[LT] Išradimas priklauso mikrobiologijos, biotechnologijos sritims, būtent, mikroorganizmų štamams, skaidantiems angliavandenilius, jų gavimo būdui ir gali būti panaudotas naftos produktais užteršto dirvožemio (grunto) valymui, jo toksiškumo augalams sumažinimui ir galutiniam dirvožemio struktūros bei jo biologinių savybių atstatymui. Štamas Trichoderma harzianum VNB-16 (deponuotas Botanikos institutoBiodestruktorių tyrimo laboratorijoje (LT), kolekcijos Nr. IBL: F-431) - naftos produktus skaidantis štamas, introdukuotas išlieka aktyvus grunte, antagonistiškai veikia jame esančius fitopatogeniniusmikroorganizmus ir sumažina naftos produktais užteršto dirvožemio toksiškumą augalams.
[EN] The present invention relates to microbiology, biotechnology and environment protection, particularly, to the strains of microorganisms destroying hydrocarbons, to process for preparing thereof. It can be used for reclamation of soil contaminated with oil products, for reducing toxicity of contaminated soil and recovering the soil structure and biological properties. The strain Trichoderma harzianum claimed (deposited with the Laboratory of biodestructors of the Institute of botany (LT), deposition number IBL: F-4310 is an oil products destroying strain which is active being introduced into soil, affecting in an antagonistic manner phytopathogenic soil microorganisms and reducing toxicity of soil contaminated with oil products.
[0001] Išradimas priklauso mikrobiologijos, biotechnologijos sritims, būtent, mikroorganizmų štamams, skaidantiems angliavandenilius, ir gali būti panaudotas užteršto naftos produktais dirvožemio (grunto) valymui.
[0002] Žinomas bakterijo: Rhodococcus erythropolis štamas BKM Ac-1339D, aprašytas aut. 1. SU 1 805 097, C02F 3/34, išradimo aprašyme. Šis štamas naudojamas vandens ir dirvos valymui nuo naftos ir naftos produktų.
[0003] Štamo trūkumas - bakterijos geba degraduoti tirpius angliavandenilius. Nepasižymi gebėjimu skaldyti mazutą. Be to, bakterijos, įterptos į dirvožemio mikroorganizmų bendriją, sunkiau išsilaiko kitų mikroorganizmų aplinkoje.
[0004] Žinomas mikromicetas Candida guillermondii BKM Y-241, aprašytas patento RU 2 007 372, C02F 3/34. E02B 15/04. aprašyme. Šis štamas naudojamas vandens ir dirvos apvalymui m o užteršimo nafta ir naftos produktais.
[0005] Šio štamo trūkumas - nesugeba skaldyti mazutą. Mikromicetas negerina dirvožemio struktūros, sunkiau dauginasi patekęs į natūralias dirvožemio mikroorganizmų bendrijas.
[0006] Artimiausias savo veikimu siūlomam štamui yra štamas Actinomucor elegans TC-405, aprašytas patento US 4 415 662 aprašyme. Šis štamas yra naftos ir naftos produktų biodestruktorius.
[0007] Šio Štamo esmini* trūkumas - naudojamas naftos produktams skaldyti vandenyje, negerina dirvožemio struktūros ir nepasižymi antagonistinėmis savybėmis fitopatogeniniams mikroorganizmams.
[0008] Išradimo tikslas - išskirti štamą, kuriam būdingas gebėjimas skaldyti naftos angliavandenilius, tame tarpe mazutą. įgalinantis pagreitinti naftos produktų utilizaciją dirvožemyje, atstatyti jo struktūrą ir biologinį aktyvumą.
[0009] Siūlomas mikroorganizmo štamas buvo išskirtas iš Vilniaus naftos produktų bazės teritorijos užteršto smėlio, prisotinto industriniais tepalais. Išskyrimo būdas apima dirvožemio vandeninės suspensijos paruošimą; paruoštos suspensijos užsėjimą ant agarizuotų alaus misos ir modifikuotos Čapeko terpių, kai anglies šaltiniu naudojamas 1% mazuto. Tokia terpė naudojama naftą oksiduojančių mikromicetų štamų aptikimui, kultūros išgryninimui ir monosporinės kultūros išskyrimui. Mikromicetas auginamas termostate prie 26±2 °C temperatūros 7 paras, štamas identifikuotas pagal kultūrinius ir morfologinius požymius naudojant M. A. Rifai klasifikaciją.
[0010] Štamas deponuotas Botanikos instituto Biodestruktorių tyrimo laboratorijos mikroorganizmų kolekcijoje, kolekcinis numeris IBL: F-431.
[0011] Siūlomas štamas Trichoderma harzianum VNB-16, auginant jį ant skirtingų terpių, pasižymi tokiomis savybėmis:
[0012] Agarizuota alaus misos terpė. Kolonijos auga greitai. Po 3 parų kolonijos pasiekia 50 mm, o po 5 parų - 90 mm diametrą. Kolonijos paviršius tamsiai žalios spalvos, micelis tankus, gana aukštas, purus su daugeliu vatos pavidalo gniužulėlių. Apatinė kolonijos pusė bespalvė. Kultūros kvapas specifinis.
[0013] Agarizuota Čapeko mineralinė terpė. Kolonijos auga lėčiau - po 3 parų siekia 35, po 7 - 90 mm skersmenį. Kolonijos šviesiai žalsvos su baltais ir žalsvais puriais micelio gniužulėliais. Kolonijos apatinė pusė gelsva.
[0014] Saburo- dekstrozės agarizuota terpė. Kolonijos auga greitai, po 3 parų siekia 45, po 5 - 90 mm skersmenį. Micelis labai tankus, auga koncentriškais žiedais, kolonijos kraštas
[0015] Hifai septuoti, išsišakoję, lygiasieniai, bespalviai, 1,5-10,0 |.i skersmens. Šoninės šakelės dažniausia1 išsidėsčiusios grupėmis po 2-3.
[0016] Fialides trumpos, kėgliškos, 4,5-8,0 x 2,5-3,5 |i dydžio, dažniausiai išsidėsto grupėmis po 5, bet gali būti pavienės.
[0017] Konidijos smulkios, rutulio arba trumpo ovalo formos, lygiasienės, žalios spalvos, išsidėsčiusios fialidžių viršūnėse, sudaro rutulio pavidalo netikras galvutes. Vidutiniškas konidijų dydis 2,8-3,2x-2,5-2,8 jj..
[0018] Anglies šaltiniai: štamas gerai įsisavina gliukozę, sacharozę, galaktozę, ksilozę, karboksimetilceliuliozę. Silpniau įsisavina organinių rūgščių druskas, krakmolą, gliceriną.
[0019] Azoto šaltiniai: štamas gerai įsisavina amonio druskas, NaN03, peptoną, asparaginą. Silpnai įsisavina kazeiną.
[0020] Štamas gerai auga ant gamtinių substratų, pavyzdžiui, augalų atliekų, grūdų. Aerobas. Augimo temperatūra 15-363C, optimali - 26-30°C. Auga terpėje, kurios rūgštingumas
[0021] Štamas pasižymi fermentiniu aktyvumu: produkuoja proteazes, celiuliazes. Nebūdinga tirozinazės, lakazės sintezė.
[0022] Štamas pasižymi dideliu antibiotiniu poveikiu į kai kuriuos fitopatogeninius grybus, pvz., Rhizocionia soluni, Fusarium moniliforme, F. oxysporum, F. solcini, Alternaria alternata Tačiau jis nėra antagonistas naftos angliavandenilius skaldančioms bakterijoms ir mikromicetams-mielėms, o pastarųjų ( Candida lipolytica, Rhodotorula lactosa, Rhodotorula sp. ir kt.) augimą netgi stimuliuoja.
[0023] Štamo gebėjimas oksiduoti naftos angliavandenilius buvo vertinamas pagal augimą ant agarizuotos Čapeko terpės su 1% dyzelinio kuro ir mazuto. Mikromiceto štamų kolonijų diametras (mm) po 7 parų auginimo ant Čapeko terpės ir Čapeko terpės su naftos produktais pateikiamas 1 lentelėje.
[0024]
[0025] Ant mineralinės Oapeko terpės su 1% mazuto štamo Trichodermci harzictnum kolonijos auga greitai - po 7 parų pasiekia 90 mm skersmenį. Kolonijos plonos, micelis žemas, silpniau gamina žalią pigmentą, kolonijos pilkos spalvos su baltais gniužulėliais.
[0026] Štamas, augdamas mineralinėje terpėje su mazutu naudoja įvairius fosforo šaltinius: kaulamilčius, superfosfatą, Kemira-Horti 2 trąšas (NPK 6:12:24). Siūlomo Trichoderma harzianum VNB-16 štamo augimo kolonijų diametras (mm) po 7 parų ant agarizuotų terpių su įvairiomis trąšomis bei mazutu pateiktas 2 lentelėje .
[0027]
[0028] Geriausiai orinio micelio formavimąsi, augant terpėje su mazutu veikia 0,4 ir 0,75 g/l Kemiros trąšų bei 1 g/l superfosfato priedas.
[0029] Skystoje terpėje su Kemiros trąšomis ir mazuto bei dyzelinio kuro mišiniu (santykis 1:1) siūlomas štamas auga gerai, mazutas per 7 paras suskyla į mažus dribsnius. Biomasės prieaugis pateikiamas 3 lentelėje.
[0030] Daržo dirvožemis (400 g) supilamas į vegetacinius indus, į juos įpilama 50 ml mikroorganizmų pagalba degraduoto mazuto. Užkrečiama siūlomo štamo suspensija 1x106 - 1x107 pradų/g. [ dirvožemį pasodinami lubinai. Po 6 savaičių auginimo mikrobiologinė analizė parodė, kad mikromicetas išgyveno ir vystėsi mazuto atliekomis užterštame dirvožemyje. Angliavandenilių kiekis per šį laikotarpį tiriamame dirvožemyje sumažėjo nuo 2388 iki 370 mg/l, t.y. 6,5 karto.
[0031] Aukščiau pateiktų duomenų apibendrinimas rodo, kad siūlomas štamas Trichoderma harzianum VNB-16 pasižymi gebėjimu skaldyti mazutą ir gali būti naudojamas naftos produktų utilizacijai pagreitinti bei dirvožemio kokybei atstatyti.
[0032] Siūlomo Trichoderma harzianum VNB-16 štamo auginimas skystoje mineralinėje terpėje pridedant kaip vienintelį anglies šaltinį naftos angliavandenilius.
[0033]
[0034] Pridedama mazuto arba naftalino 1% kaip vienintelio anglies šaltinio. Išpilstoma po 50 ml į 500 ml talpos kratyklines kolbas. Terpė sterilinama autoklavuojant 30 min. prie 0,5 atm. [ ataušusią terpę užsėjama 2 ml 7 parų amžiaus štamo Trichoderma harziamim sporų suspensijos. Štamas inkubuojamas ant kratytuvų 7-20 parų prie 26±2° temperatūros. Po 7 auginimo parų mazutas suskyla į smulkius dribsnius, o po 20 parų lieka tik šviesiai rudas skystis.
[0035] Suskaldyto naftos produkto kiekis auginant štamą 7 ir 20 parų pateikiamas 4 lentelėje.
[0036] Iš pateiktų duomenų matyti, kad siūlomas štamas Trichoderma harzianum VNB-16 skaldo platų angliavandenilių spektrą: angliavandenilius, kurie sudaro sunkiąsias naftos frakcijas - naftaliną ir mazutą.
[0037] 2 pavyzdvs
[0038] Siūlomo štamo Trichoderma harziamim VNB-16 panaudojimas naftos produktų utilizacijai dirvožemyje kompostavimo būdu.
[0039] Substrato užkratui mikromiceto biomasę augina laboratorijoje steriliomis sąlygomis. Po 6-7 parų kultivavimo ant agarizuotos alaus misos terpės 26±2°C temperatūroje ruošia mikromiceto sporų suspensiją. Konidijos nuplaunamos steriliu fiziologiniu tirpalu ir gauta suspensija praskiedžiama, palaikant grybų pradų titrą 1 xlO6 - Ixl07/1 ml. Paruoštą suspensiją naudoja užteršto grunto užkrėtimui.
[0040] Naftos produktais užterštas gruntas sukasamas į krūvas, sumaišomas su azotinėmis bei fosforo trąšomis, aplaistomas arba apipurškiamas mikromiceto sporų suspensija, gerai permaišomas. Užkrėstas mikromicetu substratas natūraliomis sąlygomis (esant 10 - 30° C temperatūrai, palaikant optimalią kompostuojamo grunto drėgmę) laikomas
2 - 3 mėnesius, periodiškai sekamas mikromiceto vystymasis ir naftos produkto kaita valomajame grunte.Aukščiau aprašytu būdu valant gruntą, lyginant su kontroliniu pavyzdžiu, kuriame nebuvo inokuliuotas Trichoderma harzianum VNB-16 užkratas, po 30 d. mazuto sumažėjo 85% . Grunto konsistencija pasikeitė. Jis pasidarė puresnis, prarado naftos kvapą.
3 pavvzdvsAukščiau aprašyto apvalyto nuo naftos produktų grunto panaudojimas augalų auginimui - galutinei dirvožemio remediacijai.Apvalytas nuo naftos produktų gruntas nėra toksiškas aukštesniesiems augalams. Sėklų daigumas mazutu užterštame grunte be mikromiceto Trichoderma harzianum VNB-16 buvo 50%, su Trichoderma harzianum VNB-16 - 80 %. Lubinų žaliosios masės prieaugis per 2 savaites - atitinkamai 0,86 ir 1,46 g/egz.Apvalytas gruntas gali būti panaudtas augalams auginti ir galutinai atstatyti dirvožemio struktūrą bei jo biologines savybes, kadangi introdukuotas mikromiceto Trichoderma harzianum VNB-16 štamas išlieka aktyvus dirvoje, antagonistiškai veikia fitopatogeninius mikroorganizmus ir sumažina naftos produktais užteršto dirvožemio toksiškumą augalams.
1. Štamas Trichoderma harziamim VNB-16 (deponuotas Botanikos instituto Biodestruktorių tyrimo laboratorijoje (LT), kolekcijos Nr. IBL: F-431) - naftos produktus skaidantis štamas, antagonistiškai veikiantis fitopatogeninius mikroorganizmus ir sumažinantis naftos produktais užteršto dirvožemio toksiškumą augalams.
2. Štamas Trichoderma harziamim VNB-16 skirtas panaudoti naftos produktais užteršto dirvožemio valymui ir atstatymui.
3. Štamo Trichoderma harzianum VNB-16 pagal 1 punktą gavimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad paruošia naftos produktais užteršto grunto vandeninę suspensiją paruoštą suspensiją užsėja ant agarizuotų alaus misos ir modifikuotos Čapeko terpės, kai anglies šaltiniu yra 1% mazuto, tokią terpę panaudoja naftą skaidančių mikromicetų štamų aptikimui, jų kultūros išgryninimui ir monosporinės kultūros išskyrimui, mikromicetą augina termostate prie 26 ± 2°C temperatūros 7 paras ir štamą identifikuoja pagal kultūrinius ir morfologinius požymius naudojant M. A. Rifai klasifikaciją.
4. Štamo Trichoderma harziamim VNB-16 pagal 1 ir 2 punktus, gauto pagal 3 punkto būdą panaudojimo mazutu užteršto grunto valymui būdas, besiskiriantis tuo, kad mikroorganizmo biomasę augina mitybinėse terpėse laboratorinėmis sąlygomis, po to ruošia mikromiceto biomasės vandeninę suspensiją, kurioje mikromiceto pradų titras yra apie 10M07/1 ml, iš anksto paruoštą substratą užkrečia mikromiceto suspensija jį laistant arba apipurškiant minėta suspensija, po to substratą permaišo ir palaiko drėgmę, tinkamą štamui daugintis ir išlikti aktyviam substrate-grunte.
5. Apvalyto būdu pagal 4 punktą grunto panaudojimas augalams auginti ir galutinai atstatyti dirvožemio struktūrą bei jo biologines savybes.