[LT] Išradimas priklauso baltymų biotechnologijos sričiai. Čia aprašomi nauji monokloniniai antikūnai prieš paprastojo karpio β-enolazę ir juos produkuojančios hibridomos ląstelės. Monokloniniai antikūnai gali būti panaudojami karpio ir kitų žuvų baltymų aptikimui maisto produktuose, bei komercinių karpio ekstraktų identifikavimui.
[EN] The invention belongs to the field of protein biotechnology. Novel monoclonal antibodies against common carp β-enolase and the hybridoma cells producing them are described. Monoclonal antibodies can be used for the detection of carp and other fish proteins in food products, and for the identification of commercial carp extracts.
[0001] TECHNIKOS SRITIS
[0002] Išradimas priskirtinas baltymų biotechnologijos sričiai. Jis aprašo naujų monokloninių antikūnų prieš paprastojo karpio β-enolazę, sukūrimą.
[0003] TECHNIKOS LYGIS
[0004] Enolazė (fosfopiruvato hidratazė, EC 4.2.1.11) yra metalofermentas, dalyvaujantis gliukozės metabolizme, kurio metu katalizuoja 2-fosfoglicerato virtimą fosfoenolpiruvatu [Nakagawa and Nagayama. Comp. Biochem. Physiol. 1991, 98B, pp. 355-359; Díaz-Ramos et al. J Biomed Biotechnol. 2012]. Fermentas yra aptinkamas mikroorganizmuose ir žinduoliuose, o jo aminorūgščių seka tarp skirtingų rūšių sutampa daugiau nei 50% [Witkowska et al. FEMS Immunol Med Microbiol. 2005, 45, pp. 53-62]. Enolazė yra tyrinėta ir išgryninta iš įvairių organizmų: iš žmogaus, vištos, triušio, vaivorykštinio upėtakio, žiurkės raumenų; iš mielių: Saccharomyces cerevisiae; iš augalų: bulvių ir špinatų, ir išskirtingų bakterijų: Escherichia coli, Chloroflexus aurantiacus, Thermus aquaticus ir kitų [Van der Straetenet al. Plant Cell. 1991, 3, pp. 719-735; Nakagawa and Nagayama. Comp. Biochem. Physiol. 1991, 98B, pp. 355-359; Zadvornyy et al. Front BioengBiotechnol. 2015, 3]. Stuburiniuose gyvūnuose enolazė yra aktyvus dimeras (subvieneto molekulinė masė apie 50 kDa) ir yra aptinkama trijų izoformų: α, β ir γ [Kleine-Tebbe and Jakob, Springer. 2015, pp.383-384]. α-Enolazė (Eno1) yra ekspresuojama daugelyje audinių, β-enolazė (Eno3) daugiausia randama raumenų audiniuose ir γ-enolazė (Eno2) aptinkama neuronuose ir neuroendokrininiuose audiniuose [Díaz-Ramos et al. J Biomed Biotechnol. 2012]. 1983 m. iš paprastojo karpio buvo pirmą kartą išgryninta ir apibūdinta β-enolazė [Pietkiewicz et al. Comp. Biochem. Physiol. 1983, 75B, pp. 693-698].
[0005] Žuvis yra vienas iš pagrindinių maisto alergenų, sukeliančių alergijas daugiau nei 1% viso pasaulio gyventojų. Yra žinoma, kad pacientai gali būti alergiški vienai specifiniai žuviai arba įsijautrinę kelioms skirtingoms žuvų rūšims. Alergijos simptomai (dilgėlinė, viduriavimas, vėmimas, bronchų susiaurėjimas ir kt.) gali paveikti pacientų odą, kvėpavimo takus ir virškinamąjį traktą ne tik suvalgius žuvies bet ir gaminant žuvies patiekalus. Yra atvejų, kuomet žuvis gali sukelti žmogui ir sunkią alerginę reakciją – anafilaksiją. Žuvų alergenai yra parvalbuminai, enolazės, aldolazės, kolagenas, tropomiozinai ir vitelogeninai [Kleine-Tebbe and Jakob. Springer. 2015, pp. 381-394; Matricardi et al. John Wiley & Sons Ltd. 2016, pp. 173-177]. 2003 m. β-enolazė (50 kDa) ir aldolazė (40 kDa) buvo apibūdinti kaip nauji žuvies alergenai, išgryninti iš Atlantinės menkės, lašišos ir tuno. Kaip parvalbuminai, jie buvo aptikti žuvies raumenyse ir pasirodė esantys jautrūs terminiam apdorojimui. Taikant imunofermentinės analizės (IFA) metodą buvo atliktas imunoglobulino E (IgE) inhibicijos eksperimentas, kuris parodė galimą tarp rūšinį kryžminį reaktyvumą tarp atrastų β-enolazių ir aldolazių [Kuehn et al. Clinical Et Experimental Allergy. 2013, pp. 811-822]. Šiuo metu yra žinomos penkios β-enolazės, išskirtos iš Atlantinės menkės (Gad m 2), vištos (Gal d 9), dryžuoto šamo (Pan h 2), Atlantinės lašišos (Sal s 2) ir geltonpelekio tuno (Thu a 2), kurie yra pripažinti alergenais Pasaulio sveikatos organizacijos ir Tarptautinės imunologinių draugijų sąjungos.
[0006] Gydant alergiją žuviai pacientams yra patariama visiškai vengti žuvies valgymo, nors dalis jų galėtų valgyti tik tam tikras žuvų rūšis. Svarbus žingsnis, siekiant pagerinti kiekvieno paciento gyvenimo kokybę, yra nustatyti konkrečią žuvį ir jos specifinį alergeną, kuriam pacientas yra alergiškas [Kleine-Tebbe and Jakob. Springer. 2015, pp. 381-94]. Asmuo, kuris buvo įsijautrinęs menkei ir Nilo ešeriui, galėjo toleruoti lašišą ir tuną, kadangi jis buvo alergiškas tik menkės ir Nilo ešerio β-enolazėms ir aldolazėms [Kuehn et al. Letter Ann Allergy Astma Immunol. 2014]. Žuvų ekstraktai yra baltymų mišiniai, išskirti iš žuvies raumens, filė ar visos žuvies. Šie ekstraktai yra naudojami odos dūrio testuose, nustatant pacientams įsijautrinimą žuviai [Ruethers et al. Allergy. 2019, 74, 1352-1363]. Tačiau tokie natūralūs ekstraktai pasižymi keliais trūkumais, lemiančiais jų prastą kokybę: sudėtyje yra neištirtų nealerginių medžiagų, teršalų, proteazių, nedidelė pagrindinio alergeno koncentracija ir t.t. Išsamesnis alergeno ekstrakto apibūdinimas ir standartizuotas jo paruošimas iš natūralaus šaltinio galėtų pagerinti ekstrakto saugumą ir efektyvumą alergijos diagnostikoje [Valenta et al. J Allergy Clin Immunol Pract. 2018, 6, pp. 1845–1855].
[0007] Hibridomų technologija yra plačiai taikomas metodas skirtas monokloninių antikūnų (MAk) kūrimui. MAk gebėjimas atpažinti ir prisijungti prie specifinės antigeno srities, leidžia juos pritaikyti vėžio, autoimuninių ligų ir alerginių ligų (astma ir atopinis dermatitas) terapijoje [Landolina and Levi-Schaffer. Br J Pharmacol. 2016, 173(5), pp. 793-803; Chandrasekaran and Sivakumaran. International Journal of Scientific and Research Publications. 2018, 8, pp. 319-338]. MAk, sukurti prieš konkretų alergeno komponentą, galėtų būti pritaikyti alergeno ekstrakto standartizavimui, t.y. aptikti ir įvertinti komponento kiekį pačiame ekstrakte. Keliems šakotosios sienžolės (lot. Parietaria judaica) alergeno komponentams specifiniai MAk buvo panaudoti siekiant standartizuoti iš šakotosios sienžolės išskirtą ekstraktą. Tuo tarpu MAk prieš Der p 1 ir Der f 1 buvo pritaikyti įvertinant šių komponentų kiekį komerciniuose namų dulkių erkių, atitinkamai, Dermatophagoides pteronyssinus ir Dermatophagoides farinae ekstraktuose [Afferni et al. Biologicals. 1995, 23, pp. 239–247, Chapman et al., J Allergy Clin Immunol. 1987, 80(2), pp. 184-194]. Taip pat alergenams specifiniai MAk gali būti pritaikyti alergenų, tokių kaip β-laktoglobulino, kazeino, ovalbumino, lizocimo, parvalbumino, tropomiozino ir kt., aptikimui maisto produktuose, kurie galėtų sukelti gyvybei pavojingą reakciją (anafilaksinį šoką) jautresniems asmenims [Sharma et al. Food and Drug Administration Papers. 2017, 6, pp. 65-121]. Kalbant apie alergiją žuviai, polikloniniai antikūnai prieš Atlantinės menkės parvalbuminą buvo pritaikyti kuriant dviepitopę IFA sistemą, skirtą žuvies nustatymui maisto produktuose [Fæste and Plassen. Journal of Immunological Methods. 2018, 329, pp. 45-55]. Keletas komercinių IFA rinkinių yra sukurti kiekybiniam žuvies parvalbumino įvertinimui maisto produktuose, tokiuose kaip vyne, sriuboje, padažuose, krekeriuose, surime ir kt.
[0008] Paprastasis karpis (lot. Cyprinus carpio) yra viena iš dažniausiai valgomų ir studijuojamų žuvies rūšių. Buvo parodyta, kad karpio parvalbuminas turi tam tikrus IgE epitopus, kurie yra aptinkami ir kitų rūšių žuvyse, todėl manoma, kad šis alergenas galėtų būti pritaikytas in vitro ir in vivo žuvies alergijos nustatymui [Sharp and Lopata. Clin Rev Allergy Immunol. 2014, 46(3), pp. 258-271, Swoboda et al. J Immunol. 2002, 168, pp. 4576-4584]. Nors parvalbuminai yra laikomi pagrindiniais žuvų alergenais, tyrimai parodė, kad pacientai yra įsijautrinę ir kitiems žuvų alergenams: β-enolazei ir aldolazei [Kuehn et al. Clinical Et Experimental Allergy. 2013, pp. 811-822]. Neseniai paprastojo karpio β-enolazė oficialiai pripažinta alergenu ir užregistruota Cyp c 2 pavadinimu WHO/IUIS alergenų nomenklatūros duomenų bazėje http://www.allergen.org/index.php.
[0009] Nėra informacijos apie monokloninių antikūnų prieš paprastojo karpio β-enolazę kūrimą. Sukurti MAk yra prieš žmogaus α-enolazę [US9382331B2, publ. 2016], prieš Aspergillus fumigatus ląstelių paviršiuje esančią enolazę [Yadav and Shukla. FEMS Microbiology Letters. 2019, 366], prieš streptokoko paviršiaus enolazę [Fontán et al. J Infect Dis. 2000, 182, pp. 1712-1721], prieš pjautuvinio plazmodijaus (lot. Plasmodium falciparum) enolazę [Pal-Bhowmick et al. J Vect Borne Dis. 2006, 43, pp. 43–52], prieš Chaetomium globosum enolazę [Green-BJ. Monoclonal antibodies in immunodiagnosis and immunotherapy. 2014, 33] ir prieš žmogaus neuronams būdingą enolazę (NSE, γ-enolase) [Frikke et al. Brain Res. 1987, 417, pp. 283-292; Seshi and Bell CE. Hybridoma. 1985, 4 pp. 13-25].
[0010] Aukščiau pateikta informacija siūlo, kad MAk prieš paprastojo karpio β-enolazę kūrimas galėtų tapti įrankiu, skirtu išsamesniam alergeno apibūdinimui ir būti pritaikytam standartizuoti natūralius karpio ir kitų žuvų ekstraktus ar maisto produktus, naudojamus nustatant pacientų alergiją žuviai.
[0011] IŠRADIMO ESMĖ
[0012] Išradimo tikslas buvo sukurti naujas hibridinių ląstelių linijas, sekretuojančias monokloninius antikūnus prieš paprastojo karpio β-enolazę.
[0013] Šis išradimas pateikia dvi naujas hibridinių ląstelių linijas: 14F3 ir 6E4, kurios sekretuoja MAk prieš β-enolazę. Antikūnai atpažįsta rekombinantinę paprastojo karpio β-enolazę, sulietą su maltozę surišančiu baltymu (MBP), susintetintą E. coli bakterijose. MAk 6E4 taip pat sąveikauja su β-enolaze, esančia komerciniuose karpio ir kitų žuvų rūšių ekstraktuose, bei laboratorijos sąlygomis paruoštame karpio ekstrakte.
[0014] Pateikiamas išradimas, kur monokloniniai antikūnai atpažįsta tokią aminorūgščių seką SEQ ID Nr.1
[0015]
[0016] arba panašias aminorūgščių sekas, kurių identiškumas yra daugiau nei 60%, pageidautina bent 95%.
[0017] Tinkamiausias šio išradimo įgyvendinimo variantas pateikia išsamesnį β-enolazės, kaip alergeno, apibūdinimą, naujai sukurtais monokloniniais antikūnais.
[0018] Kitas pageidaujamas šio išradimo įgyvendinimo variantas yra monokloninių antikūnų pritaikymas β-enolazės aptikimui maisto produktuose arba komerciniuose karpio ekstraktuose.
[0019] Pabaigai, išradimas pateikia galimą monokloninių antikūnų pritaikymą kuriant diagnostinį rinkinį, skirtą β-enolazės aptikimui maisto produktuose arba komerciniuose karpio ekstraktuose.
[0020] Šiame išradime siūlomi monokloniniai antikūnai yra nauji ir skiriasi nuo analogų iš kitų šaltinių bei anksčiau aprašytų monokloninių antikūnų.
[0021] Toliau išradimas yra aprašomas išsamiau, su nuorodomis į pridedamus paveikslus ir pavyzdžius.
[0022] TRUMPAS PAVEIKSLŲ APRAŠYMAS
[0023] 1 pav. pavaizduotas PGR klonų analizės vaizdas.
[0024] 2 pav. pavaizduotas baltymų elektroforezės gelio vaizdas, gautas išanalizavus mėginius po MBP-Eno raiškos indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose ir patikrinus tirpią ir netirpią ląstelių lizato frakcijas.
[0025] 3 pav. pavaizduotas baltymų elektroforezės vaizdas, gautas išanalizavus išgrynintą rekombinantinį MBP-Eno baltymą, naudojant MBP Trap HP kolonėlę su "Dextrin Sepharose High Performance" sorbentu.
[0026] 4 pav. pavaizduotas imunoblotingo vaizdas, gautas su rekombinantiniu paprastojo karpio MBP-Eno baltymu, rekombinantiniu Eno (atskeltas nuo MBP-Eno su TEV proteaze) baltymu, rekombinantiniu MBP baltymu ir E. coli Tuner (DE3) ląstelių lizatu, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0027] 5 pav. pavaizduotas imunoblotingo vaizdas, gautas su komerciniais žuvų ekstraktais, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0028] 6 pav. pavaizduotas imunoblotingo vaizdas, gautas su rekombinantiniu paprastojo karpio MBP-Eno baltymu, komerciniu karpio ekstraktu (DST), laboratorijoje paruoštu natūraliu karpio ekstraktu ir rekombinantiniu MBP baltymu, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0029] 7 pav. pavaizduotas imunoblotingo vaizdas, gautas su MBP-Eno mėginiu po indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose, MBP-Eno-C1 mėginiu po indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose, MBP-Eno-C2 mėginiu po indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose ir rekombinantiniu MBP baltymu, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0030] DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS
[0031] Rekombinantinė paprastojo karpio β-enolazė, sulieta su MBP, buvo susintetinta E. coli bakterijose, išgryninta ir panaudota kuriant naujas hibridomas. Procedūros buvo atliktos šios srities specialistams, naudojant patvirtintus protokolus, parašytus pagal anksčiau aprašytą hibridomų technologijos metodą [Köhler and Milstein. Nature. 1975, 256, pp. 495-497].
[0032] Imunizacija – rekombinantinė paprastojo karpio β-enolazė, sulieta su MBP, sutrumpintai MBP-Eno, buvo suleidžiama BALB/c linijos pelėms po oda. Prieš injekciją, MBP-Eno (antigenas) tirpalas buvo lygiu tūriu sumaišomas su pilnu Freund'o adjuvantu.
[0033] Praėjus 4 savaitėms pelėms dar kartą buvo suleidžiamas toks pat antigeno tirpalo kiekis, prieš tai antigeno tirpalą sumaišius su nepilnu Freund'o adjuvantu.
[0034] Dar po 4 savaičių pelėms buvo suleidžiamas toks pat antigeno kiekis be adjuvanto. Imunizacijų metu buvo keletą kartų tikrinama, ar imunizuotų pelių kraujo serume atsirado antikūnų prieš antigeną. Tikrinimui buvo naudojamas imunofermentinės analizės (IFA) metodas.
[0035] Pakartotinė imunizacija – praėjus 4 savaitėms po trečios imunizacijos, pasirinktai pelei buvo suleidžiamas toks pat antigeno kiekis be adjuvanto.
[0036] Praėjus 3 dienoms po pakartotinės imunizacijos, pelės blužnies ląstelės buvo sulietos su pelės mielomos Sp 2/0 ląstelėmis, suliejimo agentu buvo naudotas polietilenglikolis (PEG, Sigma).
[0037] Sukurtų hibridinių ląstelių klonų (hibridomų) specifiškumas buvo tikrinamas IFA metodu. Šio tyrimo metu buvo nustatoma, ar hibridomos sekretuoja antikūnus prieš β-enolazę.
[0038] Hibridomos buvo apibūdintos nustatant jų sekretuojamų MAk poklasį ir ištiriant jų specifiškumą IFA ir imunoblotingo metodais.
[0039] Identifikavus hibridomas, kurios sekretuoja antikūnus prieš β-enolazę, buvo klonuojamos, padauginamos ir užšaldomos tolimesniam saugojimui.
[0040] Hibridomų sekretuojami antikūnai buvo apibūdinti metodais:
[0041] IFA ir imunoblotingu, naudojant kaip antigenus rekombinantinę paprastojo karpio β-enolazę, sulietą su MBP (MBP-Eno), rekombinantinį Eno (atskeltą nuo MBP-Eno su TEV proteaze) baltymą ir rekombinantinį MBP baltymą.
[0042] Imunoblotingu, naudojant bakterijų E. coli Tuner (DE3) ląstelių lizatą.
[0043] IFA ir imunoblotingu, naudojant kaip antigenus komercinius karpio ir kitų žuvų rūšių ekstraktus.
[0044] Imunoblotingu, naudojant laboratorijos sąlygomis paruoštą karpio ekstraktą.
[0045] IFA ir imunoblotingu, naudojant kaip antigenus rekombinantinį MBP-Eno baltymą, rekombinantinį MBP-Eno-C1 baltymą, rekombinantinį MBP-Eno-C2 baltymą ir rekombinantinį MBP baltymą.
[0046] Taigi, atlikus pelių BALB/c imunizacijas rekombinantiniu MBP-Eno ir suliejus pasirinktos imunizuotos pelės blužnies ląsteles su mielomos ląstelėmis, buvo sukurtos hibridomos, sekretuojančios monokloninius antikūnus prieš β-enolazę. Ištyrus gautų MAk savybes buvo parodyta, kad MAk 14F3 sąveikauja tik su rekombinantiniu MBP-Eno baltymu, o MAk 6E4 atpažįsta natyvią β-enolazę iš E. coli bakterijų ir žuvų ekstraktų.
[0047] Hibridomas 14F3 ir 6E4 apibūdina nurodyti požymiai.
[0048] Morfologiniai požymiai. Hibridinių ląstelių klonai yra sferinės formos, turi stambų branduolį. Auginami suspensijoje pasižymi silpna adhezija ant plastiko paviršiaus.
[0049] Ląstelių kultūros kilmė. Hibridomos gautos suliejus imunizuotos BALB/c linijos pelės blužnies ląsteles su pelės mielomos ląstelių linija Sp 2/0.
[0050] Ląstelių kultūros požymiai. Hibridomų kultivavimo sąlygos standartinės: augimo terpė yra Dulbecco modifikuota Eagle terpė su 2 mM L-glutamino, 200 µg/mL gentamicino ir 15% embrioninio veršiuko serumo. Hibridomos kultivuotos plastiko induose, skirtuose ląstelių kultūrų auginimui. Ląstelės persėjamos kas 3–4 dienas, 50–100 tūkstančių ląstelių mililitre terpės. Hibridomos auginamos inkubatoriuje, kurio atmosferoje yra 5% CO2, esant 37 ºC temperatūrai. Ilgalaikiam saugojimui hibridinės ląstelės užšaldomos embrioniniame veršiuko serume su 10% dimetilsulfoksido (DMSO) ir laikomos skystame azote. Užšaldymo sąlygos: 1 × 106–2 × 106 ląstelių mililitre, temperatūros rėžimas: -1 ºC per minutę iki - 70 ºC. Praėjus 24 val. ampulės su užšaldytomis ląstelėmis perkeliamos į skystą azotą. Kultūrų atgaivinimui ampulės atšildomos 37 ºC temperatūros augimo terpėje be serumo, centrifuguojamos 5 min. 200 × g greičiu ir dar kartą suspenduojamos ląstelių augimo terpėje su serumu. Ląstelių gyvybingumas po atšildymo 70–80%.
[0051] Kontaminacija. Bakterijų ir grybelių hibridomų kultūrose nerasta, mikoplazmos testas neigiamas.
[0052] Hibridomų produktyvumas. Monokloninių antikūnų sekrecijos lygis augimo terpėje yra 10–30 µg/ml. Antikūnų sekrecijos stabilumas iki 5 ląstelių kultūros persėjimų.
[0053] Produktų charakteristika. Hibridomos 14F3 ir 6E4 sekretuoja IgG klasės, IgG2b poklasio MAk, kurie specifiniai paprastojo karpio β-enolazei.
[0054] Buvo nustatyta, kad hibridomų 14F3 ir 6E4 sekretuojami monokloniniai antikūnai atpažįsta karpio β-enolazės aminorūgščių seką SEQ ID Nr.1.
[0055] Ši aminorūgščių seka atitinka paprastojo karpio β-enolazės aminorūgščių seką, kuri buvo nustatyta VU Gyvybės mokslų centre Biotechnologijos institute (AWS00995.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AWS00995.1).
[0056] Kitos žuvų rūšys irgi ekspresuoja β-enolazę, kurių pirminė seka gali keliomis aminorūgštimis skirtis nuo sekos SEQ ID Nr. 1.
[0057] Atlikus papildomus imunoblotingo eksperimentus su MAk 6E4 ir trumpesniais rekombinantiniais β-enolazės variantais (MBP-Eno-C1 ir MBP-Eno-C2), buvo patikslintas (susiaurintas) β-enolazės aminorūgščių sekos regionas (SEQ ID Nr. 2), kurį atpažįsta hibridomos 6E4 sekretuojami antikūnai. SEQ ID Nr. 2:
[0058]
[0059]
[0060] Anksčiau aprašytas monokloninis antikūnas anti-ENO1 skiriasi nuo MAk, susintetintų hibridomų 14F3 ir 6E4, kadangi jis specifinis žmogaus α-enolazei [US9382331B2]. Tuo tarpu MAk 8304 EB11.6A19L10, 8304 CF5.5L2, 8304 AD9.1L3, 8304 AG4.5A1, 8304 CE9.3A1, 8304 EB11.3A1 ir 8304 EF7.6A1 reaguoja su žmogaus neuronams būdinga enolaze. Anksčiau aprašytas monokloninis antikūnas R-5 yra sukurtas prieš Aspergillus fumigatus ląstelių paviršiuje esančią enolazę, o MAk 1A10 ir 5F3 prieš streptokoko paviršiaus enolazę ir reaguoja su žmogaus α-enolaze. Anksčiau aprašytas monokloninis antikūnas 1C7 yra specifinis Chaetomium globosum enolazei.
[0061] IŠRADIMO ĮGYVENDINIMO VARIANTAI
[0062] Toliau pateikiama informacija apie konkrečius rekombinantinės karpio β-enolazės, sulietos su maltozę surišančiu baltymu (MBP), klonavimu, sinteze E. coli bakterijose ir gryninimu. Taip pat informacija apie konkrečius naujų MAk sukūrimo ir jų savybių pavyzdžius. Šie pavyzdžiai ir lentelės pateikiami iliustraciniais tikslais ir neapriboja šio išradimo esmės.
[0063] 1 pavyzdys
[0064] Karpio β–enolazės klonavimas ir raiška E. coli bakterijose
[0065] Visa (totalinė) mRNR buvo izoliuota iš karpio skeleto raumenų naudojant rinkinį "Quick-RNA Miniprep Kit” (R1054, Zymo Research) pagal gamintojo rekomendacijas. Pirmosios grandinės kopijinė DNR (kDNR) buvo paruošta naudojant rinkinį "RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit” (K1631, Thermo Fisher Scientific) pagal gamintojo rekomendacijas. Enolazę koduojanti kDNR buvo amplifikuota naudojant tokius pradmenis:
[0066]
[0067] turinčius atitinkamai BglII ir SalI skėlimo sekas (pabraukta). Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) atlikta naudojant rinkinį "Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix” (F548S, Thermo Fisher Scientific) 25 μL reakcijos tūryje.
[0068] Amplifikacijos reakcija apima pradinės denatūracijos etapą 98 °C temperatūroje 10 sek. 35 amplifikacijos ciklus, sudarytus iš denatūracijos 1 sek. 98 °C, užsodinimo 5 sek. 54 °C ir sintezės 30 sek. 72 °C etapų. Gautas PGR fragmentas yra 1316 bazių porų (bp) dydžio.
[0069] PGR fragmentai klonuoti į pJET 1.2 vektorių (K1231, Thermo Fisher Scientific) ir rekombinantiniai klonai identifikuoti naudojant PGR su tokiais pradmenimis: 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC (SEQ ID Nr. 5) ir 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG (SEQ ID Nr. 6). Amplifikacijos reakcija apima pradinės denatūracijos etapą 94 °C temperatūroje 2 min. 30 amplifikacijos ciklus sudarytus iš denatūracijos 30 sek. 94 °C, užsodinimo 20 sek. 60 °C ir sintezės 1 min. 72 °C etapų. Gauti fragmentai analizuoti elektroforeze 1% agarozės gelyje (1 pav.).
[0070] 1 pav. atkartoja PGR klonų analizės vaizdą. Takeliai 1–15. Penkiolika rekombinantinių klonų išanalizuota elektroforeze 1% agarozės gelyje. Takelis 16: DNR standartų rinkinys "GeneRuler Ladder mix" (SM0331, Thermo Fisher Scientific) (šalia pažymėti fragmentų dydžiai tūkstančiais bazių porų).
[0071] Insertai iš penkių rekombinantinių plazmidžių (1 pav. takeliai Nr. 3, 6, 11, 12 ir 13) buvo sekvenuoti. Klono Nr.11 seka (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ MH255788.1) buvo pakankamai artima β-enolazės dalinės sekos duomenims, publikuotiems kaip seka GenBank: LHQP01000860.1, Cyprinus carpio isolate UL-001 Contig859 ir dalinė seka GenBank: LHQP01019434.1, Cyprinus carpio isolate UL-001 Contig19452. Insertas iš analizuoto klono Nr.11 buvo pasirinktas raiškai E. coli bakterijose.
[0072] DNR fragmentas iš rekombinantinio klono Nr. 11 plazmidės buvo iškirptas naudojant fermentus BglII ir SalI ir klonuotas į pET28-MBP-TEV plazmidę (Nr. 69929, Addgene), kuri buvo perkirpta fermentais BamHI ir XhoI. Atrinkti rekombinantiniai klonai buvo identifikuoti restrikcinės ir PGR analizės pagalba.
[0073] Raiškos plazmidė pET28-MBP-TEV-Eno-11 buvo transformuota į bakterijų E. coli Tuner (DE3) kamieną. β-enolazės biosintezė buvo indukuota pridedant 0,1 mM IPTG esant ląstelių optikai OD600 = 0,8 ir toliau kultyvuojant ląsteles dar 3–3,5 val. dviejose temperatūrose: 25 °C ir 37 °C. Ląstelės buvo suardytos naudojant ultragarsą (Bandelin Sonopuls HD 3100, Bandelin Electronic). Tirpi ir netirpi ląstelių lizato frakcijos buvo atskirtos centrifuguojant bei išanalizuotos naudojant 12% natrio dodecilsulfato poliakrilamidinį gelį redukuojančiomis sąlygomis (2 pav.).
[0074] 2 pav. atkartoja baltymų elektroforezės gelio vaizdą, gautą po MBP-Eno raiškos indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose ir išanalizavus tirpią ir netirpią ląstelių lizato frakcijas.
[0075] 1 takelis: ląstelių lizatas (OD600 = 0,8) prieš indukciją.
[0076] 2 ir 5 takeliai: tirpi ląstelių lizato frakcija po indukcijos kultivuotų atitinkamai 25 °C ir 37 °C.
[0077] 3 ir 6 takeliai: netirpi ląstelių lizato frakcija po indukcijos kultivuotų atitinkamai 25 °C ir 37 °C.
[0078] 4 ir 7 takeliai: visa ląstelių lizato frakcija po indukcijos kultivuotų atitinkamai 25 °C ir 37 °C.
[0079] 8 takelis: baltymų molekulinio svorio standartas (Nr. 26616, Thermo Fisher Scientific).
[0080] 2 pavyzdys
[0081] Rekombinantinės karpio β-enolazės, sulietos su maltozę surišančiu baltymu (MBP), gryninimas
[0082] 1 g indukuotos E. coli biomasės buvo suspenduota 5 ml 20 mM natrio fosfatiniame buferiniame tirpale (pH 7,4), kartu su 200 mM natrio chlorido (NaCl), 1 mM etilendiamintetraacto rūgštimi (EDTA), šviežiai pridėtu 1 mM ditiotreitoliu (DTT) ir 1 mM fenilmetilsulfonilchlorido (PMSF) tirpalu. Suspensija buvo patalpinta į ledo vonią ir veikiama 15 sek. ultragarso impulsais (bendras sonikavimo laikas mėginiui yra 2 min.). Biomasės lizatas centrifuguotas 20 min., 20000 × g. Supernatantas praskiestas santykiu 1:6 su 20 mM natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu (pH 7,4), turinčiu 200 mM NaCl ir 1 mM EDTA. Prieš chromatografiją praskiestas supernatantas filtruotas per 0,45 µm porų filtrą (Millex-HV, Merck Millipore).
[0083] Chromatografinis gryninimas buvo atliktas su AKTA purifier 100 chromatografine sistema, naudojant mėginio pompą P-960 ir frakcijų kolektorių Frac-920 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) ir 1 ml MBP Trap HP kolonėle su "Dextrin Sepharose High Performance" sorbentu (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Tekėjimo greitis 1 ml/min. (0,5 ml/min. mėginio užnešimo metu). Kolonėlė nulygsvarinta su mažiausiai 10 kolonėlės tūrių (CV) surišimo buferiniu tirpalu (20 mM natrio fosfatinis buferis (pH 7,4), su 200 mM NaCl ir 1 mM EDTA). Supernatantas, turintis rekombinantinį MBP-Eno baltymą, buvo užneštas ant kolonėlės, kuri po to buvo praplauta su mažiausiai 10 CV surišimo buferiniu tirpalu. Eliucija atlikta su 5 CV eliucijos buferiniu tirpalu (turinčiu 10 mM maltozės), buvo renkamos chromatografinės eliucijos frakcijos.
[0084] Bendra baltymo koncentracija surinktose frakcijose nustatyta Bradfordo metodu naudojant serumo albumino standartą. Chromatografijos frakcijos, turinčiomis MBP-Eno baltymą, buvo išanalizuotos redukuojančiomis sąlygomis 12% poliakrilamido gelyje, atliekant natrio dodecilsulfato poliakrilamidinio gelio elektroforezę (SDS-PAGE). Baltymai gelyje nudažyti su rinkiniu "PageBlue™ Protein Staining Solution" (24620, Thermo Fisher Scientific).
[0085] MBP-Eno frakcijų analizė SDS-PAGE parodyta 3 pav. Frakcijos, turinčios MBP-Eno baltymą (molekulinė masė 91,7 kDa), yra atkabinamos nuo sorbento su 10 mM maltozės buferiniu tirpalu. Prašokimo frakcijose MBP-Eno baltymo kiekis yra nedidelis. MBP-Eno kiekis eliucijos frakcijose buvo nustatytas Bradfordo metodu, iš 1 g pradinės biomasės gauta apie 5 mg MBP-Eno.
[0086] 3 pav. atkartoja baltymų elektroforezės vaizdą, gautą išanalizavus išgrynintą rekombinantinį MBP-Eno baltymą, naudojant MBP Trap HP kololonėlę su "Dextrin Sepharose High Performance" sorbentu.
[0087] 1 takelis: baltymų molekulinio svorio standartas (Nr. 26616, Thermo Fisher Scientific).
[0088] 2 takelis: biomasės lizato supernatantas.
[0089] 3 ir 4 takeliai: prašokimo frakcijos.
[0090] 5–10 takeliai: eliucijos frakcijos su 10 mM maltozės buferiniu tirpalu.
[0091] 3 pavyzdys
[0092] Hibridinių ląstelių linijų, sekretuojančių monokloninius antikūnus prieš rekombinantinį paprastojo karpio MBP-Eno, sukūrimas
[0093] BALB/c linijos pelės buvo imunizuojamos išgrynintu rekombinantiniu paprastojo karpio MBP-Eno (antigenu), susintetintu bakterijose E. coli. Pelės buvo imunizuojamos suleidžiant joms po oda 50 μg antigeno mišinio su pilnu Freund'o adjuvantu. Praėjus 4 savaitėms po pirmosios imunizacijos, pelėms buvo antrą kartą suleista 50 μg antigeno mišinio su nepilnu Freund'o adjuvantu. Dar po 4 savaičių pelės buvo imunizuojamos suleidžiant 50 μg antigeno mišinio be adjuvanto. Imunizacijų metu buvo tikrinamas antigenui specifinių antikūnų titras imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Hibridizacija buvo atlikta praėjus 3 dienoms po paskutinės papildomos antigeno injekcijos pasirinktai pelei.
[0094] Imunizuotos pelės blužnies ląstelės buvo sulietos su pelės mielomos Sp 2/0 ląstelėmis, neturinčiomis hipoksantin-guanin-fosforiboziltransferazės, neaugančios selektyvioje hipoksantino-aminopterino-timidino (HAT) terpėje (10-4 M hipoksantino 1,6 × 10-5 M timidino, 4 × 10-7 M aminopterino) ir nesekretuoja imunoglobulinų. Suliejimas buvo atliekamas inkubuojant ląsteles 5 min. su polietilenglikolio (PEG) tirpalu Dulbecco modifikuotoje Eagl'o terpėje (DMEM) su 2 mM L-glutaminu, 200 μg/mL gentamicinu. Mielomos ir blužnies ląstelių santykis hibridizacijos metu – 1:4,5. Po hibridizacijos ląstelės buvo atplaunamos beserumine DMEM terpe, suspenduojamos selektyvioje HAT terpėje ir išsėjamos į plokšteles (po 2,6 × 105 ląstelių į šulinėlį). Hibridiniai klonai užaugo praėjus 5–10 dienų po suliejimo. Netiesioginės IFA metodu buvo tikrinama ląstelių augimo terpė, nustatant ar klonai gamina antigenui specifinius antikūnus. Kas 4–5 dienas buvo pakeičiama pusė ląstelių augimo terpės. Pirmą kartą HAT terpė buvo keičiama į hipoksantino-timidino (HT) terpę, turinčią 10-4 M hipoksantino ir 1,6 × 10-4 M timidino. Vėliau HT terpė buvo palaipsniui keičiama į įprastą augimo terpę. Klonai užaugo praėjus 4–7 dienom po klonavimo (ribinio praskiedimo metodu) ir buvo tikrinami netiesioginės IFA metodu. Atrinkti klonai buvo padauginami, kultivuojami in vitro ir užšaldomi ilgesniam saugojimui skystame azote. Sukurtos dvi hibridinių ląstelių linijos, sekretuojančios monokloninius antikūnus prieš MBP-Eno: 14F3 ir 6E4.
[0095] 4 pavyzdys
[0096] Monokloninių antikūnų specifiškumo tyrimas ir poklasio nustatymas
[0097] IFA ir imunoblotingo metodai buvo pritaikyti įvertinti antikūnų specifiškumą, kuriuos sintetina hibridomų klonai 14F3 ir 6E4. Antikūnų poklasis buvo nustatytas IFA metodu, naudojant poklasio nustatymo rinkinį (550487, BD Biosciences).
[0098] Tyrimų metu buvo nustatyta, kad MAk yra IgG klasės, IgG2b poklasio ir atpažįstą rekombinantinę β-enolazę (4 pav.). Imunoblotingo metodu buvo parodyta, kad monokloninis antikūnas 6E4 reaguoja su 50 kDa baltymu, esančiu įvairių žuvų ekstraktuose ir bakterijų E. coli Turner (DE3) lizate, kuris pagal molekulinę masę atitinka β-enolazę (4 ir 5 pav.).
[0099] Taigi, sukurti monokloniniai antikūnai yra specifiniai β-enolazei.
[0100]
[0101] 4 pav. atkartoja imunoblotingo vaizdą, gautą su rekombinantiniu paprastojo karpio MBP-Eno baltymu, rekombinantiniu Eno (atskeltas nuo MBP-Eno su TEV proteaze) baltymu, rekombinantiniu MBP baltymu ir E. coli Tuner (DE3) ląstelių lizatu, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0102] 1 takelis – rekombinantinis išgrynintas Eno baltymas.
[0103] 2 takelis – rekombinantinis išgrynintas MBP-Eno baltymas.
[0104] 3 takelis – rekombinantinis išgrynintas MBP baltymas.
[0105] 4 takelis – bakterijų E.coli Tuner (DE3) ląstelių lizatas.
[0106] M – baltymų molekulinio svorio standartas (Nr. 26616, Thermo Fisher Scientific).
[0107] Išsamesniam monokloninio antikūno, sekretuojamo hibridomos 6E4 klono, apibūdinimui buvo nustatytos antikūno sunkiosios ir lengvosios grandinių aminorūgščių sekos (Synbio Technologies).
[0108] Imunoglobulino sunkiosios grandinės aminorūgščių seka (SEQ ID Nr. 7):
[0109]
[0110] Imunoglobulino lengvosios grandinės aminorūgščių seka (SEQ ID Nr. 8):
[0111]
[0112] 5 pavyzdys
[0113] Monokloninių antikūnų kryžminio specifiškumo tyrimas
[0114] IFA ir imunoblotingo metodu ištirtas hibridomų 14F3 ir 6E4 sekretuojamų antikūnų kryžminis specifiškumas, t.y. reakcija su karpio ir kitų žuvų rūšių komerciniais ekstraktais (DST).
[0115] Atlikus tyrimą buvo nustatyta, kad gautas MAk 14F3 reaguoja tik su lašišos ekstraktu, o MAk 6E4 –reaguoja su visais ekstraktais. Tai rodo, kad tiek MAk 14F3, tiek MAk 6E4 yra specifiniai ne tik rekombinantinei paprastojo karpio β-enolazei, bet atpažįsta ir kitų žuvų rūšių β-enolazę.
[0116]
[0117] 5 pav. atkartoja imunoblotingo vaizdą, gautą su komerciniais žuvų ekstraktais, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0118] 1 takelis – komercinis silkės ekstraktas (f21, DST)
[0119] 2 takelis – komercinis lašišos ekstraktas (f41, DST)
[0120] 3 takelis – komercinis karpio ekstraktas (f233, DST)
[0121] 4 takelis – komercinis menkės ekstraktas (f3, DST)
[0122] M – baltymų molekulinio svorio standartas (Nr. 26616, Thermo Fisher Scientific).
[0123] Imunoblotingo metodu ištirtas hibridomos 6E4 sekretuojamų antikūnų pritaikomumas β-enolazės aptikimui karpio ekstrakte, paruoštame Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro Biotechnologijos instituto Imunologijos ir ląstelės biologijos laboratorijoje. Ekstraktas išskirtas iš karpio filė (~ 4 g), naudojant fosfatinį buferinį tirpalą (pH 7,4), turintį 0,15 M NaCl.
[0124] Eksperimento metu buvo parodyta, kad MAk 6E4 reaguoja su β-enolaze, esančia tiek naujai paruoštame ekstrakte, tiek komerciniame karpio ekstrakte (f233, DST) ir gali būti taikomas skirtingų gamintojų karpio ekstraktų apibūdinimui.
[0125] 6 pav. atkartoja imunoblotingo vaizdą, gautą su rekombinantiniu paprastojo karpio MBP-Eno baltymu, komerciniu karpio ekstraktu (DST), laboratorijoje paruoštu natūraliu karpio ekstraktu ir rekombinantiniu MBP baltymu, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0126] 1 takelis – rekombinantinis išgrynintas MBP-Eno baltymas.
[0127] 2 takelis – komercinis karpio ekstraktas (f233, DST).
[0128] 3 takelis – iš karpio filė išskirtas ekstraktas.
[0129] 4 takelis – rekombinantinis išgrynintas MBP baltymas.
[0130] M – baltymų molekulinio svorio standartas (Nr. 26616, Thermo Fisher Scientific).
[0131] 6 pavyzdys
[0132] Monokloninio antikūno, sekretuojamo hibridomos 6E4, epitopo nustatymas.
[0133] IFA ir imunoblotingo metodu ištirtas hibridomos 6E4 sekretuojamų antikūnų specifiškumas trumpesniems rekombinantiniams β-enolazės variantams (MBP-Eno-C1 ir MBP-Eno-C2). Rekombinantiniai baltymai susintetinti E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose, kaip ir rekombinantinis MBP-Eno baltymas. Sintezė atlikta Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro Biotechnologijos instituto Imunologijos ir ląstelės biologijos laboratorijoje.
[0134] MBP-Eno (836 aminorūgštys) baltymo seka atitinka SEQ ID Nr. 9.
[0135] MBP-Eno-C1 (698 aminorūgštys) yra trumpesnis rekombinantinio MBP-Eno baltymo variantas (sutrumpintas MBP-Eno baltymo C-galas). Baltymo aminorūgščių seka atitinka SEQ ID Nr. 10.
[0136] MBP-Eno-C2 (543 aminorūgštys) yra trumpesnis rekombinantinio MBP-Eno baltymo variantas (sutrumpintas MBP-Eno baltymo C-galas). Baltymo aminorūgščių seka atitinka SEQ ID Nr. 11.
[0137] Atlikus imunoblotingą buvo nustatyta, kad MAk 6E4 reaguoja su rekombinantiniu MBP-Eno baltymu, rekombinantiniu MBP-Eno-C1 baltymu, bet nereaguoja su MBP-Eno-C2 baltymu.
[0138] 7 pav. atkartoja imunoblotingo vaizdą, gautą su MBP-Eno mėginiu po indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose, MBP-Eno-C1 mėginiu po indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose, MBP-Eno-C2 mėginiu po indukcijos E. coli Tuner (DE3) kamieno bakterijose ir rekombinantiniu MBP baltymu, naudojant hibridomos 6E4 klono sekretuojamus monokloninius antikūnus.
[0139] 1 takelis – MBP-Eno mėginys po indukcijos.
[0140] 2 takelis – MBP-Eno-C1 mėginys po indukcijos.
[0141] 3 takelis – MBP-Eno-C2 mėginys po indukcijos.
[0142] 4 takelis – rekombinantinis išgrynintas MBP baltymas.
[0143] M – baltymų molekulinio svorio standartas (Nr. 26616, Thermo Fisher Scientific).
[0144] Palyginus visų rekombinantinių baltymų aminorūgščių sekas tarpusavyje (8 pav.), buvo nustatyta β-enolazės aminorūgščių seka (544-698 aminorūgštys), kurią atpažįsta MAk 6E4 monokloninis antikūnas ir kurioje yra tikėtinas šio antikūno epitopas (SEQ ID Nr. 12).
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
1. Monokloninis antikūnas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad atpažįsta aminorūgščių seką SEQ ID Nr. 1 arba į ją panašią seką, kurios identiškumas yra bent 95%.
2. Hibridomos 14F3 ląstelių linija, produkuojanti monokloninius antikūnus pagal 1 punktą, kuri deponuota BCCM ir kurios deponavimo numeris yra LMBP 13806CB.
3. Hibridomos 6E4 ląstelių linija, produkuojanti monokloninius antikūnus pagal 1 punktą, kuri deponuota BCCM ir kurios deponavimo numeris LMBP 13805CB.
4. Hibridomos ląstelių linija, pasirinkta iš grupės, susidedančios iš 14F3 ir 6E4, produkuojanti monokloninius antikūnus pagal 1 punktą prieš paprastojo karpio β-enolazę.
5. Monokloninis antikūnas pagal 1 punktą, produkuojamas hibridomos ląstelių linijos pagal bet kurį vieną iš 2–3 punktų, kuris yra IgG klasės.
6. Monokloninis antikūnas pagal 5 punktą, kuris yra pelės monokloninis antikūnas.
7. Monokloninio antikūno pagal 1 punktą arba 5 punktą panaudojimas β-enolazės aptikimui maisto produktuose arba komerciniuose karpio ekstraktuose.
8. Diagnostinis rinkinys β-enolazės aptikimui maisto produktuose arba komerciniuose karpio ekstraktuose, apimantis bent monokloninį antikūną pagal 1 arba 5 punktą.