[LT] Išradimas priklauso biotechnologijos bei aplinkos apsaugos sritims. Nauji štamai Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB-AMFK (deponuotas Vilniaus Universiteto Augalų fiziologijos ir mikrobiologijos katedros mikroorganizmų kolekcijoje (LT), registracijos kodas 4,5 VNB-AMFK), išskirtas iš Vilniaus naftos bazės, ir štamas Penicillium frequentans Westling 6,4 PNB-AMFK (deponuotas Vilniaus Universiteto Augalų fiziologijos ir mikrobiologijos katedros mikroorganizmų kolekcijoje (LT), registracijos kodas 6,4 PNB-AMFK), išskirtas iš Panevėžio naftos bazės grunto, ir jų derinys efektyviai skaido naftą ir jos angliavandenilius ir naudojami grunto, užteršto nafta ir jos produktais biologiniam valymui.
[EN] The present invention relates to biotechnology and environment protection. New strains Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB-AMFK (deposited with the Collection of microorganisms of Plants physiology and microbiology department of Vilnius university, deposition number 4,5 VNB-AMFK) obtained from the soil of Vilnius oil wholesale market and Penicillium frequentans westling 6,4 PNB-AMFK (deposited with the Collection of microorganisms of Plants physiology and microbiology department of Vilnius university, deposition number 6,4 PNB-AMFK0 obtained from the soil of Panevėžys oil wholesale market and the composition thereof destroys effectively oil and oil hydrocarbons.
[0001] Išradimas priklauso mikrobiologijos bei aplinkos apsaugos sritims, būtent naftą ir naftos produktus skaidantiems mikroorganizmams. Išradimas gali būti panaudotas valant gruntą, užterštą nafta ir naftos produktais, ypač sunkiosiomis jos frakcijomis.
[0002] Žinomi naftą oksiduojantys mikroorganizmai Acinetobacter, aprašytas patento RU 2 053 204, C02F 3/34, aprašyme, o taip pat Mycobacterium, aprašytas patento RU 2 053 206, C02 F3/34, aprašyme, naudojami naftos angliavandenilių biodestrukcijai.
[0003] Taip pat žinomos aerogeninės naftą oksiduojančios bakterijos Pseudomonas putida PI Ko - 1, Pseudomonas P - 896 ir Microccocus PI K> - 1, naudojamos gamybai biopreparato, skirto aplinkos valymui nuo naftos ir jos produktų. Štamai aktyvūs pH ribose 4,5 - 8,5 ir temperatūros ribose 10° - 40°C, (žiūr. patento RU 2 122 980, C02F 3/34, aprašymą).
[0004] Šių mikroorganizmų trūkumas - nedidelis aktyvumas sunkiųjų naftos frakcijų atžvilgiu.
[0005] Išradimo esmę sudaro aktyvių štamų, oksiduojančių stambiamolekulinius naftos angliavandenilius, gavimas.
[0006] Užduoties sprendimui siūlomi štamai Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK ir Penicillium freąuentans V/estling 6,4 PNB - AMFK, pasižymintys didesniu aktyvumu naftos angliavandenilių atžvilgiu. Mikromicetų Penicillium decumbens ir Penicillium frecjuentans štamai saugomi Vilniaus universiteto Augalų fiziologijos ir mikrobiologijos katedroje. Jų registracijos kodai Penicillium decumbens - 4,5 VNB - AMFK, Penicillium frecjuentans - 6,4 PNB- AMFK. Štamai identifikuoti remiantis Ramirez C. "Manual atlas of the Penicillia" Amsterdam: Elsevier, 1982, 874 p.
[0007] Siūlomi štamas Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK išskirtas iš Vilniaus naftos bazės, o štamas Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB - AMFK - iš Panevėžio naftos bazės grunto.
[0008] Štamai Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK ir Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB - AMFK savo požymiais yra artimi. Jų morfologiniai požymiai (konidijakočių
[0009] dydžiai, sterigmų-fialidžių kuokšteliai, konidijų dydžiai) skiriasi nežymiai, o fiziologiniai-biocheminiai požymiai (kultivavimo sąlygos, augimo faktorių poreikiai, oksidacinis ir proteazinis aktyvumas ir kt.) yra beveik identiški,
[0010] Siūlomas štamas Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK išskirtas iš nafta ir naftos produktais užteršto Vilniaus naftos bazės teritorijos grunto. Jo gavimui buvo naudota mikrobiologinė kultūrų skyrimo metodika. Užterštas nafta dirvožemio mėginys buvo subertas į kolbutę su fiziologiniu tirpalu, kuri buvo purtoma 10 min. orinėje purtyklėje. Gauta suspensija praskiedimo metodu išsėta ant standžios Čapeko terpės, kurioje vieninteliu anglies šaltiniu panaudota 0,5 % naftos produktų. Gryna mikromiceto kultūra identifikavimui ir apibūdinimui persėta ant standžios alaus misos ir Čapeko terpių. Mikromicetų kultūra saugoma šaldytuve 4°C temperatūroje, persėjant į mėgintuvėlius ant nuožulnaus Čapeko terpės agaro. Kultūra persėjama į atnaujintą terpę kas 6 mėn.
[0011] Siūlomas štamas Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB - AMFK išskirtas iš Panevėžio naftos bazės grunto. Jo gavimui naudota ta pati kaip ir Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK atveju mikrobiologinė kultūrų skyrimo metodika. Penicillium freąuentans štamas saugomas 4 °C temperatūroje ant agarizuotos Čapeko terpės. Kultūra persėjama kas 6 mėn.
[0012] Penicillium decumbens Thom 4, 5 VNB — AMFK kultūriniai - morfologiniai požymiai. Ant Čapeko terpės kultūra auga santykinai lėtai. Po 10 parų kolonijos diametras siekia 2-3 cm. Kolonijos aksominės tekstūros, centre šviesesnis pūkuotas micelis, žalsvai pilkos spalvos, kuri, kultūrai senstant, įgyja dūminį atspalvį. Apatinė kolonijos pusė bespalvė arba nežymiai žalsva. Pigmento į aplinką neskiria. Kultūros kvapas aiškus, aromatinis, primena muilo kvapą. Konidijakočiai 50 — 100 x 2 — 2,5 Į.im, lygūs arba nežymiai spygliuoti. Sterigmos (fialidės) susitelkę glaudžiais kuokšteliais po 12 - 15. Konidijos ovalios arba beveik apvalios, lygios arba retai spygliuotos, 2 - 3 |im diametro, bendroje masėje žalsvos. Sporų grandinėlės sudaro gerai išreikštus stulpelius.
[0013] Penicillium decumbens Thom 4, 5 VNB — AMFK fiziologiniai - biocheminiai požymiai. Štamas Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK gerai auga ant įprastų natūralių, sintetinių ir pusiau sintetinių terpių: alaus misos, Čapeko, Čapeko-Dokso, Sabūro ir kt. terpių. Optimalus terpių pH apie 7. Papildomų augimo faktorių štamai nereikalauja. Skiria į aplinką organines rūgštis, pasižymi oksidoreduktaziniu ir proteaziniu aktyvumu.
[0014] Štamas gali naudoti mitybai naftos angliavandenilius kaip papildomą ar vienintelį anglies šaltinį. Naftos angliavandenilių įtaką mikromicetų augimui ir vystymuisi vertinome pagal biomasės pokytį.
[0015] Penicillium freąuentans VVestling 6, 4 PNB- AMFK kultūriniai - morfologiniai požymiai. Ant Čapeko terpės kultūra auga greitai. Po 10 parų kolonijos diametras siekia 5-6 cm. Kolonijos plačiai pasklidę, aksominės tekstūros, gausiai sporuliuojančios, pilkai žalios spalvos, kuri, kultūrai senstant, tamsėja. Apatinė kolonijos pusė geltonai ruda. Kultūros kvapas būdingas pelėsiams. Konidijakočiai 100 - 200 x 3 - 3,5 (.im, lygūs arba nežymiai spygliuoti. Sterigmos (fialidės) susitelkę kuokšteliais po 10 - 12. Konidijos beveik apvalios, lygios arba retai spygliuotos, 3 - 3,5 fim diametro. Sporų grandinėlės sudaro gerai išreikštus stulpelius. Štamas auga 6 °C - 32 °C ribose, optimalus augimas 26 °C - 28 °C temperatūroje.
[0016] Penicillium freąuentans VVestling 6, 4 PNB- AMFK fiziologiniai - biocheminiai požymiai. Štamas Penicillium freąuentans VVestling 6,4 PNB-AMFK gerai auga ant įprastų natūralių, sintetinių ir pusiau sintetinių terpių: alaus misos, Čapeko, Čapeko-Dokso, Sabūro ir kt. terpių, Optimalus terpių pH apie 7. Papildomų augimo faktorių štamas nereikalauja. Skiria į aplinką organines rūgštis, pasižymi oksidoreduktaziniu ir proteaziniu aktyvumu. Štamas gali naudoti mitybai naftos angliavandenilius kaip papildomą ar vienintelį anglies šaltinį. Naftos angliavandenilių įtaka mikromiceto augimui ir vystymuisi vertinome pagal biomasės pokytį.
[0017] Mikromicetų Penicillium decumbens 4,5 VNB - AMFK augimui terpėje su naftos angliavandeniliais kaip vieninteliais anglies šaltiniais buvo naudota skysta Čapeko terpė (be agaro) užsėjant 1-2 mln/ml tankio mikromicetų sporų suspensija; į terpę su užsėta mikromiceto kultūra buvo įnešama po 0,5 % heptano (C7 Hjs), tetradekano (C14H30), heksadekano (C16H34), dokozano (C22H46), tolueno (CH3C6H5), ksileno (Cfy^Cįl^, benzeno (CįHe), difenilmetano (C6H4hCH2 ir dyzelinio kuro. Mikromicetų augimui terpėje su angliavandenilių mišiniu buvo naudota skysta Čapeko terpė, įnešant po 0,25 % tetradekano ir dokozano. Mikromiceto kultūra terpėje su naftos angliavandeniliais buvo inkubuojama 26 °C ± 2 °C temperatūroje 7 paras. Naftos angliavandenilių įtaka mikromicetų vystymuisi buvo vertinta pagal biomasės pokytį kontroliniame variante (Čapeko terpė su sacharoze) ir bandomajame variante (Čapeko terpė be sacharozės) su atitinkamu angliavandeniliu. Palyginimui naudoti Acremonium murorum ir Trichoderma harzianum kolekcijinis kamienas, išskirtas iš derlingos dirvos sluoksnio.
[0018] 1 lentelė
[0019] Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AFMK, Acremonium murorum ir Trichoderma harzianum biomasės kiekis (mg/ml) po 7 parų auginimo skystoje Čapeko terpėje be sacharozės su 0,5% naftos angliavandenilių, kaip vieninteliais anglies šaltiniais.
[0020] Penicillium decumbens palyginti su Acremonium murorum ir Trichoderma harzianum intensyviau skaido naftos angliavandenilius heptaną, tetradekaną, heksadekaną, dokozaną, tolueną, ksileną, difenilmetaną, dyzelinį kurą ir tik lėčiau benzeną. Ypač aktyviai skaido dokozaną bei dokozano ir tetradekano mišinį.
[0021] Mikromiceto Penicillium frequentcins 6,4 PNB-AMFK augimui terpėje su naftos angliavandeniliais kaip vieninteliais anglies šaltiniais buvo naudota skysta Čapeko terpė (be agaro) užsėjant 1-2 mln/ml tankio mikromicetų sporų suspensija; į terpę su užsėta mikromiceto kultūra buvo įnešama po 0,5 % heptano (C? H15), tetradekano (C14H30), heksadekano (C16H34), dokozano (CizHar,). tolueno (CH3C6H5), ksileno (CF^ įC^H.!, benzeno (CeHį), difenilmetano (CfiH^zCH? ir dyzelinio kuro. Mikromicetų augimui terpėje su angliavandenilių mišiniu buvo naudota skysta Čapeko terpė, įnešant po 0,25 % tetradekano ir dokozano. Mikromiceto kultūra terpėje su naftos angliavandeniliais buvo inkubuojama 26 °C ± 2 °C temperatūroje 7 paras. Naftos angliavandenilių įtaka mikromiceto vystymuisi buvo vertinta pagal biomasės pokytį kontroliniame variante (Čapeko terpė su sacharoze) ir bandomajame variante (Čapeko terpė be sacharozės) su atitinkamu angliavandeniliu. Palyginimui naudoti Acremonium murorum ir Trichoderma harzianum kolekcijiniai štamai, išskirti iš derlingos dirvos sluoksnio. Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje. 2 lentelė
[0022] Penicillium freguentcins 6,4 PNB - AMFK, Acremonium murorum ir Trichoderma harzianum biomasės kiekiai (mg/ml) po 7 parų auginimo skystoje Čapeko terpėje be sacharozės su 0,5% naftos angliavandenilių, kaip vieninteliais anglies šaltiniais.
[0023] Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB - AMFK palyginus su naftą oksiduojančiais mikroorganizmais Acremonium murorum ir Trichoderma harzianum intensyviau skaido naftos angliavandenilius heptaną, tetradekaną, heksadekaną, dokozaną, ksileną, difenilmetaną, dyzelinį kurą, silpniau - heptaną ir tolueną. Ypač intensyviai skaido dokazaną ir heksadekaną.
[0024] Štamas Penicillium freąuentans 6,4 PNB - AMFK buvo auginamas 250 ml Erlenmejerio kolbose su Čapeko terpe, kuriose terpės kiekis buvo 100 ml, inkubacijos trukmė 30 parų ir temperatūra 35 °C. Bandymui buvo imama 50 g grunto, kuriame mazuto kiekis vidutiniškai sudarė 39 g/kg grunto. Nesunaudotas mazuto kiekis grunte buvo nustatomas svorio metodu, prieš tai išekstrahavus mazutą iš grunto CH3CI. Kadangi grunte mazuto kiekis buvo gana didelis, jis buvo ekstrahuojamas 4 kartus po 60 ml CH3CL Vėliau tirpiklis buvo išgarinamas. Įvertinant mazuto įvairių angliavandenilių frakcijų įsisavinimą mikroorganizmais buvo naudojama skysčio kolonėlės chromatografija. Sorbentu buvo naudojamas silikagelis markės L 100/160|i (Chemopol, Čekija) aktyvuotas 110°C temperatūroje 16 valandų. Adsorbcinis mazuto frakcionavimas stiklinėje kolonėlėje (aukštis 20 cm, diametras 2 cm) buvo atliekamas tirpikliais C čH h (60 ml), CgHį (100 ml) ir paskiausiai eliuojama C2H5OH (100 ml). Tuo būdu buvo gautos 3 angliavandenilių frakcijos, įeinančios į mazuto sudėtį: sočioj i - parafinų, aromatinių angliavandenilių ir dervos. Gautos frakcijos buvo nustatomos dujinės
[0025] chromatografijos metodu. Biodegradacijos procesui įvertinti buvo skaičiuojamas mazuto įsisavinimo mikroorganizmais laipsnis - utilizacijos laipsnis (%), skaičiuojamas iš gauto eksperimento duomenų, naudojantis formule:
[0026] Mazuto frakcijos utilizacijos laipsnis buvo nustatomas dujinės chromatografijos metodu. Tuo tikslu po inkubacijos likęs mazutas buvo ekstrahuojamas CH3CI, tirpiklis išgarinamas, po to mazutas ištirpinamas 5 ml (C įH.O įO ir gauti pavyzdžiai analizuojami dujiniu chromatografu markės J1XM - 8M,ZĮ, naudojant detektorių - katarometrą, kolonėles 3m x 3mm (nešėjas Chromaton N - AW, 0160 - 0,200 mm su 15. Apiezon L.) judančioji fazė - azotas (60 mm/min). Gauti duomenys pateikti 3 lentelėje.
[0027] Siūlomi štamai Penicillium freąuentans 6,4 PNB -FMK ir Penicillium decumbens 4,5 VNB - AFMK auga 4° - 36°C ribose, optimalus augimas 26° - 28°C temperatūroje ir pH 6,0 - 7,5.
[0028] Siekiant įsitikinti, ar Penicillium štamai gali augti toje pačioje terpėje kartu, štamus Penicillium decumbens, Penicillium freąuentans ir Penicillium citrinum auginome Erlenmejerio kolbose su Čapeko terpe, kaip aprašyta 3 pavyzdyje. Penicillium citrinum Thom 4,5 VNB - AMFK savo morfologinėmis ir fiziologinėmis-biocheminėmis savybėmis artimas Penicillium decumbens ir Penicillium freąuentcins štamams. Jis aktyviai skaido heptaną tetradekaną, silpniau-dokozaną, dyzelinį kurą, mazutą.
[0029] Pavieniui panaudoti Penicillium štamai ( Penicillium decumbens, Penicillium freąuentans ir Penicillium citrinum, žiūr. 3 ir 4 lenteles) silpniau skaido mazutą. Tie patys štamai, auginami kanu, mazuto destrukcijos aktyvumą padidina 2-4 kartus.
[0030] Mikromicetų štamų kultūros saugomos šaldytuve 4 °C temperatūroje ant agarizuotos Čapeko arba alaus misos terpių, persėjant į mėgintuvėlius ant nuožulnaus Čapeko terpės agaro. Kultūra persėjama į atnaujintą terpę kas 6 mėn.
[0031] Siūlomi štamai Penicillium decumbens 4,5 VNB - AMFK ir Penicillium freąuentans 6,4 PNB - AMFK vienodai intensyviai skaido atskirus naftos angliavandenilius priklausomai nuo šių angliavandenilių cheminės sudėties. Abu štamai auga toje pačioje mitybinėje terpėje, tarp jų nėra antagonistinių santykių ir gali būti panaudoti kartu Šie štamai gali būti kultivuojami pramoniniu būdu, naudojant įprastas standartines natūralias, sintetines ar pusiau sintetines terpes ir įprastą įrangą papildomų augimo faktorių nereikalauja, pasižymi oksireduktaziniu ir proteaziniu aktyvumu.
1. Štamas Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK (deponuotas Vilniaus universiteto Augalų fiziologijos ir mikrobiologijos katedros mikroorganizmų kolekcijoje (LT), registracijos kodas 4,5 VNB - AMFK), aktyviai oksiduojantis naftą ir naftos angliavandenilius, ypač aktyviai oksiduojantis dokozano ir tetradekano mišinius.
2. Štamas Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB- AMFK (deponuotas Vilniaus universiteto Augalų fiziologijos ir mikrobiologijos katedros mikroorganizmų kolekcijoje (LT), registracijos kodas 6,4 PNB - AMFK), aktyviai skaidantis naftą ir naftos angliavandenilius, ypač aktyviai skaidantis dokozaną ir heksadekaną.
3. Štamas Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK, skirtas panaudoti nafta ir naftos produktais, ypač naftos angliavandenilių mišiniu - dyzeliniu kuru ir mazutu, užteršto grunto biologiniam valymui.
4. Štamas Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB - AMFK, skirtas panaudoti nafta ir naftos produktais, ypač naftos angliavandenilių mišiniu - dyzeliniu kuru ir mazutu, užteršto grunto biologiniam valymui.
5. Štamų Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK ir Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB - AMFK pagal 1 ir 2 punktus gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad paruošia nafta ir naftos produktais užteršto grunto vandens suspensiją, paruoštą suspensiją praskiedimo metodu užsėja ant agarizuotos Capeko terpės, kurioje vieninteliu anglies šaltiniu panaudoja naftos produktų angliavandenilius, palaiko mikromicetams augti reikiamą temperatūrą esant pH 6,5 - 7,5 ribose, grynos mikromiceto kultūros identifikavimui ir apibūdinimui persėją ant standžios alaus misos ir Čapeko terpių.
6. Štamų Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK ir Penicillium freąuentans Westling 6,4 PNB - AMFK gavimo būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad suspensija naftos produktų angliavandenilių turi iki 0,5 %.
7. Štamų Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB - AMFK ir Penicillium freąuentans VVestling 6,4 PNB - AMFK gavimo būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad mikromicetų auginimui palaiko temperatūrą 26 - 28 °C ribose.
8. Štamai Penicillium decumbens Thom 4,5 VNB — AMFK, Penicillium frequentans Westling 6,4 PNB - AMFK ir Penicillium citrinum, panaudoti kartu sudarius jų konsorciumą, naftos produktų (mazuto) destrukcijos aktyvumą padidinantis 2-4 kartus.