[LT] Šis išradimas yra iš medicinos srities, jis priklauso biologiškai aktyvių junginių, pasižyminčių imunoreguliuojančiomis savybėmis, gavimo būdams ir gali rasti pritaikymą medicinoje, veterinarijoje, otaip pat ir eksperimentinėje biochemijoje.@Išradimo tikslas - sukurti naują sintetinį biologiškai aktyvų peptidą, pasižymintį imunoreguliuojančiomis savybėmis, kurio formulė @@X-Glu-Trp-Y,@kurioje@X yra H arba Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, -aminosviesto rūgštis, -aminoheksano rūgštis;@Y yra Gly, Ala, Leu,Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, -aminosviesto rūgštis -aminoheksano rūgštis, -OH, mono- arba dipakeistas amidas (C1-C3).@Peptido sintezė vykdoma tirpale, nuosekliai ilginant grandinę nuo molekulės C-galo, panaudojant maksimalaus funkcinių grupių blokavimo strategiją, išeinant iš aminorūgšties alkilo esterio; sintezėje naudojamas aktyvuotų esterių metodas ir mišrių anhidridų metodas ir tre-butiloksikarbonilaminorūgštys.
[EN] The invention relates to medicine, specifically, to methods of obtaining biologically active substances with immunoregulating properties, and can be used in medicine and veterinary science and in experimental biochemistry. The fundamental problem addressed by the invention is that of producing a novel synthetic biologically active peptide with immuno-regulating properties and of the formula: X-Glu-Trp-Y, in which X is H or Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-PHe, D-Trp, -aminobutyric acid, -aminocaproic acid; Y is Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, -aminobutyric acid, -aminocaproic acid, -OH, mono- or di-substituted amide (C1-C3). Peptide synthesis takes place in a solution by successive growth of a chain from the C termination of the molecules, using a strategy of maximum blocking of functional `group`s, starting from amino acid alkyl ether, using the method of activated esters and the method of mixed anhydrides using tretbutyloxycarbonyl amino acid.
[0001] Šis išradimas yra iš medicinos srities, jis priklauso biologiškai aktyvių junginių, pasižyminčių imunoreguliuojančiomis savybėmis, gavimo būdams ir gali rasti pritaikymą medicinoje, vetrinarijoje, o taip pat ir eksperimentinėje biochemijoje.
[0002] Praktinėje medicinoje, kaip imuninių procesų reguliatoriai, yra gerai žinomi užkrūčio liaukos ekstraktai, konkrečiau - 5-osios frakcijos timozinas (Goldstein A. L., Guna A., Latz M. M., Hardy H. A., White A.), timalinas (CH, Nr.659586). Šie ekstraktai susideda iš polipeptidinės prigimties medžiagų komplekso, ir jų gavimą išgamtinių šaltinių riboja gamybos sudėtingumas, maža veikliųjų medžiagų išeiga ir didelis jų fizikinių-cheminių charakteristikų bei biologinių savybių nevienodumas. Be to, kadangi gamtiniuose užkrūčio liaukos preparatuose yra balastinių komponentų, ligoniams vartojant šiuos preparatus, dažnai atsiranda pašaliniai reiškiniai. Ši ypatybė pasitarnavo stimulu kurti sintetinius peptidus. Pastaruoju metu yra susintetinta keletas peptidų, kurie pasižymi imunoreguliuojančiomis savybėmis: PCT WO 089/06134, EP Nr. 230052, US Nr.5008246, US Nr. 5013723. Visi šie sintetiniai peptidai, turintys apribotą būtinų savybių kompleksą, pasižymi dideliu aktyvumu, mažu toksiškumu, jie neturi pašalinio poveikio ir todėl gali būti taikomi medicinoje.
[0003] Išradimo tikslas - sukurti naują sintetinį biologiškai aktyvų peptidą, pasižymintį imunoreguliuojančiomis savybėmis, kurio formulė
[0004]
[0005] kurioje
[0006] X yra H arba Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu,
[0007] D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosviesto rūgštis, Š-aminoheksano rūgštis;
[0008] Y yra Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D- Vai, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosviesto rūgštis, £,-aminoheksano rūgštis, -OH, mono- arba dipakeistas amidas (C1-C3).
[0009] Kitas išradimo tikslas yra sukurti iš esmės naują peptidinės prigimties medžiagų technologinį gavimo būdą, kuris, esant minimaliam kiekiui paprastų stadijų, duotų galimybę gauti aukščiau duotos formulės produktą geromis išeigomis.
[0010] Naujojo gamybos būdo esmę sudaro peptido sintezė tirpale, nuosekliai ilginant grandinę nuo molekulės C-galo, panaudojant maksimalaus funkcinių grupių
[0011] blokavimo strategiją, išeinant iš aminorūgšties alkilo esterio; sintezėje naudojamas aktyvuotų esterių metodas ir mišrių anhidridų metodas ir tret-butiloksikarbonilaminorūgštys.
[0012] 1-je lentelėje duotos kai kurių naujojo peptido junginių Rn (chloroformo-metanolio-32% acto rūgšties = 60:45:20 sistemoje) ir R^ (butanolio-piridino-vandens-acto rūgšties = 5:5:4:1 sistemoje) reikšmės.
[0013]
[0014] Aukščiau duotos formulės peptidas, gautas aprašytu būdu, yra balti milteliai, tirpūs vandenyje, mažai tirpūs alkoholyje ir praktiškai netirpūs chloroforme.
[0015] Šiame pavyzdyje aprašytas peptido, kurio formulė H-Ile-Glu-Trp-OH, gavimo būdas.
[0016] 46,0 g (0,2 mol) Boc-Ile-OH ir 40,5 g (0,22 mol) pentafluorfenolio mišinys 100 ml etilacetato atšaldomas iki -5 °C ir pridedama 45,3 g (0,22 mol) N,N-dicikloheksilkarbodiimido. Reakcijos mišinys maišomas 3 valandas kambario temperatūroje, dicikloheksilkarbamidas nufiltruojamas, tirpikliai nugarinami vakuume ir liekana perkristalinama iš etilacetato ir heksano mišinio. Iškritusios nuosėdos nufiltruojamos. Išeiga: 71,3 g (90 %).
[0017] 19,8 g (0,05 mol) Boc-Ile-OPFP ištirpinama 100 ml dimetilformamido ir maišant supilamas 20 g (0,06 mol) Glu-Trp ir 5,0 g (0,06 mol) NaHCCb tirpalas vandenyje. Tirpalas maišomas 20 vai. kambario temperatūroje, po to tirpikliai nugarinami vakuume. Į liekaną įpilama 200 ml etilacetato ir 200 ml 2 % sieros rūgšties tirpalo ir pamaišoma. Organinis'sluoksnis plaunamas sieros rūgšties tirpalu (2 x 100 ml), sočiu NaCl tirpalu iki pH = 7, džiovinamas bevandeniu natrio sulfatu, ir tirpiklis nugarinamas vakuume. Liekana perkristalinama iš etilacetato ir heksano mišinio, nuosėdos nufiltruojamos ir džiovinamos vakuume. Išeiga: 20,5 g (75 %).
[0018] 20,5 g Boc-Ile-Glu-Trp-OH ištirpinama 150 ml skruzdžių rūgšties, pamaišoma 3,5 vai. 45 °C temperatūroje, ir tirpiklis nugarinamas vakuume. Į liekaną įpilama 200 ml vandens ir dar kartą nugarinama vakuume. Į liekaną įpilama 300 ml izopropanolio, 200 ml eterio ir laikoma 10 vai. Nuosėdos nufiltruojamos ir džiovinamos vakuume. Išeiga: 15,3 g (75 %).
[0019] Peptidas valomas atvirkštinių fazių chromatografijos metodu, panaudojant
[0020] Tiriant peptido fizikines-chemines savybes, gautos tokios jo charakteristikos: pirminė struktūra - H-Ile-Glu-Trp-OH;
[0021] Bruto formulė - C24H30N4O4;
[0022] molekulinė masė - 446,5 Da;
[0023] išvaizda - balti su šiek tiek gelsvu atspalviu arba pilki milteliai;
[0024] tirpumas - tirpus vandenyje, praktiškai netirpus chloroforme;
[0025] UV spektro 250-300 nm srityje yra maksimumas ties 280±2 nm ir išlinkimas
[0026] Naujojo peptido biologinis aktyvumas buvo tirtas su jūrų kiaulytėmis, panaudojant bendrai priimtą E-rozečių susidarymo testą. 2-je lentelėje duoti užkrūčio liaukos preparatų ir šio išradimo peptido poveikio j jūrų kiaulyčių limfocitų E-rozečių susidarymo, apdorojus tripsinu, procesą palyginamieji duomenys.
[0027] Nustatyta, kad šio išradimo peptidas in vitro yra 103 kartų aktyvesnis už
[0028] Norint ištirti šio peptido nekenksmingumą, buvo atliekami jo ūmaus toksiškumo tyrimai. Ūmus toksiškumas buvo tirtas pagal Rusijos Federacijos Farmakologijos Komiteto metodines rekomendacijas "Trebovanija k dokliničeskomu izučeniju obščetoksičnogo deistvija novych farmakologičeskich veščestv", M., 1985 m.
[0029] Rezultatų tyrimai parodė, kad 1000 kartų didesnės peptido dozės suleidimas į pilvą nerodė ūmaus toksiškumo ir esant tokioms dozėms negalima pasiekti jo LD50.
[0030] Šis biologiškai aktyvus peptidas gali rasti platų pritaikymą medicinoje ir
[0031] . veterinarijoje.
1. Peptidas, kurio formulė
2. Peptido, kurio formulėX-Glu-Trp-Y,. kuriojeX yra H arba Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu,D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosviesto rūgštis, ^-aminoheksano rūgštis;Y yra Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile,D- Vai, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosviesto rūgštis, ^-aminoheksano rūgštis, -OH, mono- arba dipakeistas amidas (C1-C3),gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad tirpale vykdo aminorūgšties alkilo esterio reakciją su tret-butiloksikarbonilaminorūgštimi, po to nuosekliai ilgina peptidinę grandinę aktyvuotų esterių metodu ir mišrių anhidridų metodu vieną po kitos prijungia tret-butiloksikarbonilaminorūgštis, prieš tai atskėlę kiekvienoje stadijoje tret-butiloksikarbonilo grupę, apdorodami reakcijos mišinį skruzdžių rūgštimi, ir po to išvalydami tarpinius produktus perkristalinimo būdu, ir gauna X-Glu-Trp-Y formulės produktą, kurį išvalo atvirkštinių fazių chromatografijos metodu.
. kuriojeX yra H arba Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu,D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosviesto rūgštis, ^-aminoheksano rūgštis;Y yra Gly, Ala, Leu, Ile, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile,D- Vai, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosviesto rūgštis, ^-aminoheksano rūgštis, -OH, mono- arba dipakeistas amidas (C1-C3),gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad tirpale vykdo aminorūgšties alkilo esterio reakciją su tret-butiloksikarbonilaminorūgštimi, po to nuosekliai ilgina peptidinę grandinę aktyvuotų esterių metodu ir mišrių anhidridų metodu vieną po kitos prijungia tret-butiloksikarbonilaminorūgštis, prieš tai atskėlę kiekvienoje stadijoje tret-butiloksikarbonilo grupę, apdorodami reakcijos mišinį skruzdžių rūgštimi, ir po to išvalydami tarpinius produktus perkristalinimo būdu, ir gauna X-Glu-Trp-Y formulės produktą, kurį išvalo atvirkštinių fazių chromatografijos metodu.D- Vai, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminosviesto rūgštis, ^-aminoheksano rūgštis, -OH, mono- arba dipakeistas amidas (C1-C3),