % min., 100 % B; 24-24,5 min., 100-0 % B; 24,5-30 min., 0 % B. Masių spektrometras veikė teigiamų jonų režimu ir buvo užfiksuoti N3-m5dC 349,2 → 233,1 jonų perėjimo skaičiai.
[0035] 6 pav. HMT Ado-6-azido kofaktoriaus sintezė beveik 3 kartus efektyvesnė, kai buferio pH 6,5 lyginant su pH 7,4. Chemofermentinė sintezė buvo atlikta naudojant 1 mM SAH, 10 mM R-Hal1 ir 100 µM AclHmt 25 °C temperatūroje 3 val., kai buferio pH 6,5 arba 7,4. Mėginiai analizuoti naudojant HPLC-MS, kaip aprašyta 4 pav. Reakcijos metu gauto Ado-6-azido kiekis vaizduojamas chromatogramoje 1 – kai pH 6,5, 2 – kai pH 7,4.
[0036] DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
[0037] Kaip nurodyta aukščiau, šis išradimas siūlo halidinių metiltransferazių vykdomą chemofermentinę sintezę AdoMet analogų biologiškai aktyvių epimerų, kurie efektyviai veikia nuo AdoMet priklausomose fermentinėse reakcijose, analizuojant biomolekulių modifikavimą in vitro ir in vivo, kur pernešama ilgesnio fragmento dalis turi reporterinę arba funkcinę grupę.
[0038] AdoMet analogų, kurių I ir II formulės pateiktos 1 pav., chemofermentinė sintezė remiasi bendra schema, naudojant AdoHcy ir atitinkamą alkilhalogenidą R-Hal1 arba R-Hal2. Epimeriškai gryno AdoMet analogo, kuris pavaizduotas I formulėje, sintezės pavyzdys yra Ado-6-azidas, kuris gaunamas iš AdoHcy ir 6-azido-1-bromheks-2-ino, kaip pavaizduota 2 ir 4 pav. Tokiu būdu susintetintas Ado-6-azidas panaudotas metiltransferazių nukreiptai DNR derivatizacijai pavaizduotas 5 pav. AdoMet analogo, kuris pavaizduotas II formulėje, sintezės pavyzdys yra Ado7 2-Tet, kuris gaunamas iš AdoHcy ir 3-(2-bromoetil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazino, kaip pavaizduota 3 pav. pavyzdžiai rodo, kad pasirenkant tinkamus bromidų pirmtakus ir tinkamas reakcijos sąlygas, kurios pateiktos 2 ir 3 pav. (10 ekvivalentų alkilbromido, 0,1 ekvivalento fermento 190 AdoHcy atžvilgiu ir inkubuojant 0,5–1 val. 25 °C temperatūroje), Ado-6-azido ir Ado-2-Tet kofaktoriai gali pasiekti išeigą >90% ir >60%, atitinkamai. Vykdomos reakcijos atsižvelgia į šiuos 3 veiksnius:
[0039] 1) AdoMet ir jo analogai greitai skyla po ilgos inkubacijos priklausomai nuo temperatūros.Kaip aprašyta pateiktuose pavyzdžiuose, trumpesnis inkubacijos laikas (0,5-1 val.), žemesnė cheminį skylimą ir padidina kofaktoriaus išeigą.
[0040] 2) Alkiljodidai, naudoti ankstesniuose tyrimuose (Bengel ir kt. 2021; Tang ir kt. 2021a; Hoffmann it kt. 2023; Schülke ir kt. 2022) paprastai yra labiau reaktyvūs abejose, tiesioginėje ir atvirkštinėje, reakcijose, dėl to gali atsirasti nespecifinių alkilinimo produktų (nestereoselektyvių produktų (Hoffmann ir kt., 2023) ir mažesnė išeiga dėl atvirkštinės reakcijos metu susikaupusio jodido anijono. Norėdami išvengti šių trūkumų, reakcijos substratu pasirinkome alkilbromidus.
[0041] 3) Atlikta žinomų baltymų kristalų struktūros analizė parodė, kad AdoMet analogai su ilgesniais struktūriniais fragmentais gali būti surišti AclHmt baltymo aktyviajame centre. Manome, kad ilgesnių fragmentų aukštą pernešimo efektyvumą galima pasiekti derinant SN2 reakcijos tinkamą elektroninį aktyvavimą (dėl šalia esančios trigubos jungties (I formulė) arba tetrazino žiedo (II formulė) su sulfoniu sujungtoje dalyje).
[0042] Fermentas
[0043] Išradėjai parodė, kad halidinės metiltransferazės gali pernešti ilgus struktūrinius fragmentus, turinčius reporterinę ar funkcinę grupę nuo alkilhalido ant AdoHcy. Halidines metiltransferazes, naudojamas čia aprašytu būdu, galima rasti augaluose, grybuose, bakterijose ir pageidautina, kad AclHmt koduotų genas iš Aspergillus clavatus. Laukinio tipo metiltransferazės AclHmt sekas galima rasti GenBank, prieigos Nr. XP_001272206 (tiolo metiltransferazė, tariama).
[0044] Metiltransferazės geno nukleotidų seka optimizuota remiantis kodonų naudojimo dažniu E. coli, nekeičiant koduojamų aminorūgščių:
[0045]
[0046]
[0047] AclHMT amino rūgščių seka turi prijungtą N-galinį HisTag (paryškinta) ir yra tokia:
[0048]
[0049] Alkilbromidai, skirti naudoti čia aprašytuose būduose, turi funkcinę arba reporterinę grupę, kuri gali būti pernešta aukščiau aprašyto fermento ant AdoHcy arba Se-AdoHcy.
[0050] 6-azido-1-bromheks-2-ino (R-Hal1) sintezė
[0051]
[0052] 6-chlorheks-2-in-1-olis. Maišomas sauso THF (120 ml) ir 5-chlor-1-pentino (10 ml, 94,4 mmol) tirpalas argono aplinkoje atšaldomas iki -78 °C. Tada pridedama 2,5 M butiličio tirpalo heksanuose (37,8 ml, 93 mmol) ir maišoma 30 min. Po to į reakcijos mišinį suberiamas paraformas (3,36 g, 104 mmol) ir maišoma dar 30 min. Tada aušinimo vonia pašalinama ir reakcijos indas paliekamas sušilti iki kambario temperatūros. Reakcija sustabdoma įpylus 100 ml šalto (0 °C) vandens. Mišinys supilamas į dalijamąjį piltuvą, organinė fazė atskiriama. Vandeninis sluoksnis ekstrahuotas dietileteriu (2 x 40 ml). Organiniai sluoksniai sujungiami, džiovinami natrio sulfatu ir išgarinami. Produktas buvo gryninamas distiliuojant vakuume. Gaunama bespalvė alyva (9,51 g; 76 %). 1H BMR (400 MHz, CDCl3): 1,98 (m, 3H, CH2CH2CH2 + OH); 2,44 (tt, 2H, 3J = 6,3 Hz, 5J = 2,1 Hz, C≡CCH2); 3,67 (t, 2H, 3J = 6,3 Hz, CH2Cl); 4,27 (t, 2H, 5J = 2,1 Hz, CH2OH).
[0053] 6-azidoheks-2-in-1-olis. Į maišomą 6-chlorheks-2-in-1-olio (2,266 g, 2 ml, 17,1 mmol, 1 ekv.) tirpalą DMF (15 ml) suberiama natrio azido (3,33 g, 51,3 mmol; 3 ekv.) ir tetrabutilamonio bromide (0,551 g, 1,71 mmol).
[0054]
[0055] Reakcijos mišinys buvo maišomas 24 valandas 80 °C temperatūroje (smėlio vonia). Tada sumažintame slėgyje pašalinamas DMF ir įpilama 20 ml vandens. Produktas ekstrahuotas dietilo eteriu (3 x 30 ml), organiniai sluoksniai sujungiami, džiovinami natrio sulfatu ir tirpiklis išgarinamas. Produktas gryninamas sausos kolonėlinės vakuuminės chromatografijos būdu (DCVC), iš pradžių eliuuojant CH2Cl2, o po to CH2Cl2:EtOAc (20:1). Gaunama bespalvė alyva (2,13 g; 90%). 1H BMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,78 (m, 3H, CH2CH2CH2 + OH); 2,34 (tt, 2H, 3J = 6,9 Hz, 5J = 2,4 Hz, C≡CCH2); 3,41 (t, 3J = 6,9 Hz, 2H, CH2N3); 4,24 (t, 2H, 5J = 2,4 Hz, CH2OH). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 16,04; 27,69; 50,16; 51,12; 79,49; 84,36.
[0056]
[0057] 6-azidoheks-2-in-1-ilo 4-metilbenzensulfonatas. Argonu užpildytoje apvaliadugnėje kolboje 6-azidoheks-2-in-1-olis (800 mg; 5,75 mmol; 1 ekv.) ištirpinamas 15 ml THF ir mišinys atšaldomas iki 0 °C (ledo vonia). Įberiama kalio tret-butoksido (632 mg; 5,63 mmol; 0,98 ekv.), tada po 5 min. įberiama 4-metilbenzensulfonilchlorido (1,10 g; 5,75 mmol; 1 ekv.) ir maišoma. Po 1 valandos tirpiklis išgarinamas rotaciniu garintuvu. Į likutį įpilama 40 ml dietileterio, organinis sluoksnis plaunamas 20 ml sotaus NaHCO3, tada 20 ml sočiojo natrio chlorido tirpalu. Organinė faze džiovinama bevandeniu Na2SO4, filtruojama ir išgarinama rotaciniu garintuvu. Likutis gryninamas kolonėlinės chromatografijos būdu, naudojant tolueną kaip eliuentą. 1H BMR (400 MHz, CDCl3): δ 2,46 (s, 3H, CH3); 3,48 (t, J = 5,1 Hz, 2H, CH2N3); 5,16 (t, J = 5,1 Hz, 2H, CH2O); 7,37 (d, J = 8,2 Hz, 2H, Ar3-H); 7,81 (d, J = 8,2 Hz, 2H, Ar2-H) NMR (100 MHz, CDCl3): δ 21,8; 49,7; 68,2; 280 128,1; 130,1; 132,7; 145,4.
[0058]
[0059] 6-azido-1-bromheks-2-inas. 6-azidoheks-2-in-1-il-4-metilbenzensulfonatas (1,40 g; 4,71 mmol; 1 ekv.) ir ličio bromidas (2,07 g; 23,8 mmol; 5 ekv.) ištirpinami 50 ml acetono apvaliadugnėje kolboje. Reakcijos mišinys virinamas 18 valandų esant grįžtamajam šaldytuvui. Po reakcijos acetonas rotaciniu garintuvu išgarinamas sumažintame slėgyje, ne žemiau 100 mbar. Į likutį įpilama 30 ml vandens ir ekstrahuojama dietileteriu (3 x 20 ml), organiniai sluoksniai apjungiami, džiovinami bevandeniu MgSO4, filtruojama, dietileteris išgarinamas sumažintame slėgyje. Produktas gryninamas sausos kolonėlinės vakuuminės chromatografijos būdu (DCVC), naudojant petrolio eterį, po to produktas eliuuojamas PE:DCM (3:1). Frakcijos, kuriose yra produktas, apjungiamos, o tirpikliai išgarinami sumažintame slėgyje naudojant rotacinį garintuvą. Produktas džiovinamas 50 mbar slėgyje. Gaunama bespalvė alyva (810 mg; 84%). 1H BMR (400 MHz, CDCl3): δ 1,79 (q, J = 6,8 Hz, 2H, CH2CH2CH2); 2,32-2,41 (m, 2H, C≡CCH2CH2); 3,41 (t, J = 6,8 Hz, 2H, CH2N3); 3,88-3,95 (m, 2H, CH2Br). 13C BMR (100 MHz, CDCl3): δ 15,2; 16,3; 27,6; 295 50,1; 76,5; 86,1.
[0060] 3-(2-brometil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazino (R-Hal2) sintezė.
[0061]
[0062] 2-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)etan-1-olis. 3-hidroksipropannitrilas (2,00 g; 1,87 ml; 28,1 mmol; 1 ekv.), acetonitrilas (9,24 g; 11,8 ml; 0,255 mol; 8 ekv.), 3-merkaptopropano rūgštis (2,99 g; 2,45 ml; 28,1 mmol; 1 ekv.) ir hidrazino hidratas (22,54 g; 21,84 ml; 0,450 mol; 16 ekv.) sumaišomi apvaliadugnėje kolboje ir tirpalas maišomas 18 valandų. Po to mišinys supilamas į 500 ml apvaliadugnę kolbą, atšaldomas ledo vonioje iki 0 °C ir įpilama natrio nitrito (29,12 g; 0,422 mol; 15 ekv.) tirpalo vandenyje (80 ml). Stipriai maišant, lašintuvu lėtai pilama 3M HCl (apie 250 ml per 2 valandas), kol nutrūksta dujų išsiskyrimas ir reakcijos pH nukrenta žemiau <3. Vandeninis tirpalas išgarinamas rotaciniu garintuvu 55 °C temperatūroje sumažintame slėgyje. Likę rausvi kristalai plaunami DCM (4 × 50 ml). Organinis sluoksnis džiovinamas bevandeniu Na2SO4, filtruojamas, tirpiklis išgarinamas rotaciniu garintuvu. Likutis gryninamas kolonėline chromatografija, eliuentu naudojant DCM:MeOH (40:1) mišinį. Gaunama purpurinė alyva (1,48 g; 37%). 1H BMR (400 MHz, CDCl3): δ 2,37 (pl. s, 1H, OH); 3,05 (s, 3H, CH3); 3,55 (t, J = 5,8 Hz, 2H, CH2CH2OH); 4,24 (t, J = 5,8 Hz, 2H, CH2CH2OH). 13C BMR (100 MHz, CDCl3): δ 21,1; 37,4; 60,0; 167,8; 168,3.
[0063]
[0064] 2-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)etilmetansulfonatas. 2-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)etan-1-olis (782 mg; 5,58 mmol; 1 ekv.) ir metansulfonilchloridas (1 28 g; 864 µl; 11,2 mmol; 2 ekv.) ištirpinami 30 ml DCM apvaliadugnėje kolboje. Paruoštas tirpalas atšaldomas iki 0 °C ledo vonioje, įpilama trietilamino (1,13 g; 1,56 ml; 11,2 mmol; 2 ekv.) ir maišoma ledo vonioje 10 minučių. Po to ledo vonelė pašalinama ir mišinys papildomai maišomas 20 min. kambario temperatūroje. Reakcijos mišinys plaunamas 20 ml sotaus NaHCO3 ir 20 ml sotaus natrio chlorido tirpalais. Organinė faze džiovinama bevandeniu MgSO4, filtruojama. Organinė fazė supilama į apvaliadugnę kolbą ir įberiama 10 ml silicio dioksido. Mišinys rotaciniu garintuvu išgarinamas, produktas lieka absorbuotas ant silicio dioksido. Produktas gryninamas sausos kolonėlinės vakuuminės chromatografijos būdu (DCVC), pirmiausia eliuuojant šalutinį produktą DCM, po to tikslinį produktą eliuuojant
[0065]
[0066] DCM:MeOH (50:1) mišiniu. Gaunama purpurinė alyva (1,08 g; 89 %). 1H BMR (400 MHz, CDCl3): δ 3,02 (s, 3H, SCH3); 3,07 (s, 3H, CCH3); 3,76 (t, J = 6,2 Hz, 2H; CCH2); 4,87 (t, J = 6,2 Hz, 2H, OCH2). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 21,3; 34,7; 37,7; 66,1; 166,2; 168,3.
[0067] 3-(2-brometil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazinas. 2-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)etilmetansulfonatas (208 mg; 0,953 mmol; 1 ekv.), ličio bromidas (414 mg; 4,77). mmol; 5 ekv.) ištirpinamas 10 ml acetone apvaliadugnėje kolboje. Mišinys virinamas 3 valandas esant grįžtamajam šaldytuvui, po to rotaciniu garintuvu pašalinamas acetonas. Į likutį įpilama 20 ml dietileterio, organinis sluoksnis plaunamas 10 ml sotaus NaHCO3 ir 10 ml sotaus natrio chlorido tirpalais. Organinė faze džiovinama bevandeniu Na2SO4, filtruojama, o tirpiklis išgarinamas rotaciniu garintuvu. Produktas gryninamas kolonėlinės chromatografijos būdu, naudojant DCM kaip eliuentą. Gaunama purpurinė alyva (181 mg; 95%). 1H BMR (400 MHz, CDCl3): δ 3,07 (s, 3H, CH3); 3,89 (t, J = 6,2 Hz, 2H, CCH2); 3,97 (t, J = 6,2 Hz, 2H, CH2Br). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 21,3; 28,2; 37,8;167,4; 168,2.
[0068] Chemofermentiniu metodu susintetinti kofaktoriai
[0069] Čia aprašytais būdais pagaminti kofaktoriai yra pagrįsti S-adenozil-L-metionino (AdoMet) molekulės struktūra ir yra S-adenozil-L-metionino arba Se-adenozil-L-selenometionino analogai, turintys funkcinę grupę struktūriniame fragmente, kuris gali būti perneštas ant taikinio.
[0070] Šie AdoMet analogai gali turėti tokią struktūrinę formulę:
[0071]
[0072]
[0073] n = 0-4
[0074] Z= S, Se
[0075] X= N3, C≡CH, NH2, 4-Y-2,3,5,6-tetrazin-1-il, 4-(4'Y-2,3,5,6-tetrazin-1'-il)-W-1-il
[0076] kur
[0077] W= para-arilenas, kurio struktūrą sudaro bet koks skaičius ir bet koks šių struktūros element derinys: N, CH, C-Oalkil (C1-C12).
[0078] Y= H, CH3, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2, CH2CH3, CH(CH3)2, CH2CH2CH3, fenil, 4-CH3Ofenil, 3,4-diCH3Ofenil, 2,6-diCH3Ofenil.
[0079] Vienas iš variantų yra I formulės junginys, kur n=2, Z= S ir X= N3 (Ado-6-azido kofaktorius aprašytas Pav. 2).
[0080] Kiti I formulės junginių variantai, kur n=2, Z= S ir X= C≡CH arba NH2.
[0081] Kito I formulės junginio variantas yra, kur n=0, Z= S ir X= 4-(4'Y-2,3,5,6-tetrazin-1'-il)-W-1-il, W=para-fenil ir Y= CH3.
[0082] Vienas iš II formulės junginio variantų yra, kur n= 1, Z= S, X= 4-Y-2,3,5,6-tetrazin-1-il ir Y= CH3 (Ado-2-Tet kofaktorius aprašytas Pav. 3).
[0083] Kitas II formulės junginio variantas yra, kur n= 1, Z= S, X= 4-(4'Y-2,3,5,6-tetrazin-1'-il)-W-1-il, W=para-fenil ir Y= CH3.
[0084]
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090] Literatūros sąrašas
[0091] Bengel LL, Aberle B, Egler-Kemmerer A-N, Kienzle S, Hauer B, Hammer SC. 380 2021. Engineered Enzymes Enable Selective N-Alkylation of Pyrazoles With Simple Haloalkanes. Angew Chem Int Ed Engl 60: 5554–5560.
[0092] Bennett MR, Shepherd SA, Cronin VA, Micklefield J. 2017. Recent advances in methyltransferase biocatalysis. Curr Opin Chem Biol 37: 97–106.
[0093] Davis TD, Kunakom S, Burkart MD, Eustaquio AS. 2018. Preparation, Assay, and Application of Chlorinase SalL for the Chemoenzymatic Synthesis of S-Adenosyl-l-Methionine and Analogs. Methods Enzymol 604: 367–388.
[0094] Doyon TJ, Narayan ARH. 2020. Synthetic utility of one-pot chemoenzymatic reaction sequences. Synlett Acc Rapid Commun Synth Org Chem 31: 230–236.
[0095] Hartstock K, Nilges BS, Ovcharenko A, Cornelissen NV, Püllen N, Lawrence-Dörner A-M, Leidel SA, Rentmeister A. 2018. Enzymatic or In Vivo Installation of Propargyl Groups in Combination with Click Chemistry for the Enrichment and Detection of Methyltransferase Target Sites in RNA. Angew Chem Int Ed Engl 57: 6342–6346.
[0096] Hoffmann A, Schülke KH, Hammer SC, Rentmeister A, Cornelissen NV. 2023. Comparative S395 adenosyl-L-methionine analogue generation for selective biocatalytic Friedel-Crafts alkylation. Chem Commun Camb Engl.
[0097] Huber TD, Clinger JA, Liu Y, Xu W, Miller MD, Phillips GN, Thorson JS. 2020. Methionine Adenosyltransferase Engineering to Enable Bioorthogonal Platforms for AdoMet-Utilizing Enzymes. ACS Chem Biol 15: 695–705.
[0098] Kunjapur AM, Hyun JC, Prather KLJ. 2016. Deregulation of S-adenosylmethionine biosynthesis and regeneration improves methylation in the E. coli de novo vanillin biosynthesis pathway. Microb Cell Factories 15: 61.
[0099] Liao C, Seebeck FP. 2020. Asymmetric β-Methylation of l- and d-α-Amino Acids by a Self- Contained Enzyme Cascade. Angew Chem Int Ed Engl 59: 7184–7187.
[0100] Liao C, Seebeck FP. 2019. S -adenosylhomocysteine as a methyl transfer catalyst in biocatalytic methylation reactions. Nat Catal 2: 696–701.
[0101] Lukinavičius G., Lapinaitė A., Urbanavičiūtė G., Gerasimaitė R., Klimašauskas S. 2012. Nucleic Acids Res, 40: 11594–11602.
[0102] Lukinavičius G, Tomkuvienė M, Masevičius V, Klimašauskas S. 2013. Enhanced Chemical Stability of AdoMet Analogues for Improved Methyltransferase-Directed Labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8: 1134−1139.
[0103] Mickutė M, Kvederavičiūtė K, Osipenko A, Mineikaitė R, Klimašauskas S, Vilkaitis G. 2021. Methyltransferase-directed orthogonal tagging and sequencing of miRNAs and bacterial small RNAs. BMC Biol 19: 129.
[0104] Mo X, Gui C, Wang Q. 2017. Elucidation of a carboxylate O-methyltransferase 415 NcmP in nocamycin biosynthetic pathway. Bioorg Med Chem Lett 27: 4431–4435.
[0105] Moore LD, Le T, Fan G. 2013. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol Off Publ Am Coll Neuropsychopharmacol 38: 23–38.
[0106] Mordhorst S, Siegrist J, Müller M, Richter M, Andexer JN. 2017. Catalytic Alkylation Using a Cyclic S-Adenosylmethionine Regeneration System. Angew Chem Int Ed Engl 56: 4037–4041.
[0107] Oliveira BL, Guo Z, Bernardes GJL. 2017. Inverse electron demand Diels-Alder reactions in chemical biology. Chem Soc Rev 46: 4895–4950.
[0108] Osipenko A, Plotnikova A, Nainytė M, Masevičius V, Klimašauskas S, Vilkaitis G. 2017.
[0109] Oligonucleotide-Addressed Covalent 3'-Terminal Derivatization of Small RNA Strands for Enrichment and Visualization. Angew Chem Int Ed Engl 56: 6507–6510.
[0110] Schülke KH, Ospina F, Hörnschemeyer K, Gergel S, Hammer SC. 2022. Substrate Profiling of Anion Methyltransferases for Promiscuous Synthesis of S-Adenosylmethionine Analogs from Haloalkanes. Chembiochem Eur J Chem Biol 23: e202100632.
[0111] Shu X, Cao J, Cheng M, Xiang S, Gao M, Li T, Ying X, Wang F, Yue Y, Lu Z, et al. 2020. A metabolic labeling method detects m6A transcriptome-wide at single base resolution. Nat Chem Biol 16: 887–895.
[0112] Stankevičius V, Gibas P, Masiulionytė B, Gasiulė L, Masevičius V, Klimašauskas S, Vilkaitis G. 2022. Selective chemical tracking of Dnmt1 catalytic activity in live cells. Mol Cell 82: 1053-1065.e8.
[0113] Staševskij Z, Gibas P, Gordevičius J, Kriukienė E, Klimašauskas S. 2017. Tethered Oligonucleotide-Primed Sequencing, TOP-Seq: A High-Resolution Economical Approach for DNA Epigenome Profiling. Mol Cell 65: 554-564.e6.
[0114] Struck A-W, Thompson ML, Wong LS, Micklefield J. 2012. S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. Chembiochem Eur J Chem Biol 13: 2642–2655.
[0115] Tang Q, Grathwol CW, Aslan-Üzel AS, Wu S, Link A, Pavlidis IV, Badenhorst CPS, Bornscheuer UT. 2021a. Directed Evolution of a Halide Methyltransferase Enables Biocatalytic Synthesis of Diverse SAM Analogs. Angew Chem Int Ed 60: 1524–1527.
[0116] Tang Q, Pavlidis IV, Badenhorst CPS, Bornscheuer UT. 2021b. From Natural Methylation to Versatile Alkylations Using Halide Methyltransferases. Chembiochem Eur J Chem Biol 22: 2584–2590.
[0117] Thomsen M, Vogensen SB, Buchardt J, Burkart MD, Clausen RP. 2013. Chemoenzymatic synthesis and in situ application of S-adenosyl-L-methionine analogs. Org Biomol Chem 11: 7606–7610.
[0118] Tomkuvienė M, Mickutė M, Vilkaitis G, Klimašauskas S. 2019. Repurposing enzymatic transferase reactions for targeted labeling and analysis of DNA and RNA. Curr Opin Biotechnol 55: 114–123.
[0119] Zhang C, Sultan SA, T R, Chen X. 2021. Biotechnological applications of S-adenosyl-methioninedependent methyltransferases for natural products biosynthesis and diversification. Bioresour 455 Bioprocess 8: 72.
1. Chemofermentinis S-adenozil-L-metionino (AdoMet) analogų, turinčių prailgintus struktūrinius fragmentus su funkcine grupe arba reporterine grupe, gavimo būdas, naudojant I ir II formulių junginius
būdas, apimantis III formulės AdoMet pirmtako molekulės reakciją
su alkilhalogenidu R-Hal ir halidine metiltransferaze (HMT) tokiomis sąlygomis, kurios tinkamos AdoHcy arba SeAdoHcy paversti į AdoMet analogus,
kur
n yra 0, 1, 2, 3 arba 4
Z yra S arba Se
X yra funkcinė arba reporterinė grupė
R yra CH2-(CH2)n-X arba CH2-C≡C-(CH2)n-X.
2. Būdas pagal 1 punktą, kur X yra N3, C≡CH, NH2 arba 4-Y-2,3,5,6-tetrazin-1-il, 4-(4'Y-2,3,5,6-tetrazin-1'-il)-W-1-il
kur
W yra para-arilenas, kurio struktūrą sudaro bet koks skaičius ir bet koks šių struktūros elementų derinys: N, CH, C-Oalkil (C1-C12),
Y yra H, CH3, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2, CH2CH3, CH(CH3)2, CH2CH2CH3, fenil, 4-CH3Ofenil, 3,4-diCH3Ofenil arba 2,6-diCH3Ofenil.
3. Būdas pagal 1 punktą, kur AdoHcy arba SeAdoHcy modifikacija yra katalizuojama Aspergillus clavatus halidine metiltransferaze (HMT).
4. Būdas pagal 1 punktą, kur R-Hal yra alkilbromidas.
5. Būdas pagal 1 punktą, kur R-Hal yra 6-azido-1-bromheks-2-inas (R-Hal1) arba 3-(2-bromoetil)-6-metil-1,2,4,5-tetrazinas (R-Hal2).
6. Būdas pagal bet kurį iš 1-3 punktų, kur būdas apima 10 molinių ekvivalentų alkilhalogenido, 0,1 molinių ekvivalentų HMT ir 1 molinių ekvivalentų AdoMet pirmtako molekulės inkubavimą 25°C temperatūroje ir 6,5 pH nuo 0,5 iki 1 h.
7. Būdas pagal bet kurį iš 1-3 punktų, kur būdas apima 10 molinių ekvivalentų alkilbromido, 0,1 molinių ekvivalentų HMT ir 1 molinių ekvivalentų AdoMet pirmtako molekulės inkubavimą 25°C temperatūroje ir 6,5 pH nuo 0,5 iki 1 h.
8. AdoMet analogas, pagal formulę II
kur
n yra 0, 1, 2, 3 arba 4
Z yra S arba Se
X yra N3, C≡CH, NH2, arba 4-Y-2,3,5,6-tetrazin-1-il, 4-(4'Y-2,3,5,6-tetrazin-1'-il)-W-1-il
kur
W yra para-arilenas, kurio struktūrą sudaro bet koks skaičius ir bet koks šių struktūros elementų derinys: N, CH, C-Oalkil (C1-C12),
Y yra H, CH3, OCH3, NH2, NHCH3, N(CH3)2, CH2CH3, CH(CH3)2, CH2CH2CH3, fenil, 4-CH3Ofenil, 3,4-diCH3Ofenil, arba 2,6-diCH3Ofenil.
9. AdoMet analogas, gautas būdu pagal vieną iš 1-7 punktų, ir turintis struktūrinę formulę II,
kur
a) n yra 1, Z yra S, X yra 4-Y-2,3,5,6-tetrazin-1-il ir Y= CH3; arba
b) n yra 1, Z yra S, X yra 4-(4'Y-2,3,5,6-tetrazin-1'-il)-W-1-il, W= para-fenil ir Y= CH3.
10. AdoMet I ir II analogai pagal 1-9 punktus naudojami kaip nuo AdoMet-priklausomų metiltransferazių kofaktoriai.
11. AdoMet II analogai pagal 1-10 punktus naudojami specifinių taikinių ant baltymų, RNR ar DNR selektyviam žymėjimui, naudojant atitinkamas nuo AdoMet-priklausomas metiltransferazes.