[LT] Išradimas priklauso ekologijos ir mikrobiologijos sritims, būtent, mikroorganizmų štamams, oksiduojantiems naftą ir jos produktus. Siūlomas štamas gali būti panaudotas grunto, vandens, užteršto naftaarba naftos produktais, biologiniam valymui. Štamas Candida lipolytica C.6.1-5 (deponuotas Botanikos instituto Biodestruktorių tyrimo laboratorijoje (LT), kolekcinis numeris IBL:Y-12), pasižymi stipriai išreikštu angliavandenilių destrukciniu aktyvumu.
[EN] The present invention relates to ecology and microbiology, particularly, to microorganism's strain oxidising oil and oil products. The strain claimed can be used for the biological purification of soil and water contaminated with oil or oil products. The strain Candida lipolytica C.6.1-5 deposited with the Laboratory of biodestructors of the Institute of botany is chracterised by high hydrocarbondestroying potency.
[0001] Išradimas priklauso ekologijos ir mikrobiologijos sritims, būtent mikroorganizmų štamams, oksiduojantiems naftą ir jos produktus. Siūlomas štamas gali būti panaudotas grunto, vandens, užteršto nafta arba naftos produktais, biologiniam valymui.
[0002] Žinomas mielių Candida guillermondii BKI1M Y- 241 štamas, aprašytas patento RU 2 007 372, C02F 3/34, E02B 15/04, aprašyme (deponuotas UMIIM BHHH Sintezbelok). Šis štamas naudojamas vandens ir grunto, užterštų nafta arba naftos produktais, valymui. Užterštą aplinką apdoroja mielių Candida guillermondii BKTIM Y- 241 ląstelių suspensija mineralinių azoto ir fosforo trąšų terpėje.
[0003] Šio štamo trūkumas yra tas, kad jis yra nepakankamai efektyvus sunkių naftos frakcijų, pavyzdžiui, mazuto biovalymui,
[0004] Žinomas naftos produktais užteršto grunto ir vandens mikrobiologinio valymo būdas, aprašytas patento RU 2 014 286,C02F 3/34, E02B 15/04, aprašyme, kai naftos produktais užterštas vanduo arba gruntas apvalomi naftą oksiduojančių mikroorganizmų asociacija: Candida tropicalis ^ Mycoccocus arba Micococcus lactis + Micococcus lactis, arba Candida guillermondii + Acinetobacter oleovorum subsp. parafinium.
[0005] Minėtos mikroorganizmų kompozicijos trūkumas yra nepakankamas skirtingos sudėties naftos teršalų bei kitų angliavandenilių ardymas. Be to mikroorganizmų asociacija nėra stabili gamtinėje aplinkoje. Sunku parinkti kiekybinę mikroorganizmų asociacijos sudėtį, kuri leistų pilnai ir greitai suardyti teršalus.
[0006] Žinoma mikroorganizmų asociacija, pavadinta "DevouroiF", aprašyta patento RU 2 023 686, C02F 3/34, E02B 15/04, aprašyme. į šią asociaciją įeina Rhodococcus sp., Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri ir Candida sp.. Šis mikroorganizmų rinkinys skirtas vandens paviršiaus ir grunto, užteršto naftos produktais, išvalymui.
[0007] Šios mikroorganizmų asociacijos pagrindinis trūkumas tas, kad ji labiau tinka sūriam jūros vandeniui ar druskingam gruntui išvalyti. Be to ši asociacija aromatinius angliavandenilius ir naftenus oksiduoja silpnai.
[0008] Išradimo tikslas - išskirti naftą ir jos produktus oksiduojantį mielių štamą, kurį galima būtų panaudoti užteršto grunto ir vandens išvalymui suintensyvinti.
[0009] Siūlomas mielių Candida lipolytica C. 6.1-5 štamas buvo išskirtas iš Vilniaus miesto Naftos bazės teritorijos dirvožemio. Išskyrimo būdas apima dirvožemio vandeninės suspensijos paruošimą, paruoštos dirvožemio suspensijos užsėjimą ant agarizuotos sintetinės gliukozės-amonio terpės tokios sudėties (g/l): gliukozė - 20; (NH.O2SO.1 - 5; KH2PO4 - 0.85; K2HPO4 - 0.15: MgSOj - 0.5; NaCl - 0.1; CaCh - 0.1; levomicetinas - 0.1; agaras - 20; vanduo - 1000 ml. Mielių kultūra buvo auginama 4 paras, termostate 26 ± 2°C temperatūroje. Mielių identifikacija atlikta remiantis morfologiniais, fiziologiniais ir biocheminiais požymiais, naudojant N. J. W. Kreger - van Rij (1984) klasifikacinę sistemą.
[0010] Štamas Candida lipolytica C. 6.1-5 deponuotas Botanikos instituto Biodestruktorių tyrimo laboratorijos mikroorganizmų kolekcijoje 1998 m. rugsėjo mėn. 6 d., kolekcinis numeris IBL: Y - 12.
[0011] Siūlomas mielių Candida lipolytica C. 6.1-5 štamas pasižymi žemiau išvardintomis savybėmis.
[0012] Morfologinės savybės. Po 3 parų kultivavimo skystoje salyklo ekstrakto terpėje, esant 25°C temperatūrai, ląstelės ovališkos arba ištemptos, (2-4.5) x (4-22) pm. Pumpuruoja siauru, kartais plačiu pagrindu. Skystoje terpėje formuoja plėvelę ir nuosėdas. Stebimas pseudomicelis arba tikras micelis.
[0013] Agarizuotoje salyklo terpėje po 1 mėnesio kultivavimo kultūra kieminės spalvos, drėgna, minkšta, švelniai raukšlėta arba klostėta. Mikroskopuojant stebimas pseudomicelis ir šakotas, septuotas tikras micelis. Kartais formuoja artrosporas. Blastosporos yra sujungtos į mažas grandinėles.
[0014] Fiziologinės savybės. Rūgimo proceso nevykdo. Kaip vienintelį anglies šaltinį gali asimiliuoti: gliukozę. L - sorbozę, etanolį, glicerolį. eritritolį, D - manitą, pieno, gintaro ir citrinos rūgštį, n-heksadekaną. n- dekaną, naftaliną, naftą, mazutą. Neasimiliuoja: galaktozės, D - ribozės, L - ramnozės, sacharozės, maltozės, celobiozės, tregahozės, laktozės, melibiozės, rafinozės, melecitozės, inulino. krakmolo, D - ksilozės, L ir D - arabinozės, adonitolio (ribitolio), salicilo, inozito. Arbutino hidrolize nepasižymi. Produkuoja rūgštis. Bevitamininėje terpėje (Vitamin free yeast base "DIFCO", JAV) auga. Augimą stimuliuoja tiaminas. Optimali augimo temperatūra 27°C. Maksimali augimo temperatūra 33-37°C. Optimalus pH 5,0 - 5.5.
[0015] Fermentinis aktyvumas. Kokybiniais atrankos metodais nustatyta, kad štamas pasižymi ureaziniu ir lipaziniu fermentiniu aktyvumu.
[0016] Štamo laikymas. Štamas laikomas ant agarizuotos gliukozės-amonio terpės, mėgintuvėliuose. Reguliariai persėjamas. [ saugomo štamo mitybinę terpę įterpiami naftos angliavandeniliai. Štamai laikomi -r4°C temperatūroje.
[0017] Siūlomo štamo pirminė atranka buvo atlikta panaudojant kokybinius metodus. Atranka buvo atliekama ant agarizuotos mitybinės terpės tokios sudėties (g/l): mazutas - 10; (NH.O2SO4 - 5; KH;P04 - 0.85; K:HP04 - 0.15; MgS04 - 0.5; NaCl - 0.1; CaCl2 - 0.1; agaras - 20; vanduo - 1000 ml. Štamas augintas 5 paras termostate. 26 ± 2°C temperatūroje. Terpės pH 5. Naftą ir jos produktus oksiduojančio štamo aktyvumas buvo įvertintas pagal susidariusias skaidrias zonas aplink mikroorganizmą.
[0018] Terpes sudėties optimizavimo metodu, modifikuotoje Čapeko terpėje pagal absoliučiai sausos biomasės (ASB) kiekį buvo įvertinta įvairių fosforo šaltinių (kaulamilčių, superfosfato, Kemira Horti - 2 (NPK. 6-12-24)) įtaka naftos produktus oksiduojančių mielių Candida lipolytica C. 6.1-5 štamo augimui. Tyrimų duomenys pateikiami 1 lentelėje.
[0019] Iš pateiktų duomenų matyti, kad įvairūs fosforo šaltiniai nevienodai veikia atrinkto štamo augimą. Nustatyta, kad didžiausias ASB kiekis buvo gautas kultivuojant atrinktą štamą su kaulamilčiais. Kultivuojant su superfosfatu ir Kemira Horti - 2 trąšomis ASB kiekis buvo mažesnis nei kontrolėje (1 lentelė).
[0020] Siūlomo mielių štamo gebėjimas ardyti naftą ir jos produktus bei kai kuriuos aromatinius angliavandenilius pateikiamas pavyzdžiuose.
[0021] Siūlomas mielių Candida lipolytica C. 6.1-5 štamas kultivuojamas modifikuotoje Čapeko terpėje giluminiu būdu, kratyklėse.Terpės vieninteliu anglies šaltiniu buvo nafta. Terpės sudėtis (g/l): kaulamilčiai - 1.75; Mg S04 - 0.5; Fe S04 - 0.001; NH4NO3 - 1.5; KC1 - 0.5; vanduo - 1000 ml. Terpės pH 5.0 - 5.5. Kultivavimo temperatūra 26±2° C. Kiekybinė naftos analizė po 7 ir20 parų mielių kultivavimo buvo atlikta spektrometrijos metodu panaudojant naftos analizatorių ANVP -79.
[0022] Atrinktas mielių štamas buvo kultivuojamas terpėje, kurioje vieninteliu anglies šaltiniu buvo mazutas. Terpės sudėtis (g/l): mazutas - 10; (NH.O2SO4 - 5; KH2PO4 - 0.85; K2HPO4 - 0.15; MgS04-0.5; NaCl-0.1; CaCU-O.l; vanduo- 1000 ml. Terpės pH 5.0-6.5. Štamas kultivuotas giluminiu būdu, kratyklėse. Auginimo temperatūra 26 ± 2° C. Mazuto kiekybinis įvertinimas atliktas po 7 ir 20 parų Candida lipolytica C. 6.1-5 štamo kultivavimo. Nustatyta, kad po 7 parų kultivavimo mazuto kiekis sumažėjo 51.89 %, o po 20 parų - 81.68 %.
[0023] Atliktas bandymas, kuris savo parametrais atitinka 1 pavyzdyje aprašytą bandymą. Atrinktas štamas buvo kultivuojamas tos pačios sudėties terpėje, kaip ir 1 pavyzdyje. Skirtumas tas, kad vieninteliu anglies šaltiniu buvo pasirinktas aromatinis angliavandenilis - naftalinas 10 g/l. Kiekybinė naftalino analizė, po Candida lipolytica C. 6.1-5 štamo kultivavimo, atlikta dujų chromatografijos masspektrometrijos metodu panaudojant dujų chromatografą masspektrometrą 41Saturn 3".
[0024] Nustatyta, kad po 7 parų kultivavimo naftalino kiekis sumažėjo 64.91 %, o po 20 parų net 85.01%.
[0025] Naftos produktais užteršto grunto valymas. Valymo aikštelėje yra 100 tonų užteršto grunto, kurio pH 5.0 - 5.5. Naftos produktų 35 g/kg.Gruntas paskleidžiamas 0.5 m storio sluoksniu. Paruošiama Candida lipolytica C. 6.1-5 štamo suspensija ir sumaišoma su vandeniniu druskų tirpalu, į kurio sudėtį įeina 30 mg/l azoto (naudojamas amonio sulfatas) ir 25 mg/l fosforo (kaularniičiai). Ląstelių titras tirpale apie 3 x 10' ląstelių/ml. Paruoštas tirpalas įterpiamas į valomą gruntą jį išpurškiant 3 l/m2 kiekiu. Valomas ir tręšiamas NPK mineralinėmis trąšomis gruntas perkasamas, o vėliau kultivuojamas kas savaitę. Natūraliomis sąlygomis, esant oro temperatūrai ne žemesnei kaip 14 °C, dirvožemio išvalymo procesas trunka 1.5-2.5 mėnesio. Teršalų kiekis sumažėja 91.02 %.
1. Štamas Candida lipolytica C. 6.1-5 (deponuotas Botanikos instituto Biodestruktorių tyrimo laboratorijoje (LT), kolekcinis numeris IBL:Y - 12), oksiduojantis naftą ir jos produktus, pasižymintis stipriai išreikštu angliavandenilių destrukciniu aktyvumu.
2. Štamas Candida lipolytica C. 6.1-5, skirtas naftos produktais užteršto vandens ir grunto valymui.
3. Štamo Candida lipolytica C. 6.1-5 pagal 1 punktą gavimo būdas, beskiriantis tuo, kad štamo biomasę augina laboratorinėmis sąlygomis, naudojant skirtingas mitybines terpes, jos augimui palaiko temperatūrą ribose 14 - 29 °C ir pH ribose 5.0 - 6.5, po to ruošia suspensiją, kurią sumaišo su vandeniniu druskų tirpalu, į kurio sudėtį įeina 30 mg/l azoto ir 25 mg/l fosforo, ląstelių titras tirpale 3 x 107 ląstelių/ml natūraliomis sąlygomis, tinkamomis mieliagrybiui daugintis.