[LT] Pateikiamas rekombinantinio gripo hemagliutinino baltymo gavimo būdas ekspresuojant šį baltymą vabzdžių ląstelėse ir tam tikslui panaudojant bakuloviruso ekspresijos sistemą.@Šiuo būdu gautas baltymas naudojamas multivalentinės gripo vakcinos gamybai, kurios pagrindą sudaro mišinys rekombinantinių hemagliutininų antigenų, gautų klonavimui panaudojus gripo virusus, pasižyminčius epideminiu potencialu. Rekombinantininiai hemagliutinino baltymai yra viso ilgio nesuskaidyti (HAO) glikoproteinai įskaitant abu HA1 ir HA2 subvienetus (HAO), kurie išvalomi nedenatūruojančiomis sąlygomis iki 95 % ar didesnio, o geriausiai iki 99 % grynumo.@Geriausiame išradimo įgyvendinime pateikiama, kokiu būdu gripo hemagliutinino genai, paimti iš A ir B virusų, yra klonuojami panaudojant tam tikslui specialiai sukurtas oligonukleotidų sekas ir polimerazės grandininės reakcijos metodologiją.@Pateikiamas bendras būdas kaip ekstrahuoti ir išskirti rekombinantinį HA baltymą, pagamintą vabzdžių ląstelėse, aprašant rHA baltymų išskyrimą iš A potipių ir B tipo gripo virusų.
[EN] A method of preparing a recombinant influenza vaccine using DNA technology is provided. The resulting vaccine is a multivalent, preferably trivalent, influenza vaccina based on a mixture of recombinant hemagglutinin antigens cloned from influenza viruses having epidemic potential. The recombinant hemagglutinin antigens are full lenght, uncleaved (HAO), glycoproteins produced from baculovirus expression vectors in cultured insect cells and purified under non-denaturing conditions. In the preferred embodiment, the cloned HA genes are then modified by deletion of the natural hydrophobic signal peptide sequences and replacing them with a new baculovirus chitinase signal peptide. A general approach for the efficient extraction and purification of recombinant HA protein produced in insect cellsis also disclosed for the purification of rHA proteins from A sub-types and B-type influenza viruses.
[0001] Šis išradimas priklauso rekombinantinių gripo vakcinų sričiai.
[0002] Gripo epidemijos kyla kasmet ir yra viena iš svarbių žmonių sergamumo ir mirtingumo pasaulyje priežasčių, Dažniausiai suserga vaikai ir jie daugiausiai išplatina gripo virusą žmonių bendruomenėje. Vyresnio amžiaus ir ligoti žmonės daugiau rizikuoja, kad jiems gripo infekcija komplikuosis ir juos reikės hospitalizuoti. Vien tik Jungtinėse valstijose 1956 ir 1988 metų laikotarpyje kiekvieno iš septynių gripo sezonų metu užregistruota daugiau kaip 10,000 mirčių atvejų dėl pneumonijos ir gripo, ir daugiau kaip 40,000 mirčių atvejų užregistruota
[0003] kiekvieno iš dviejų sezonų metu ( Šiuolaikiniai Duomenys: Gripo Aktyvumas - Jungtinės Amerikos Valstijos ir Pasaulis, ir 1992-1993 metų
[0004] Gripo Vakcinos Sudėtis , Morbiditv and Mortalitv VVeeklv Report. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, 41/No.
[0005] 18: 315-323, 1992).
[0006] Gripo virusai yra labai pleomorfiškos dalelės, sudarytos iš dviejų paviršiaus glikoproteinų - hemagliutinino (HA) ir neuraminidazės (NA). HA sąlygoja viruso prikibimą prie šeimininko ląstelės ir viruso bei ląstelės apvalkalėlių susiliejimą virusui skverbiantis j ląstelės vidų. Gripo viruso genomą sudaro aštuoni vienasiūliai neigiamos prasmės RNR fragmentai,
[0007] iš kurių keturi didžiausi segmentai koduoja HA geną. Gripo virusai, priklausomai nuo jų antigenų, skirstomi j A, B ir C tipo virusus. Gripo A virusai įvardijami naudojant nomenklatūrą, j kurią jeina potipis ar tipas, geografinė kilmė, kamieno numeris ir išskyrimo metai. Pavyzdžiui, A/Pekinas/353/89. Nustatyta mažiausiai 13 HA potipių (H1-H13) ir 9 NA potipiai -N1-N9). Visi šie potipiai aptinkami paukščiuose ir tik H1-H3 ir N1-
[0008] N2 aptinkami pas žmogų, kiaules ir arklius (Murphy and VVebster "Ortomiksovirusai", Virology, red. Fields, B.N., Knipe D.M., Chanock R.M., 1091-1152 (Raven Press, New York, (1990)).
[0009] Antikūnai HA neutralizuoja virusą ir sudaro natūralaus imuniteto gripo infekcijai pagrindą (Clements, "Gripo vakcinos", knygoje "Vakcinos: Imunologinių problemų nauji sprendimo būdai", red. Ronald W. Ellis, P. 129-150 (Buttervvorth-Heinemann, Stoneham, MA 1992)). HA molekulės antigeninis variavimas sąlygoja dažnus gripo protrūkius ir ribotą infekcijos kontrolę imunizuojant,
[0010] Trimatė HA sandara ir jo sąveika su atitinkamu ląstelės receptoriumi, sialo rūgštimi, ištirta gerai (VVilson ir kt. "Gripo viruso apvalkalėlio glikoproteino hemagliutinino sandara 3 A skiriamoje geboje", Nature 289:366-378 (1981); Weis ir kt., " Gripo viruso hemagliutinino, sujungto su jo receptoriumi, sialo rūgštimi, sandara", Nature. 333:426-431
[0011] (1988); Murphy ir VVebster, 1990). HA molekulė virione yra trimero forma. Kiekvienas monomeras sudarytas iš dviejų grandinių, HA1 ir HA2, sujungtų bisulfidine jungtimi. Infekuotos šeimininko ląstelės gamina 85,000 molekulinės masės glikozilintą polipeptidą kaip pirmtaką, kuris vėliau suskyla j HA1 ir HA2.
[0012] IgG ir IgA antikūnų, specifinių gripo HA, buvimas yra susijęs su organizmo atsparumu infekcijai ir ligai (Clements, 1992). Inaktyvuotos gripo vakcinos, sudarytos iš viso viruso ar dalinai išgrynintos (subvienetinės), standartizuojamos pagal pagal kiekvieno kamieno HA kiekj. Paprastai gripo vakcinos turi nuo 7 iki 25 mikrogramų kiekvieno iš trijų gripo viruso kamienų HA.
[0013] Kito pagrindinio apvalkalėlio glikoproteino - NA vaidmuo apsauginiame gripo imunitete (humoraliniame ar T-ląstelių sąlygotame) kol kas neištirtas. Neuraminidazė yra labai neatspari gryninant ir saugojant (Murphy ir VVebster, 1990), ir todėl NA kiekis dabartinėse gripo vakcinose nestandartizuojamas. Išgryninta HA, bet ne NA, vakcina apsaugo gyvūnus nuo gripo (Johansson ir kt., "Išgrynintas gripo viruso hemagliutininas ir neuraminidazė yra ekvivalentiški stimuliuojant antikūnų atsaką, tačiau sukelia skirtingo pobūdžio imunitetą infekcijai", J. Viroloav, 63:1239-1246
[0014] (1989)). Tiriant žmones, nenustatyta, kad bandomoji vakcina, paruošta neuraminidazės pagrindu, gali apsaugoti (Orga ir kt., J. Infect. Dis. 135: 499-506 (1977)).
[0015] Licenzinės gripo vakcinos sudarytos iš formalinu inaktyvuotų ar chemiškai suskaidytų subvienetų, pagamintų iš dviejų gripo A potipių
[0016] (H1N1 ir H3N2) ir vieno gripo B potipio virusų. Prieš kiekvieną gripo sezoną JAV Maisto ir Vaistų Administravimo (FDA) Vakcinų ir Giminingų Biologinių Medžiagų Patarėjų Komitetas rekomenduoja ateinančiam sezonui trivalentės gripo vakcinos sudėtį. 1992-93 metų vakcina savo sudėtyje turėjo A/Teksasas/36/91 (H1N1), A/Pekinas/353/89 (H3N2) ir B/Panama/45/90-panašius virusus.
[0017] FDA rekomendavo, kad 1993-94 metų gripo vakcina turėtų turėti tuos pačius Teksaso ir panamos kamienus ir naują gripo A Pekino kamieną (A/Pekinas/32/92).
[0018] Asmenų, priklausančių aukštos rizikos grupei, vakcinavimas kiekvienais metais prieš gripo sezoną yra efektyviausia priemonė, padedanti sumažinti gripo infekcijos poveikj. Dabartinių vakcinų trūkumai
[0019] yra : mažas jų vartojimo lygis; mažas efektyvumas vyresnio ir jaunesnio amžiaus vaikams; jų gamyba kiaušiniuose; antigeninės variacijos ir pašalinės reakcijos.
[0020] Ligų Kontrolės Centras (LKC) nustatė, kad mažiau kaip 30% individų, priklausančių didelės rizikos susirgti gripu grupei, yra kasmet vakcinuojami (MMWR, 1992). Šiuolaikinės inaktyvuotos vakcinos sveikiems suaugusiems sąlygoja aukštą apsaugos prieš infekciją lygį tuo atveju, kai vakcinos antigenai yra giminingi cirkuliuojačių virusų antigenams. Tuo tarpu vyresnio amžiaus žmonėms, ypač ligotiems, apsauga prieš infekciją yra silpnesnė (Clements,1992). Ankstyvesniuose tyrimuose, kuriuos atliko Povvers ir Belshe, J. Inf. Dis. 167:584-592 (1993), žymus antikūnų atsakas į trivalentę gripo subvirionų vakciną stebėtas mažiau kaip 30% individų, kuriems buvo 65 ir daugiau metų.
[0021] A ir B gripo vakcinoms naudojami gamtiniai virusų kamienai, kurie dauginasi dideliais titrais viščiuko kiaušinio alantojinšinio alantojinėje ertmėje. Tuo tarpu kamienas, naudojamas gripo A komponentui gauti, priklauso perršiuotam virusui, turinčiam reikalingus paviršiaus antigenų genus. Perrūšiuotas virusas - tai toks virusas, kuris turi reikalingus paviršiaus antigenų genus. Perrūšiuotas virusas - tai toks virusas, kuris dėl virusinio genomo segmentacijos pasižymi kiekvieno tėvo kamieno charakteristikomis. Kuomet ląstelę infekuoja daugiau negu vienas viruso kamienas, tuomet šie virusiniai segmentai susimaišo ir jų palikuonių virionai turi įvairų abiejų tėvų genų rinkinj.
[0022] Apsauga, gaunama panaudojant vakcinacijai šiuolaikines pilnas ar suskaidytas gripo vakcinas, yra trumpalaikė ir tampa neveiksminga, jeigu gripo epideminiuose kamienuose jvyksta antigeninis poslinkis (dreifas). Gripo virusams būdingas antigeninis poslinkis vyksta dėl imuninės selekcijos, atrenkančios virusus, kurių hemagliutinino molekulėje yra pakitusios aminorūgščių sekos. Idealiai, tai vakcinos kamienai turėtų atitikti ligą sukeliančius viruso kamienus. Tačiau šiuolaikinių gripo vakcinų gamybą riboja viruso auginimas viščiuko embriono kiaušiniuose. Ne visi viruso kamienai vienodai gerai dauginasi kiaušinyje. Tokie virusai turi būti adaptuoti arba turi būti sukurti perrūšiuoti virusai. Kiaušiniuose auginamų virusų hemagliutininas labai greitai heterogenizuojasi ir skiriasi nuo pirminio viruso, išskirto iš infekuotų individų ir augintų žinduolių ląstelėse, hemagliutinino (Wang ir kt., Virol. 171:275-279 (1989); Rajakumar ir kt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4154-4158 (1990)). HA pokyčiai dėl selekcijos ir gripo vakcinų gamyba gali duoti antigeniškai skirtingų virusų subpopuliacijų mišinj. Todėl vakcinos virusai gali skirtis nuo epideminio kamieno variantų. To pasėkoje apsaugos lygis gali būti suboptimalaus lygio.
[0023] Asmenims, kurie yra labai alergiški kiaušinio baltymui, dėl šio baltymo likučių vakcinoje gali išsivystyti ūmaus hiperjautrumo reakcijos. 1976 metais kiaulių gripo vakcina buvo susieta su Guillain-Barrė sindromu. Kol kas nepastebėta, kad vėlesnės vakcinos, pagamintos iš kitų gripo kamienų, būtų iššaukusios šios retos ligos atvejų pagausėjimą.
[0024] Gripo vakcinos gamybos būdas, nereikalaujantis kiaušinių panaudojimo, galėtų pateikti grynesnj produktą, kuris nesukeltų pašalinių imuninių reakcijų. Be to, grynesnės vakcinos paruošimas nereikalautų ' viruso inaktyvacijos ar organinio virusinio apvalkalėlio komponentų ekstrahavimo, todėl būtų išvengta antigeninių epitopų denatūracijos bei chemikalų likučių vakcinoje.
[0025] Be to, gripo vakcina pagaminta nenaudojant viruso auginimo kiaušinyje padėtų išvengti genetinio heterogeniškumo, kuris pasitaiko adaptacijos metu pasažuojant ir auginant virusą kiaušinyje. Tai duotų tokią vakciną, kuri labiau atitiktų gripo epideminiams kamienams ir būtų efektingesnė.
[0026] Šio išradimo objektas yra gripo vakcinos gamybos būdo, nereikalaujančio viruso auginimo kiaušinyje, pateikimas. • Kitas šio išradimo objektas yra greito ir pigaus gripo vakcinos gamybos būdo, leidžiančio gauti labai gryną produktą iš pirminių gripo šaltinių, pateikimas.
[0027] 1 Fig. - tai HA genų, gautų iš gripo A kamienų išskirtos virusinės RNR, klonavimo, ekspresuoto rHA išskyrimo ir rHA biologinės charakteristikos schema.
[0028] Santrumpos: FDA - Maisto ir Vaistų Administravimas; MDCK - Madin Darby šunų inkstas; TPCK - tozilfenilalanil chlorometilketonas; RNA ribonukleino rūgštis; cDNA - komplementari dezoksiribonukleino rūgštis; HA - hemagliutininas; FBS - fetalinis veršiuko serumas; PCR - polimerazės grandininė reakcija ir BV - bakulovirusas. 2 Fig. -metodo, paminėto 1 Fig. ir skirto gripo viruso kamieno A/Teksasas/36/91 HA geno klonavimui ir ekspresijai, detalesnė schema. Gripo HA genas gautas iš RNR, išskirtos iš MDCK ląstelių, užkrėstų gripo virusu A/Teksasas/36/91. Tam tikslui panaudota atvirkštinė transkriptazė ir universalus pradmuo (SEQ ID No. 1), atlikti du PCR amplifikacijos ciklai ir klonuota. Kaip parodyta schemoje, PCR pirmojo ciklo metu naudotas 5' galo pradmuo SEQ ID No. 2 ir 3' galo pradmuo SEQ ID No. 3. PCR antrojo ciklo metu naudotas 5' galo pradmuo SEQ ID No. 4 ir 3' galo pradmuo SEQ ID No. 5. Bakuloviruso rekombinacijos vektorius sudarytas iš polihedrino promotoriaus ir signalinio peptido sekų, gautų iš bakuloviruso 61K geno ( bakuloviruso genas, koduojantis apie 61,000 molekulinės masės signalinį peptidą ) bei sekų, koduojančių subrendusį HA baltymą. Šis rekombinacijos vektorius panaudotas bakuloviruso ekspresijos vektoriaus, sąlygojančio šio kamieno viruso HA produkciją, konstravimui. Fig. 4a, 4b ir 4c - grafikai, rodantys anti-HA imuninį atsaką pas peles, kurios buvo imunizuotos rHA arba licenzine 1994-1995 metų sudėties trivalentine vakcina, ašyse: savaitės po vakcinacijos ir H1A titras. Fig. 4a- HA1 A/Teksasas/36/91; Fig. 4b - HA1 A/Šangdongas/9/93 ir Fig. 4c - HA1 B/Panama/45/90; rHA (daugiakampiai) ir FLUVIRON® patenuota vakcina, kultivuota kiaušiniuose (kvadratai).
[0029] Detaliai aprašomas rekombinantinės gripo vakcinos gavimo būdas. Gripo viruso viso ilgio nesuskaldytas (HAO) hemagliutinino antigenas gaunamas panaudojant bakuloviruso ekspresijos vektorius vabzdžių ląstelių kultūroje ir po to jis išskiriamas nedenatūruojančiose sąlygose. Gripo A ir/ar gripo B kamienų du ar daugiau išgrynintų hemagliutinino antigenų sumaišomi kartu tam, kad būtų gauta multivalentinė gripo vakcina. Tam, kad būtų padidintas efektyvumas, rekombinantinius antigenus galima sumaišyti su adjuvantiniais nešėjais.
[0030] Rekombinantinės DNR technologijos panaudojimas gripo vakcinų gamybai pasižymi keletu privalumų: rekombinantinė gripo vakcina gali būti pagaminta saugesnėmis ir labiau kontroliuojamomis sąlygomis; nereikia gripo viruso auginti kiaušiniuose; rekombinantinis HA baltymas gali būti labiau išgrynintas; išvengiama galimų pašalinių efektų dėl užteršimo kitais baltymais; išskiriant rekombinantinį HA, nereikia inaktyvuoti viruso ar organiniais tirpikliais ekstrahuoti virusinio apvalkalėlio komponentus, ir todėl išvengiama antigenų denatūracijos, o be to nėra pavojaus, kad vakcinoje lieka chemikalų; HA gamyba panaudojant rekombinantinę DNR technologiją, leidžia išvengti genetinio heterogeniškumo, kuris gali atsirasti viruso adaptacijos ir pasažavimo kiaušiniuose metu, o tai savo ruožtu sudaro prielaidas tam kad vakcinos kamienai labiau atitiks gripo epideminius kamienus ir tai savo ruožtu padidins vakcinos efektyvumą; rekombinantinis metodas leidžia geriau parinkti kamieną, suteikdamas laiko atrenkant vadovautis patikimesniais epidemiologiniais duomenimis.
[0031] Bakulovirusai -.tai DNR virusai, priklausantys Baculoviridae šeimai. Žinoma, kad šie virusai turi siaurą šeimininkų ratą, kuris apima tik vabzdžių Lepidopteran rūšis (drugelius ir kandis). Bakulovirusas Autographa californica branduolio polihedrozės virusas (Nuclear Polyhedrosis Virus) (AcNPV), kuris tapo bakulovirusų prototipu, sėkmingai dauginasi jautriose vabzdžių ląstelių kultūrose. AcNPV turi dvisiūlės uždaros žiedinės DNR genomą, susidedantį iš apie 130,000 bazių porų ir jo priklausomybė šeimininkui, molekulinė biologija ir genetika yra gerai apibūdinta.
[0032] Daugelis bakulovirusų, įskaitant AcNPV, infekuotų ląstelių branduoliuose sudaro didelius baltymo kristalinius darinius - kūnelius. Šiuose kūneliuose beveik 95% visos baltymo masės sudaro vienarūšis polipeptidas, vadinamas polihedrinu. Polihedrino genas AcNPV viruso genome egzistuoja vienos kopijos forma. Kadangi polihedrino genas nevaidina jokio vaidmens viruso replikacijoje užkrėstose ląstelėse, todėl jį galima modifikuoti svetimų genų ekspresijai. Svetimo geno seka įterpiama į AcNPV genomą 3' gale kaip tik prie polihedrino promotoriaus sekos tam, kad šis svetimas genas atsidurtų polihedrino promotoriaus transkripcijos kontrolėje.
[0033] Rekombinantiniai bakulovirusai, ekspresuojantys svetimus genus, yra sukonstruojami panaudojant homologinę rekombinaciją tarp bakuloviruso DNR ir chimerinių plazmidžių, turinčių norimo geno sekas. Rekombinantiniai virusai detektuojami pagal skirtingą poveikio zonos morfologiją bei homogeniškai išgryninus.
[0034] Bakulovirusai itin gerai tinka eukariotiniam klonavimui ir kaip ekspresijos vektoriai. Jie yra saugūs, kadangi jų šeimininkų ratas apsiriboja artropodais - nariuotakojais. JAV Aplinkos Apsaugos Agentūra (EPA) aprobavo trijų bakulovirusų naudojimą vabzdžių kenkėjų kontrolei. Pagal EPA Eksperimentinio Naudojimo leidimą AcNPV daugelį metų naudojamas derlingumui pakelti.
[0035] Laukinio tipo AcNPV bei rekombinantiniai virusai dauginasi įvairiose vabzdžių ląstelėse, įskaitant pastovias ląstelių linijas, kilusias iš Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). S. frugiperda ląstelių
[0036] populiacijos padvigubėjimo laikas yra nuo 18 iki 24 valandų. Jos gali būti auginamos kaip vienasluoksnės arba kaip suspenzinės kultūros.
[0037] Rekombinantiniai HA baltymai gali būti produkuojami ląstelių kultūrose, kilusiose iš S. frugiperda (ir ne tik jose). Ląstelių kultūras, kilusias iš kitų rūšių vabzdžių, tokių kaip Bombix mori, Galleria mellanoma, Trichplusia ni, arba Lamanthria dispar, taip pat galima panaudoti rekombinantinių HA baltymų gamybai.
[0038] Tinkamiausia šeimininko ląstelių linija rekombinantinio bakuloviruso baltymo produkcijai yra linija Sf900+. Kita tinkama šeimininko ląstelių linija rekombinantinio bakuloviruso baltymo produkcijai yra linija Sf9. Sf900+ ir Sf9 yra netrasformuotos, netumorogeninės pastovios ląstelių linijos, kilusios iš Spodoptera frugiperda (Lepidoptera); Noctuidae). Sf900+ ir Sf9 ląstelės auginamos 28±2° C temperatūroje be anglies dvideginio priedo. Sf9 ląstelėms naudojama TNMFH terpė (paprastas mišinys druskų, vitaminų, angliavandenių ir aminorūgščių) su 10% fetalinio veršiuko serumo. Jokie kiti gyvūninės kilmės produktai (pvz., tripsinas ir pan.), išskyrus fetalinj veršiuko serimą, nenaudojami. Kultūros terpes be serumo
[0039] galima taip pat naudoti Sf9 ląstelių auginimui, o taip pat ir Sf900 ląstelių.
[0040] Sf900 ląstelių populiacijos padvigubėjimo laikas yra 18-24 vai. Jas galima auginti ir kaip vienasluoksnes, ir kaip suspenzines kultūras.
[0041] Nepaskelbta jokių duomenų, kad S. frugiperda ląstelėse gali replikuotis koks nors žinomas žinduolių virusas.
[0042] Specialistai supranta, kad ekspresijos vektoriumi gali būti panaudota ne tik bakuloviruso ekspresijos sistema. Rekombinantiniai HA baltymai gali būti ekspresuojami ir panaudojant kitus ekspresijos vektorius, tokius kaip Entomopox virusai (vabzdžių poksvirusai), citoplazminės polihedrozės virusai (CPV). Vabzdžių ląsteles galima galima transformuoti rekombinantiniu HA genu ar genais ir gauti pastovią ekspresiją.
[0043] Vienas ar daugiau gripo viruso kamienų išskiriami iš asmenų, segančių gripu. Tinkamiausi yra tie gripo viruso kamienai, kuriuos nustatė FDĄ arba CDC ir apibūdino, kad jie turės epideminj potencialą sekančiam gripo sezonui. Čia aprašomo būdo 'privalumas yra tai, kad tiesioginiu viruso gavimo šaltiniu gali būti panaudota klinikinė medžiaga tokia, kaip ligonių, infekuotų gripo virusu, nosies išskyros.
[0044] Kamienai auginami ląstelėse, kurios gali produkuoti didelius viruso titrus, tokiose kaip Madin Darby šunų inkstų (MDCK) ląstelės (jas galima gauti iš Amerikietiškos Kultūrų Kolekcijos, numeris ATCC CCL34. MDCK ląstelės, pavyzdžiui, užkrečiamos j terpę pridėjus tozilfenilalanil chlorometilketono (TPCK) ir dalinai inaktyvavus tripsiną bei pridėjus fetalinio veršiuko serumo tokia koncentracija, kuri yra optimaliausia didžiausių titrų pirmojo pasažo viruso produkcijai. MDCK ląstelės užkrečiamos gripo viruso kamienais mažiausia infekcijos dauginimosi doze (0.1 - 0.5 ), nustatoma pagal standartinį HA vertinimo būdą ( Rosen, "Hemagliutinacija, sukeliama gyvūnų virusų" knygoje "Virusologijos Pagrindiniai Metodaired. K. Habel ir N.P. salzman, p. 276-28 (Academic Press, New York 1969), kuris pateikiamas ir šiame išradimo aprašyme. Infekuotos ląstelės inkubuojamos prie 33° C 48 valandas ir terpėje vertinama viruso produkcija panaudojant hemagliutinacijos aktyvumo testą. Tos auginimo sąlygos, kurių metu gautas didžiausias HA aktyvumas yra naudojamos ir ruošiant didelius gripo viruso kiekius.
[0045] Virusinės dalelės, produkuotos pirmojo pasažo metu, išskiriamos iš terpės panaudojant žinomą išskyrimo būdą - centrifūgavimą sacharozės gradiente. Pavyzdžiui, virusas, praėjus 24-48 vai. po infekcijos, surenkamas centrifūguojant gripo virusu infekuotų MDCK ląstelių terpę. Virusinės nuosėdos resuspenduojamos buferyje ir centrifūguojamos užbuferintame sacharozės gradiente, Gripo virusai, esantys gradiento 40-45% sacharozės zonoje, surenkami, atskiedžiami' buferiu ir centrifūguojami 100,000 x g. Išskirto viruso nuosėdos resuspenduojamos buferyje ir.saugojamos -70° C temperatūroje.
[0046] HA genų klonavimo, panaudojant šj metodą , schema pateikiama
[0047] Fig. 1. Ląstelės užkrečiamos tuo gripo viruso kamienu, kurį norima klonuoti. Virusas išskiriamas iš iš ląstelių kultūros terpės ir po to, jeigu tai yra gripo viruso A kamienai, išskiriama virusinė RNR, o , jeigu tai yra B kamienai, išskiriama mRNR. Virusinė RNR (- RNR) ekstrahuojama iš išgrynintų virionų ir tiriama formaldehido agarozės geliuose standartiniu metodu. cDNR sintezuojama naudojant arba universalią pradmenų sistemą, skirtą gripo viruso A kamienų virusinei RNR, arba naudojant atsitiktinius pradmenis, skirtus gripo viruso B kamienų mRNR. Plius-standartinė komplimentari DNR (cDNR) sintezuojama panaudojant universalų oligonukleotidų pradmenj (5' -AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID No. 1), kuris yra homologiškas A ir B gripo virusų visų hemagliutinino RNR segmentams (Davis ir kt. " Bakterinio klono, turinčio gripo viruso WSN kamieno (HON1) hemagliutinino geną, konstravimas ir apibūdinimas ". gene, 10: 205-218 (1980). Sukuriami pradmenys, kurie yra homologiški gripo viruso hemagliutinino geno 5' ir 3' galų konservatyviesiems rajonams. Tiek 5', tiek 3' galo pradmenys turi galuose vietas restrikcijos fermentams, kurių nėra hemagliutinino gene.
[0048] Atitinkami gripo viruso A arba B pradmenys yra sumaišomi su gripo viruso cDNR ir, naudojant standartinį PCR būdą, atliekama hemagliutinino geno segmentų amplifikacija. Reakcijos metu gauti dvisiūlės DNR segmentai turi subrendusį hemagliutininą koduojančias sekas. Polimerazės grandininė reakcija (PCR) yra naudojama viso HA geno amplifikacijai. Po to genas klonuojamas panaudojant tinkamą bakteriją - šeimininką tokj, kaip E. coli. 5' galai sekvenuojami tam, kad būtų identifikuotas HA genų signalinis peptidas. Tada vėl panaudojamas PCR būdas tam, kad būtų amplifikuoti HA genai, bet jau be signalinio peptido. Gautas produktas subklonuojamas plazmidiniame pernešimo vektoriuje, kuris turi AcNPV polihedrino promotorių. Tuomet pernešimo vektoriai turi tokias 5' - >3' sekas: A californica NPV bakuloviruso polihedrino promotorius, ATG transliacijos startinis kodonas, 61K bakuloviruso signalinis peptidas, sekos, koduojančios subrendusį hemagliutininą, natūralus hemagliutinino transliacijos terminacijos kodonas, polihedrino RNR poliadenilinimo signalas ir aprėminanti bakuloviruso DNR.
[0049] Išskirta chimerinė pernešanti plazmidinė DNR, turinti klonuotą hemagliutinino geną, sumaišoma su AcNPV laukinio tipo DNR, išsodinama precipituojant su kalciu ir transfekuojama į S. frugiperda ląsteles. Rekombinantiniai bakulovirusai atrenkami, remiantis poveikio zonų morfologijos skirtumais, ir toliau yra atrenkami naudojant papildomą selekciją. Klonuoti rekombinantiniai virusai patikrinami, kaip jie ekspresuoja hemagliutininą, atrenkamas vienintelis bakuloviruso ekspresijos vektorius, kuris panaudojamas Pagrindinio Viruso Banko sukūrimui.
[0050] Gripo viruso A kamienų HA genai klonuojami panaudojant išskirtus virusinės RNR preparatus. Virusinė RNR ektrahuojama paėmus 100-200 mikrolitrų išvalytų gripo A virionų, turinčių 1,000-2,000 hemagliutinacijos vienetų (HAU). Vienas HAU - tai viruso kiekis, kuris agliutinuos 50% raudonųjų kraujo kūnelių, vertinant standartiniu agliutinacijos metodu (Rosen, 1969). Virionai paveikiami proteinaze K, kuri suskaido baltymą, tuomet virusinė RNR yra ekstrahuojama fenolu/chloroformu lygiomis dalimis ir nusodinama etanoliu panaudojant tRNR nešėją. Virusinė RNR resuspenduojama buferyje ir paveikiama DNR-aze, neturinčia RNR-azės, tam, kad būtų pašalinta bet kokia DNR priemaiša, po to ekstrakcija ir precipitacija yra pakartojamos. Virusinė RNR (vRNR) tiriama formaldehido agarozės geliuose pagal metodą, aprašytą Maniatis ir kt. Molekulinis klonavimas: Laboratorinis vadovas. P. 86-96 ir 366-367 (Cold Spring Harbor lab., Cold Spring, N.Y. 1982).
[0051] Gripo virusų B kamienų HA genai klonuojami panaudojant visuminę
[0052] (totalinę) mesendžerinę.RNR (mRNR), išskirtą iš ląstelių, užkrėstų gripo viruso B kamienu. Visuminė RNR ektrahuojama iš infekuotų ląstelių. Užaugintos ląstelės lizuojamos panaudojant guanidium tiocianatą ir visuminė RNR yra išvaloma, panaudojant, pavyzdžiui, RNR Ektrahavimo Rinkinį, pagamintą Pharmacia Biotech Inc. (Piscatavvay, N J). Totalinė mRNR išskiriama iš ląstelinės RNR panaudojant Oligo-(dt)-celiuliozės
[0053] pluošto kolonėles, panaudojant, pavyzdžiui, mRNR Išskyrimo Rinkinj, pagamintą Pharmacia Biotech Inc.
[0054] Rekombinantinio hemaaliutinino ekspresija ir brendimas vabzdžiu ląstelėse
[0055] Rekombinantinio hemagliutinino antigenai ekpresuojami dideliais kiekiais S. frugiperda ląstelėse, infekuotose AcNPV-hemagliutinino vektoriais. Pirminis geno produktas yra nesubrendęs pilno ilgio hemagliutininas (rHAO) ir jis iš ląstelės nėra sekretuojamas, o lieka susijungęs su infekuotos ląstelės periferinėmis membranomis. Šis rekombinantinis HAO yra 68,000 molekulinės masės baltymas, kurį glikozilina prie N-galo prisijungę manozės tipo glikanai, besiskiriantys nuo glikanų, produkuojamų virusinių baltymų ekspresijos žinduolių ar paukščių ląstelėse metu. Įrodyta, kad rHAO sudaro posttransliacinius trimerus, kurie kaupiasi citoplazminėse membranose.
[0056] HAO labiau tinka vakcinai, kadangi jis yra žymiai stabilesnis, palyginus su HA1/HA2 kompleksu, ir jo sankloda nepakinta valant ar saugojant. Stabilumo privalumai ypač išryškėja dirbant su B kamienais, jų titrai yra penkis kartus didesni palyginus su komerciniais atenuotais B kamienais.
[0057] Kaip aprašyta žemiau pateiktuose pavyzdžiuose, kuomet HA genai buvo klonuoti pMGS12 per restrikcijos saitus, HA subrendęs signalinis peptidas buvo pašalintas ir pakeistas bakuloviruso chitinazės signaliniu peptidu, nurodomu kaip 61 kD signalinis peptidas. Kadangi HA genas yra sujungtas su chitinazės signaliniu peptidu per skaidymo vietą, tai, priklausomai nuo pasirinkto restrikcijos saito, tarp subrendusio HAO baltymo ir 61 kD signalinio peptido yra trys - penkios aminorūgštys. Su gripo viruso A kamienais šiuo požiūriu nėra problemų, tačiau B kamienų HAO, ekspresuotas su papildomomis aminorūgštimis, klostosi ne taip kaip jp rasta.
[0058] Sugalvoti du būdai šiai problemai išspręsti. Pirmas būdas - panaudoti naują vektorių, pMGS3, kuris nekoduoja 61 kD signalinio peptido. HAO su savo jprastu signaliniu peptidu yra klonuojamas vektoriuje ir ekspresuojamas. SDS-PAGE analizė rodo, kad B kamienų HAO, ekspresuotas šiame vektoriuje, pasižymi geresniu glikozilinimu ir brendimu negu tuomet, kai yra ekspresuotas pMGS12. HAO susiklosto taip gerai, kad gali būti kiekybiškai konvertuotas j HA1/HA2. Tačiau, deja, kaip parodė tyrimai VVestern blotingo būdu, baltymo išeiga nėra didelė. Antras būdas - padidinti išeigą panaudojant 61 kD signalinj peptidą pMGS12 nukreipiant ekspresiją, tuo atveju, kai HAO genas jterptas nepanaudojant restrikcijos fermentų. Naujas vektorius, turintis 61 kD signalinį peptidą ir HAO geną, bet neturintis sekų, koduojančių įsiterpiančias aminorūgštis, yra nurodomas kaip pMGS27.
[0059] PMGS27 gali būti panaudotas bet kokio geno klonavimui ir ekspresijai bakuloviruso ekspresijos sistemoje. Genas - taikinys, vietoje to, kad būtų klonuotas vektoriuje, panaudojant restrikciją ir ligavimą, yra klonuojamas j vektorių anylingo būdu. Reikalingi reagentai gaunami iš Clontech panaudojant jų PCR-sąlygotą Klonavimo Sistemą. pMGS27 konstruojamas tokiu būdu, kad jis galėtų būti linearizuotas chitinazės signalinį peptidą koduojančio rajono gale. Prie linijinės pMGS27 fago T4 DNR pridėjus dATP ir veikiant polimeraze, gaunamos dvi ilgos vienasiūlės uodegėlės.
[0060] Genas - taikinys amplifikuojamas panaudojant polimerazės grandininę reakciją (PGR) arba atvirkštinės transkriptazės-PGR (RT-PGR), naudojant porą oligonukleotidų, tinkamų sukūrimui vienasiūlių uodegėlių, kurios yra komplementarios uodegėlėms paveiktos pMGS27, kuri buvo gauta PGR fragmentą veikiant T4 DNr-polimeraze ir dTTP. Paprastu anylingu galima sujungti dvi molekules į žiedinę plazmidę, kuri galės transformuoti ląstelę šeimininkę. Be to, kad šis būdas yra greitesnis ir paprastesnis negu tradicinis restrikcijos-ligavimo metodas, naudojamas klonuojant HA geną pMGS12, ši pMGS27 pasižymi tokiu svarbiu privalumu, kad ji neduoda papildomų aminorūgščių, koduojamų restrikcijos saitų, sukurtų tarp chitinazės signalinio peptido ir subrendusio HA baltymo. Šios papildomos aminorūgštys kartais sukelia sunkumų, kuomet signalinė peptidazė negali skaidyti signalinio peptido arba kai baltymas susiklosto neteisingai, kaip tai atsitinka, pavyzdžiui, kamieno B HA atveju.
[0061] Praėjus keletai dienų po užkrėtimo, rHAO galima selektyviai ekstrahuoti iš AcNPV-hemagliutininu infekuotų ląstelių periferinių membranų, panaudojant nedenatūruojantį nejoninį detergentą ar kitus būdus, kurie naudojami rekombinantinių baltymų išskyrimui iš vabzdžių ląstelių, įskaitant tame tarpe ir gelio chromatografiją bei jungimą prie antikūnų. Detergente tirpale esantį rHAO galima toliau išskirti DEAE jonų kaitos būdu ir panaudojant lęšių lektinoafininę chromatografiją, arba kitus ekvivalentinius žinomus metodus.
[0062] Variante, kuriam skiriama pirmenybė, rHAO išskiriamas naudojant būdą, kuris yra švelnesnis ir leidžia gauti didesnį gripo viruso B kamienų rHAO kiekį. Darbo eiga atrodo sekančiai: HAO baltymas, sudarantis vabzdžių ląstelių membranų integralinę dalį, išskiriamas iš tirpių baltymų, periferinės membranos baltymų, daugumos DNR ir RNR , gauto ekstrahavus ląsteles santykinai klampiame šarminiame tirpale, kurio pH yra tarp 9.5 ir 10.5. Klampumas didinamas pridedant sacharozės iki 250 mM koncentracijos. Pridedama disulfidines jungtis redukuojančio agento, pavyzdžiui, p-merkaptoetanolio, tokia koncentracija, kuri padėtų išvengti disulfidinių jungčių tarp baltymų, esančių mišinyje, susidarymo. Ląstelė suspenduojamos ekstrakcijos buferyje, homogenizuojamos ir po to centrifūguojamos. Nuosėdos plaunamos homogenizuojant mažos joninės jėgos buferyje, kuriame pridėta disulfidus redukuojančio agento šarminiame pH (laidumas mažiau negu 1 mS, pH 10.5) ir po to nuosėdos centrifūguojamos. HAO ekstrahuojamas iš nuosėdų buferyje, kuriame yra nuo 0.3 iki 1.5 % detergento tokio, kaip Tritonas, dezagreguojančio agento tokiame kiekyje, kuris neleidžia susidaryti kompleksams dėl jų elektrinu krūvių sąveikos, tokio kaip nuo 0.3 iki 1.o M betaino ar paurino, 6arminiame pH (geriausiai 9.5). HAO iš supernatanto išskiriamas anijonų kaitos chromatografijos būdu, po to panaudojant katijonų kaitos chromatografiją. HAO kraunamas j anijonų kaitos kolonėlę, pavyzdžiui, DEAE ar Q-sefarozė® (agarozės rutuliukų kolonėlė suketvirtinėmis amino grupėmis), tame pačiame buferyje, kuris naudotas ekstrahavimui, tačiau atskiestame mažiausiai 1:2 papildomu buferiu, ekvilibruojant kolonėlę buferiu, kuriame yra apie 1/10 dalį detegento ir disulfidus-redukuojančio agento. Po to HAO eliuojamas mažinant pH iki 8.5. Eliuotas HAO kraunamas ų katijonų kaitos kolonėlę tame pačiame buferyje. Kontaminantai pašalinami eliuojant mažinant pH iki maždaug 7.4, po to, padidinus druskos koncentraciją iki 0.15 M NaCI, eliuojamas HAO.
[0063] Šis išskyrimo būdas, kuriam skiriama pirmenybė, aprašomaa toliau smulkiai: Membranų frakcijos, savo sudėtyje turinčios rekombinantini HA, išskyrimas. Ląstelės, ekspresuojančios rekombinantinj HA, ( 6,2 g ląstelių iš 0,34 L kultūros) suspenduojamos iki 100 mg/mL koncentracijos ledo vonioje atšaldytametirpale, kuriame yra100 mM natrio pirofosfato, 100 mM natrio chlorido, 250 mM sacharozės, 0.1% p-merkaptoetanolio, pH 10,5. Ląstelės suardomos panaudojant panaudojant Polytron® homogenizatorių (Brinkman Instruments Inc., VVestbury, NY), 4 ciklai po 2 min. Homogenizacinė terpė yra šarminio pH, kadangi siekiama padidinti pašalinių baltymų tirpumą ir membranų preparatų grynumą. Homogenatas centrifūguojamas 30 min. 9,200 g. Supernatantas pašalinamas ir ir nuosėdos surenkamos. Po to membraninė frakcija plaunama mažos joninės jėgos tirpalu. Nuosėdos resuspenduojamos iki pradinio tūrio ledo vonioje atšaldytame tirpale, kurio sudėtyje yra 0.1% p-merkaptoetanolio, pH 10.5, ir homogenizuojamos panaudojant Polytron® homogenizatorių , 4 ciklai po 2 min. Homogenatas centrifūguojamas 30 min, 9,200 g. Supernatantas pašalinamas ir nuosėdos surenkamos. Plaunant mažos joninės jėgos tirpalu, pašalinami papildomi -periferinių membranų baltymai. Membranų frakcijos paruošimas suteikia galimybę gauti didesnį rekombinantinio HA kiekį bei pašalinti nukleino rūgštis.
[0064] Rekombinantinio HA ekstrahavimas. Po to rekombinantinis HA selektyviai ekstrahuojamas iš membraninių nuosėdų naudojant sąlygas, kuriose nedenatūruojamas antigenas. Membraninės nuosėdos homogenizuojamos 41 m L ledo vonioje atšaldyto tirpalo, kurio sudėtyje
[0065] yra 10 mM etanolamino pH 9.5, 1% Tritono N101, 0.1% p-merkaptoetanolio, 25 mM NaCI, 400 mM betaino, homogenizuojama 4 ciklais po 2 min. Po inkubuojama 40 min 23°, mišinys centrifūguojamas 3o min. 9,200 g. Supernatantas su rekombinantiniu HA filtruojamas ir atskiedžiamas per pusę tuo pačiu buferiu.
[0066] Baltymai tiriami SDS poliakrilamido gelio elektroforezės būdu.
[0067] Bandiniai, pridėjus 2% natrio dodecilsulfato (SDS) ir 5% p-merkaptoetanolio, kaitinami verdančio vandens vonioje 10 min, po to atliekama elektroforezė 11% poliakrilamido gelyje, kurio sudėtyje yra 0.1% SDS, po to dažoma Coomassie mėliu.
[0068] Chromatografinis išskyrimas. Rekombinantinio HA chromatografinis išskyrimas buvo supaprastintas ir apsieita be brangios afininės chromatografijos, naudojančios Lęšinio Lėktino Sefarozę, pakeičiant ją dvižingsniu chromatografinio išskyrmo procesu, leidžiančiu gauti labai išgrynintą rekombinantinį HA antigeną, kuris yra nedenatūruotas ir tinkamas kaip komponentas gripo viruso vakcinai, skirtai žmonėms. Naudojamos Pharmacia Q-Sepharose ® Fast Flow ir CM-Sepharose Fast Flow® chromatografijos gelio matricos.
[0069] Anijonų- kaitos chromatografija. Visos chromatografijos atliekamos kambario temperatūroje. Rekombinantinio HA ekstraktas,
[0070] gautas kaip nurodyta aukščiau, 1 ml_ tūryje pakraunamas j kolonėlę su . Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow® (5 mL C10/C10 Pharmacia kolonėlė), išlyginama su 10 mM etanolaminu pH 9.5, 0.1% Tritonu® N101, 0.01% p-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCI, 400 mM betainu. Po to kolonėlė plaunama ekvilibravimo buferiu tol, kol efluento UV absorbcija grįžta prie pagrindinės linijos. Šiomis sąlygomis rekombinantinis HA prisiriša prie kolonėlės, kai tuo tarpu pašalinės medžiagos išplaunamos. Po to dalinai išvalytas rekombinantinis HA eliuojamas 30 mM dietanolaminu pH 8.5, 0.1% Tritonu N101®, 0.01% p-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCI, 400 mM betainu.
[0071] Katijonų- kaitos chromatografija. Q-Sefarozės eliuatas (23 mL) skiedžiamas du kartus 30 mM dietanolaminu pH 8.5, 0.1% Tritonu N101®, 0.01% p-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCI, 400 mM betainu. Kolonėlė po to praplaunama 35 mL 10 mM natrio fosfato pH 7.4, 0.1% Tritonu N101®, 0.01% (3-merkaptoetanoliu, 25 mM NaCI, 400 mM betainu. Plovimas pašalina pašalines medžiagas iš kolonėlės, kai tuo tarpu rekombinantinis HA lieka prisijungęs prie CM Sefarozės. Po to detergentas pašalinamas praplaunant kolonėlę 10 mM natrio fosfatu pH 7.4, 10 mM NaCI, kol efluento UV absorbcija grįžta prie pagrindinės linijos. Išvalytas rekombinantinis HA eliuojamas fosfatiniu buferiniu druskos tirpalu, pH 7.5
[0072] (PBS).
[0073] Išvalytas rHAO resuspenduojamas izotoniniame buferiniame tirpale. Nuo detergento išvalytas rHAO efektyviai agliutinuoja eritrocitus.
[0074] rHAO išvalomas iki mažiausiai 95% grynumo, o geriausiai iki 99% grynumo. SDS-poliakrilamido gelyje jis keliauja kaip vienas pagrindinis 68,000 molekulinės masės polipeptidas. Išskirto rekombinantinio HA0 ketvirtinė struktūra ištirta elektroniniu mikroskopu, nustatytas ' rezistentiškumas tripsinui, atlikta sedimentacijos gradiente analizė, nustatytas sugebėjimas agliutinuoti eritrocitus. Tyrimų duomenys rodo, kad rekombinantinis HAU sudaro trimerus, kurie susirenka į rozetes.
[0075] Išskirtas rHAO neagliutinuoja ląstelių tol, kol nepašalinamas detergentas, todėl spėjama, kad tam, kad jis galėtų suklijuoti viščiuko eritrocitus, antigenas turi sudaryti kompleksus (rozetes). Išskirto rHAO kiekybinis sugebėjimas agliutinuoti ląsteles naudojamas antigeno buvimo įvertinimui. Vienas hemagliutinino vienetas apibrėžiamas kaip antigeno kiekis, reikalingas 50% . agliutinacijai pasiekti standartiniame hemagliutinacijos teste su viščiukų eritrocitais. Palyginamieji duomenys rodo, kad išskirti rHAO antigenai agliutinuoja eritrocitus panašiu efektyvumu kaip ir gripo virionai.
[0076] Rekombinantinis HA0 gali būti suskaidytas ties disulfidine jungtimi, tai sukelia konformacinius pokyčius, pasireiškiančius dviejų grandinių HA1 ir HA2 atsiradimu, kuris buvo aprašytas Carr C.M. ir Kim P.S. "Gripo viruso hemagliutinino konformacinio pokyčio mechanizmas", Cell , 73: 823-832 (1993) (nuoroda įtraukta). Rekombinantinio HAO skaidymas aprašytas detaliau žemiau pateikiamame 6 pavyzdyje. Tikimasi, kad suskaidžius natūralų HAO į HA1 ir HA2, grandinės tampa infekcinėmis, jgyja sugebėjimą įsilieti į ląstelę, tuo būdu sukeldamos geresnį imuninį atsaką. Tokų antigenų, kaip gripo viruso hemagliutininas, paruošimas (procesingas) vyksta prisijungiant antigeniniams peptidams prie pagrindinio audinių suderinamumo komplekso (MHC) molekulių. Antigeno/MHC kompleksą atpažįsta T ląstelės ir inicijuojamas imuninis atsakas taip, kaip tai aprašyta Harding ir Heuze apžvalgose, Current Opinion in Cell Biology 5: 596-605 (1993), kurios taip pat įjungtos į literatūros sąrašą. rHAO, produkuojamas bakuloviruse, tačiau yra labai stabilus ir imunogeniškas kaip intaktinė molekulė. Palyginus ekspresuoto vabzdžių ląstelėse HAO angliavandenių molekules, rasta, kad glikanai skiriasi nuo tų, kurie yra pas HAO, kuriuos ekspresuoja žinduolių ar paukščių ląstelės.
[0077] Sulieti baltymai, susidedantys iš HAO, sulieto su antru antigeniniu baltymu, gali būti ruošiami tais atvejais, kuomet antrojo baltymo antigeniškumas yra mažas arba yra privalumai sukeliant imuninį atsaką į daugelį antigenų. Antrojo antigeno, kuriam teikiama pirmenybė, pavyzdžiu yra gripo viruso produkuojama neuraminidazė. Antigeną gali sudaryti ląstelinis, virusinis ar bakterinis baltymas arba antigeno dalis, turinti nors nuo penkių iki -aštuonių aminorūgščių, Kiti antigenai gali būti sudaryti iš hepatito B viruso, ŽIV antigenų ar karcinoembrioninio antigeno. Šiuo atveju kaip "imuninis atsakas" bus vertinamas arba humoralinis atsakas pagal antikūnų antigenui produkciją, arba ląstelinis atsakas pagal J ląstelių sąlygotą atsaką į antigeną. Kai kuriais atvejais neantigeninių aminorūgščių "sąsaja" gali būti įterpta tarp HA ir antigeno tam, kad būtų padidintas antigeno antigeniškumas palyginus pastarąjį su HA. Darbo eiga susideda iš DNR plazmidės, reikalingos norimų taikininių antigenų genų suliejimui su visu gripo viruso HA genu ar jo fragmentais, sukūrimo tam tikslui panaudojant oligonukleotidus ir polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodologiją.
[0078] HA taikininiai antigenų suliejimo genai modifikuojami tokiu būdu, kad jų ekspresija vabzdžių ląstelėse būtų geresnė, tuo tikslu pašalinant gamtinio hidrofobinio signalinio peptido sekas ir pakeičiant jas nauju bakuloviruso signaliniu peptidu. Suliejamas genas įterpiamas bakuloviruso ekspresijos vektorių taip, kad bakuloviruso polihedrono promotorius reguliuotų sulietų baltymų transkripciją infekuotose vabzdžių ląstelėse. 18 aminorūgščių bakuloviruso signalinis peptidas nukreipia HA taikininio antigeno sulieto polipeptido transliaciją vabzdžių ląstelėse glikozilinimo keliu ir jo jau nebebūna subrendusiame sulietame baltyme.
[0079] Pavyzdžiui, plazmidė pA9440, turinti gripo viruso kamieno A/Bejing/32/92 HA geną pMGS12 bakuloviruso nešančioje plazmidėje, aprašytoje žemiau, buvo panaudota kaip matrica HA geno amplifikacijai polimerazės grandininės reakcijos (PGR) būdu darbe prisilaikant protokolo, kurj pasiūlė tiekėjas ( Gene Amp PCR cloning kit, Perkin Elmer Cetus). PGR reakcijos mišinyje (100 jai), buvo 20 pmol HA genui tinkamų pradmenų. 5' ir 3' pradmenys buvo sukurti taip, kad galuose būtų restrikcinės endonukleazės saitai, kokių paprastai nėra HA gene. HAO ir HA1 fragmentų 5' pradmuo (0-567) prasideda gamtinio HA geno koduojančių sekų 5' galo 52 bazių pora, pašalinus gamtinio signalinio peptido seką ir prijungus Smal saitą 5' gale tuoj po HA koduojančių sekų. HA2 fragmento 5' PGR pradmuo (0-651) prasideda gamtinio HA geno 1108 nukleotidu tuojau pat po kodono, koduojančio arginino liekaną, pašalinamą skaidant HAO j HA1 ir HA2. HAO ir HA2 fragmentų 3' PGR pradmuo (0-680) sukurtas taip, kad pasibaigus HA koduojančioms sekoms būtų prijungtas KpnI saitas pašalinant gamtinį stop kodoną. HA1
[0080] 3' PGR pradmuo (0-679) sutrumpina geną prieš pat arginino liekaną, . pašalinamą HAO skaidymo metu. HA geno fragmento amplifikacija atliekama 30 ciklų , kurių kiekvieną sudaro 1 min. 94° C denatūracijai, 2 min. 55° C pradmenų sujungimui ir 2 min. 72° C ekstencijai. Gauti amplifikuoti HA fragmentai elektroforezuojami agarozės geliuose ir išskiriami iš gelio panaudojant GeneCIean rinkinį (Bio 101, Inc.), prijungiami prie plazmidės, sukurtos priimti PGR-generuotus fragmentus
[0081] (pCRII, Invitrogen). Taip gaunamos plazmidės pB142, pB144 ir pB330, į kurių sudėtį įeina atitinkamai HAO, HA1 ar HA2 geno fragmentai.
[0082] HA geno fragmentai, panaudojus Smal ir Kpn\ restrikcijos fermentus, išskiriami iš plazmidžių pB142, pB144 ir pB330 ir subklonuojami naudojant standartinius DNR metodus (Sambrook ir kt.. 1989) AcNPV nešančioje plazmidėje pMGS12. PMGS12 plazmidė turi, pradedant 5' ir einant link 3' galo, AcNPV polhedrono promotorių, ATG inicijuojantį kodoną, 61000 molekulinės masės bakuloviruso glikoproteino (61 K) atskeliamo signalinio peptido seką, Smal ir Kpn\ restrikcijos fermentų klonavimo saitus ir TAA universalaus stop kodono seką. Šiuos reguliuojančius rajonus riboja AcNPV genomo EcoRI I fragmento DNR (Summers ir Smith, " Bakuloviruso vektorių ir vabzdžių ląstelių kultūrų metodų vadovas". Tekxas Agricultural Experimental station Bulletin No. 1555 (1987). Klonuoti HA PGR fragmentai išskiriami iš pCRII klonuojančio vektoriaus, panaudojant Smal ir Kpn\ ir elektroforezę agarozės gelyje, ir naudojant GeneCIean rinkinį, įjungiami į pMGS12, kuri taip pat buvo skaidyta Smal ir Kpn\. Gautos AcNPV nešančios plazmidės, pB879, pB1201 ir pB1205, turinčios atitinkamus HAO, HA1 ar HA2 koduojančius rajonus, jungiamos rėmelyje su atskeliamu 61K geno bakuloviruso signaliniu peptidu ir polihedrono promotoriumi. AcNPV nešančios plazmidės, pB879, pB1201 ir pB1205 gali būti naudojamos sulieti HAO, HA1 ar HA2 su bet kuriuo norimu genu.
[0083] Sekantis žingsnis konstruojant HA-CEA sulietą geną nešančias plazmidės buvo susijęs su CEA koduojančių sekų įterpimu į HA-koduojančias konstrukcijas. Panaudojus PGR amplifikaciją, plazmidės pA9080 abiejuose CEA geno galuose įtaisyti restrikcinių endonuklezių
[0084] Smal ir Kpn\ atpažinimo/skaidymo saitai. 5' PGR pradmuo, 0-649, prasideda geno, neturinčio gamtinio CEA signalinio peptido sekos,-5' galo 82 bazių pora. 3' PGR pradmuo 0-650, sukurtas išmesti geno 3' galo, paskutiniąsias 72 bazių porų, koduojančias hidrofobinio C-terminalinio rajono seką. CEA geno framento amplifikacija atlikta 30 ciklų, kurių kiekvieną sudarė 1 min. 94° C denatūracijai, 2 min. 55° C atjungimui ir 2 min. 72° C ekstencijai. Gauti amplifikuoti CEA geno fragmentai elektroforezuojami agarozės geliuose ir išskiriami iš gelio panaudojant GeneCIean rinkini, prijungiami prie plazmidės pCRII (Invitrogen) pagal gamintojo instrukciją. Gaunama plazmidė pBS06, turinti CEA geną be jo gamtinio signalinio peptido, C-terminalinio hidrofobinio domeno, ar stop kodono, bet su abiem Smal ir Kpn\ saitais abiejuose geno galuose.
[0085] Naudojant pB806 plazmidę, atliktas plačios apimties darbas, DNR suskaidyta naudojant arba Smal, arba Kpn\. CEA-koduojantys fragmentais išskirti naudojant agarozės gelio elektroforezę ir GeneCIean rinkinj, išskirti fragmentai įjungiami į kiekvieną iš trijų HA-koduojančių konstruktų (pB879, pB1201 ar pB1205), suskaidytų tuo pačiu restrikcijos fermentu. Pavyzdžiui, CEA-koduojantys fragmentai su Smal-nuskeltais galais buvo sujungti su HA0-.HA1- ir HA2-koduojančiais konstruktais (atitinkamai pB879, pB1201 ir pB1205) ir suskaidyti Smal, gaunant atitinkamai plazmidės pB1250, pB1555 ir pB1584. CEA-koduojantys fragmentai su Kpn\ atskeltais galais sujungti su HA0-.HA1- ir HA2-koduojančiais konstruktais, suskaidoma Kpn\ ir gaunamos plazmidės pB1264, pB1564 ir pB1593. Jterpiant geną CEA Smal saite , pasiekiama, kad CEA geną koduojančios sekos atsiduria už HA koduojančių sekų. PGR pradmenys visiems konstruktams sukurti tokie, kad EA genas būtų įterpiamas rėmelyje su HA ir sulieto geno transliacija būtų terminuota universaliu transliacijos terminacijos signalu (TAATTAATTAA) (Seka ID No.
[0086] Šis konstruktas gali būti pagerintas išmetant įsiterpiančias aminorūgštis, esančias arba tarp signalinio peptido ir HAO, kaip tai aprašyta žemiaus, arjDa esančias tarp HAO ir suliejamo geno, tam, kad pagerėtų baltymo sankloda ir imunogeniškumas.
[0087] Vakcinų vaisto forma ir pakuotė
[0088] rHA gali būti paruoštas pakuotėje vienas arba derinyje, su kitais gripo viruso antigenais, panaudojant metodus ir medžiagas, žinomas gripo vakcinų gamyboje. Variante, kuriam teikiama pirmenybė, multivalentinės vakcinos gamybai naudojamas dviejų A kamienų ir vieno B kamieno HA baltymų derinys.
[0089] Ypatingu privalumu pasižymi tas variantas, kuomet H Ai yra derinami su adjuvantu, pridedamu tokiu kiekiu, kuris užtikrina imunogeninio atsako prieš HA baltymus padidėjimą. Šiuo metu vienintelis adjuvantas, plačiai naudojamas žmonėms yra alūnas (aliuminio fosfatas ar aliuminio hidroksidas). Saponinas ir jo igrynintas komponentas Quil A, Freund'o pilnas adjuvantas bei kiti adjuvantai, naudojami eksperimente ir veterinarijoje, pasižymi toksiškumu, mažinančiu potencialią galimybę juos panaudoti vakcinų žmonėms gamyboje. Tačiau nauji cheminiai preparatai tokie, kaip muramilo dipeptidas, monofosforilo lipidas A, fosfolipido konjugatai tokie, kaip Goodman-Snitkoff ir kt. aprašytieji J. Immunol. 147: 410-415 (1991) (yra literatūros sąraše), baltymo inkapsuliacija proteoliposomoje , aprašyta Miller ir kt., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992) (yra literatūros sąraše), baltymo inkapsuliacija lipidinėse pūslelėse tokiose kaip Novasome ™ lipidų pūslelės (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, NH) taip pat galėtų būti naudingi.
[0090] Variante, kuriam teikiama pirmenybė, paruošta vakcina pateikiama vienkartinės dozės pavidalu, kuri gali būti panaudota parenteraliai imunizacijai (j raumenis, į odą ar į paodę) ar nosiaryklinei imunizacijai ( pvz. j nosj). Efektyvi dozė nustatoma būdu, kuris pateikiamas žemiau aprašomuose pavyzdžiuose. Nešėju paprastai būna vanduo ar užbuferintas druskos tirpalas su ar be konservanto. Antigenas gali būti liofilizuotas ir prieš panaudojimą resuspenduotas arba gali būti ištirpintas.
[0091] Nešėjas taip pat gali būti ir polimerinė uždelsto skleidimo sistema. Gaminant kontroliuojamą antigenų skleidimo vakciną ypač naudingi yra sintetiniai polimerai . Tarp pirmųjų tokio tipo pavyzdžių buvo metilo metakrilato rutuliukų, kurių diametras mažiau už vieną mikroną, taip vadinamų nano dalelių, polimerizacija, aprašyta Kreuter J., Mikrokapsulės ir nano dalelės medicinoje ir farmakologijoje. M. Donbrovv (red.) CRC Press, p. 125-148. Tokiu atveju antikūnų atsakas ir apsauga prieš gripo virusą būna žymiai geresnė negu naudojant derinj su aliuminio hidroksidu. Bandymai, atlikti naudojant kitas daleles, parodė, kad šių polimerų adjuvantinis efektas priklauso nuo dalelės dydžio ir hidrofobiškumo.
[0092] Mikroinkapsuliacija panaudota suleidžiant mikroinkapsuliuotą vaisto formą tam, kad pastaroji duotų kontroliuojamo skleidimo efektą. Daugelis veiksnių sąlygoja mikroinkapsuliacijai tinkamo polimero pasirinkimą. Polimero sintezės reprodukcibilumas ir mikroinkapsuliacijos procesas, mikroinkapsuliacijos medžiagų ir proceso kaštai, toksikologiniai ypatumai, variabilios skleidimo kinetikos parametrai ir polimero bei antigenų fizikocheminis suderinamumas - tai faktoriai, j kuriuos būtina atsižvelgti. Naudingų polimerų pavyzdžiais yra polikarbonatai, poliesterai, poliuretanai, poliortoesterai ir poliamidai, ypač tie kurie, pasižymi biodegradacinėmis savybėmis.
[0093] Dažniausiai nešėju farmaciniams preparatams, o neseniai ir antigenams, pasirenkams poli (d,l - laktid - ko - glikolidas) (PLGA). Tai biodegraduojantis poliesteras, kuris jau seniai naudojamas medicinoje laikiniems protezams, kaip kaulų plokštelėms ir kt. gaminti, ir per tą laiką neparodė jokio toksiškumo. Įvairūs farmaciniai preparatai, tame tarpe peptidai ir antigenai, yra ruošiami inkapsuliuojant j PLGA mikrokapsules. Sukaupta daug duomenų apie PLGA panaudojimą kontroliuojamam antigeno skleidimui, pavyzdžiui, tai pateikiama Eldrige J.H. ir kt. apžvalgoje Šiuolaikinės mikrobiologijos ir imunologijos problemos. 1989, 146: 59-66. Nustatyta, kad antigenų inkapsuliacija nuo 1 iki 10 mikronų diametro PLGA mikrosferose sąlygoja didesnį adjuvantinj efektą tuo atveju, kai preparatas naudojamas per os. PLGA mikroinkapsuliacijos metu reikalingas vandens-aliejaus emulsijos fazių atskyrimas. Tikslinis preparatas paruošiamas kaip vandeninis tirpalas ir PLGA ištirpinamas atitinkamuose organiniuose tirpykliuose, kaip antai metileno chloride ir etilo acetate. Šie du nesumaišomi tirpalai yra ko-emulsionuojami didelio greičio plakimo būdu. Po to pridedamas polimero ne-solventas,
[0094] sukeliama polimero precipitacija apie vandeninius lašelius ir prasideda pirminių mikrokapsulių susidarymas. Mikrokapsules surenkamos ir stabilizuojamos vienu iš šių agentų - polivinilo alkoholiu (PVA), želatina, alginatais, polivinilpirolidonu (PVP), metilo celiulioze, tirpiklis pašalinamas arba džiovinant vakuume arba jį ekstrahuojant.
[0095] Pateikiamas išradimas aiškinamas sekančiais neribotais pavyzdžiais.
[0096] Pavyzdys 1: Gripo virusų auginimas ir išskyrimas
[0097] Sekantys gripo vakcinos viruso kamienai buvo gauti iš FDA viščiukų kiaušinio alantoitinio skysčio pavidalu:
[0098] Iš FDA gautų virusų kamienai kultivuoti infekuotose MDCK ląstelėse, pridėjus TPCK-paveikto tripsino (Sigma Chemical Co.P St. Louis, MO) ir fetalinio veršiukų serumo tokia koncentracija, kuri yra optimali aukščiausių pirmojo pasažo viruso titrų gavimui. MDCK ląstelės infekuotos gripo viruso kamienais naudojant mažiausią infekcijos dauginimosi koncentraciją, kuri buvo nustatyta standartiniu HA testu (Rosen, " Gyvūnų virusų sukelta hemagliutinacija" knygoje Virusologijos metodų pagrindai, red. K. Habel ir N.P. Salzman, p. 276-28 (Academic Press, New York 1969). Infekuotos ląstelės inkubuotos 33 0 C 48 vai. ir hemagliutinacijos aktyvumo testu terpėje įvertinta viruso produkcija. Auginimo sąlygos, kurių metu pasiektas didžiausias HA aktyvumas, naudotas ruošiant plačios apimties gripo viruso kiekius. Lentelėje 1 pateikiamos optimaliausios gripo viruso auginimui TPCK tripsino ir fetalinio veršiuko serumo koncentracijos.
[0099] Gripo viruso išskyrimas: Virusai surinkti praėjus 24-48 vai. po užkrėtimo nuskaidrinant (1,000 x g 10 min.) virusu užkrėstų MDCK ląstelių terpę, surinktą iš10 kultivavimo flakonų T175. Virusas surenkamas centrifūguojant terpę 100,000 x g 1 vai. gautos virusinės nuosėdos resuspenduojamos 1 ml fosfatais užbuferinto druskos tirpalo (PBS) pH 7.4 ir centrifūguojamos 20 ml 20-60% (w/v) sacharozės gradiente PBS tirpale. Gripo viruso juostelė surenkama iš 40-45% sacharozės gradiento zonos, atskiedžiama PBs ir centrifūguojama 100,000 x g. Išskirto viruso nuosėdos resuspenduojamos 0.5 ml PBS ir saugomos -700 C.
[0100] Pavyzdys 2. Gripo viruso / VTeksasas/ 36/ 91 HA geno klonavimas.
[0101] 2 Fig. pateikiamas specialus vieno iš gripo viruso HA genų klonavimo etapas. Iš CDC gauto gripo viruso kamieno A/Teksasas/36/91 virusinė RNR ekstrahuota panaudojant aukščiau aprašytą būdą. Universalus pradmuo, komplementarus gripo viruso 3' galo RNR segmentams 5' -AGCAAAAGCAGG (SEQ ID No. 1), drauge su pelių Maloney leukemijos viruso (M-MuLV) atvirkštine transkriptaze panaudotas gripo viruso cDNR gamybai. Išskirta virusinė RNR ar mRNR (5gg) panaudota kaip matrica cDNR gamybai drauge su M-MuLV atvirkštine transkriptaze ( cDNR pirmojo siūlo sintezės rinkinys, Pharmacia Inc.) Pradmeniu gripo viruso A kamienų virusinės RNR cDNR sintezei naudotas sintetinis oligonukleotidinis pradmuo (5' -AGCAAAAGCAGG-3') (SEQ ID No. 1), homologiškas visų viriono HA geno segmentams.-
[0102] HA genų amplifikacija panaudojant cDNR atlikta polimerazės grandininės reakcijos (PGR) būdu standartinėmis reakcijos sąlygomis (Gene Amp kits; Cetus/Perkin Elmer, NorvvalK, CT). PGR reakcijos mišinys (100 jul) susidėjo iš 20 pmol pradmenų, specifinių gripo viruso A (H3) arba A (H1) , arba B kamienų HA geno 5' ir 3' galams, nustatytų pagal konsensusines sekas, rastas GenBank DNR duomenų bazėje (lentelė 2). Amplifikacija vykdyta 30 ciklų, kiekvieną ciklą sudarė 1 min denatūracijai 94°C, 2 min 55° C sujungimui ir 3 min 72° C ekstencijai. PGR produktai tirti 0.8% agarozės geliuose atrenkant pagal dydj prieš klonavimą.
[0103] HA geno 5" galo PGR pradmenys! 5' - GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3' (SEQ ID No. 2) ir HA geno 3'
[0104] galo : 5' - GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T" ACT CCA TGG
[0105] Naujas 5' PGR pradmuo sukurtas geno 5'-galui: 5' galo minus signalinė seka." 5' -GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT -3' (SEQ ID No.4) ir geno 3' galo: 5' -GA AAC GTC ACG
[0106] TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CC- 3' (SEQ ID No.5). Jie
[0107] panaudoti PGR HA geno be signalinio peptido sekos gavimui. Po to šis genas jterptas j TA vektorių suskaidytą Kpn\. 61K signalinis peptidas bakuloviruso ekspresijai ir polihedrino promotoriui buvo jterptas j TA vektorių, turintį HA geną be signalinio peptido sekos. Gautas bakuloviruso rekombinantinis vektorius turi polihedrino promotorių, 61K bakuloviruso signalinį peptidą ir gripo viruso A/Teksasas/36/91 HA geną.
[0108] Gripo viruso B kamienų HA genai klonuoti panaudojant totalinę mesendžerinę RNR (mRNR), išskirtą iš MDCK ląstelių, užkrėstų B kamieno gripo virusu B/Panama/45/90. Totalinė RNR išskirta iš infekuotų ląstelių, augintų T175 flakonuose. Surinktos ląstelės lizuotos pridėjus guanidiumo tiocianato ir išskirta totalinė RNR panaudojant būdą, aprašytą aukščiau. Totalinė mRNR išskirta iš ląstelinės RNR panaudojant Oligo- (dT) - celiuliozės pluošto kolonėles pagal aukščiau aprašytą būdą.
[0109] Gripo viruso B kamienų mRNR gavimui pradmeniu naudotas atsitiktinis oligonukleotidinis DNR pradmuo (Pharmacia, Inc.).
[0110] Pateikiamas pavyzdys reagentų, naudotų cDNR sintezei, kuomet gripo viruso A/Teksasas/36/91 virusinė RNR buvo panaudota kaip matrica. cDNR segmentų, koduojančių gripo viruso baltymus, lokalizacija apibūdinama sekančiai. Išskirta virusinė RNR reakcijos mišinyje buvo sujungta su universaliu vienasiūlės DNR pradmeniu 5' AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID No. 1). Šis pradmuo komplementarus gripo viriono 3' galo segmentui, aprašytam aukščiau. Reakcijos mišinyje taip pat buvo pridėta ir [a-32P]dCTP tam, kad būtų vizualizuoti cDNR produktai, kurie buvo išskirti 1.5% šarminės hidrolizės gelyje (Maniatis ir kt., 1982) ir eksponuoti ant X-OMAT-AR filmo.
[0111] Pavyzdys 3: HA genų klonavimas bakterinėse plazmidėse
[0112] Amplifikuoti PGR būdu rHA genai klonuoti pUC tipo plazmidiniame vektoriuje panaudojant TA Klonavimo Sistemą (Invitrogen, Inc.). HA genų buvimas verifikuotas plazmidinės DNR, išskirtos standartiniu būdu (Maniatis ir kt., 1982), restrikcijos fermentų analize. rHA genų 5' galas ištirtas nustatant DNR sekas ir sukurti nauji pradmenys sekų, koduojančių HA baltymų N-galo hidrofobinj signalinį peptidą, pašalinimui. Specifiniai 5' ir 3' galo oligonukleotidiniai pradmenys, išvardinti lentelėje 2, panaudoti cDNR produktų amplifikacijai PGR būdu ir po to klonuoti E. coli TA plazmidiniame vektoriuose (invitrogen, Inc.) panaudojant standartinius klonavimo metodus. Gauti DNR klonai turėjo sekas, koduojančias subrendusius HA.
[0113] A/Teksasas/36/91, A/Pekinas/353/89, A/Pekinas/32/92 ir B/Panama/45/90 rHA genai buvo subklonuoti standartiniu būdu (Maniatis ir kt., 1982) bakuloviruso ekspresijos vektoriuose. HA genai pašalinti iš TA klonavimo plazmidės panaudojant atitinkamus restrikcijos fermentus ir išskirtas HA DNR fragmentas įterptas j bakuloviruso rekombinantinę plazmidę. Gauti bakterijų klonai patikrinti pagal rezistentiškumą ampicilinui ir po to apdoroti restrikcijos fermentais tam, kad būtų išlaisvintas įterptas HA genas ir patvirtintas jo buvimas. Rekombinantinės piazmidės, turinčios HA genus, išskirtos cezio chlorido-etidijum bromido gradiente (Maniatis ir kt., 1982). Plazmidžių 5" galas sekvenuotas tam, kad būtų nustatytas buvimas teisingų bakuloviruso signalų ( AcNPV polihedrino promotorius, ATG transliacijos starto signalas ir bakuloviruso. signalinio peptido seka) ir atitinkama HA koduojanti seka teisingame skaitymo rėmelyje. HA genų 5' galo DNR sekos ir ribojantis AcNPV polihedrino promotorius ir bakuloviruso signalinis peptidas (pirmosios 18 aminorūgščių) parodyti SEKŲ LAPE.
[0114] SEQ ID No.6 koduoja gripo viruso A/Pekinas/32/92 HA geno 5' galo sekas (sekos 1-481). SEQ ID No. 7 yra atitinkama aminorūgščių seka (pradžia starto kodone "ATG" [nukleotidas 21] SEQ ID No.6). 61K signalinio peptido amino rūgščių seka yra ketvirtas rinkinys SEQ ID No.7 kaip aminorūgštys 1-18.
[0115] SEQ ID No.8 koduoja gripo viruso A/Teksasas/36/91 HA geno 5' galo sekas (sekos 1-481). SEQ ID No.9 yra atitinkama aminorūgščių seka (pradžia starto kodone "ATG" [nukleotidas 21] SEQ ID No8). ). 61K signalinio peptido amino rūgščių seka yra ketvirtas rinkinys SEQ ID No.9 kaip aminorūgštys 1-18
[0116] SEQ ID No.10 koduoja gripo viruso B/Panama/45/90 HA geno 5' galo sekas (sekos 1-434). SEQ ID No.11 yra atitinkama aminorūgščių seka (pradžia starto kodone "ATG" [nukleotidas 21] SEQ ID No10).). 61K signalinio peptido amino rūgščių seka yra ketvirtas rinkinys SEQ ID No.11 kaip aminorūgštys 1-18.
[0117] 3' galas, nukleotidai 21-74 koduoja 61K signalinį peptidą ir gale nukleotidai pradedant 75 koduoja HA geno 5' galą.
[0118] Pavyzdys 4: rekombinantinio HA ekspresija vabzdžių ląstelėse
[0119] Chimerinės rekombinantinės plazmidės, turinčios klonuotus HA genus, išskirtos ir 2|ig sumaišyti su 1 Įjg AcNPV laukinio tipo DNR. DNR kalciu koprecipituota ir standartiniu metodu transfekuota j S. frugiperda ląsteles (Smith, Summers, Fraser. Mol. and Cell. Biol. 3: 2156-2165
[0120] (1983). Rekombinantiniai bakulovirusai identifikuoti pagal jų poveikio zonos morfologiją ir po to išskirti atliekant pakartotinius užkrėtimus ir atrenkant poveikio zonas. Išskirti rekombinantiniai bakulovirusai ištirti, ar ekspresuoja rHA, ir tolimesniai darbo eigai atrinktas vienas bakuloviruso ekspresijos vektorius,
[0121] S. frugiperda ląstelės užkrėstos bakuloviruso vektoriumi, turinčiu gripo viruso B/Panama/45/90 HA geną. Praėjus 24, 48 ir 72 vai. po infekcijos, 1 x106 ląstelių 15 min. inkubuota su 25 Ci [35S]metionino tam, kad pasižymėtų naujai sintezuoti baltymai. Po to ląstelės surinktos ir išskirti baltymai, tam tikslui panaudojant 11% poliakrilamido geli su 0.1% SDS. Radioaktyviai pažymėti baltymai defektuoti eksponuojant X-OMAT-AR filme. Baltymo tyrimai pagai standartus ir masę kilodaltonais (kd) parodė, kad 85 kd rekombinantinis HA baltymas yra vienas didžiausių baltymų, kurie buvo sintezuoti ląstelėse praėjus 48 vai. ir 72 vai. po užkrėtimo.
[0122] Pavyzdys 5: rekombinantinio HA gamyba ir išskyrimas
[0123] Bakuloviruso ekspresijos vektorius A8611, turintis gripo viruso A/Beijing/353/89 geną, sukurtas kaip aprašyta aukščiau apie A/Beijing/32/92 hemagliutininą, esanti polihedrino promotoriaus kontrolėje, panaudotas užkrečiant S. frugiperda ląsteles. Ląstelės kultivuotos 27° C temperatūroje 1 x 106 ląstelių/ml tankiu TNMFH terpėje (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), j kurią pridėta 10% fetalinio veršiuko serumo, ir užkrėstos 1 infekcijos dauginimosi intensyvumu (MOI) panaudojant A8611 rekombinantinj bakulovirusą. Infekcijos metu gripo viruso A/Beijing/353/89 hemagliutininas gaminamas bakuloviruso polihedrino promotoriaus transkripcinėje kontrolėje. Praėjus 72 vai. po infekcijos, ląstelės surenkamos centrifūguojant 15 min 3,400 x g, plaunamos resuspenduojant beseruminėje TNMFH terpėje ir po to vėl centrifūguojamos 30 min. 10,400 x g. Supernatantas pašalinamas ir ir infekuotų ląstelių nuosėdos saugomos -70° C.
[0124] Rastas būdas, kurio metu rekombinantinis HA yra selektyviai ekstrahuojamas iš infekuotų ląstelių tokiomis sąlygomis, kurios nedenatūruoja antigeno. Visa ekstrakcija atliekama prie 4° C. Ląstelės, surinktos iš 0.5 L kultūros (maždaug 5 x 108 ląstelių), suardytos veikiant 2 min Polytron ™ homogenižatoriumi (Brinkmann Instruments Inc. VVestbury, NY) ledo vonioje atšaldytame 40 mL tirpale, kuriame yra 30 mM tris-HCI, pH 8.4, 25 mM LiCI, 1% (v/v) Tween-20, 1 mg/mL leupeptino. Gautas homogenatas centrifūguotas 30 min 9,200 x g. Supernatantas pašalinamas ir nuosėdos surenkamos. Šios darbo eigos metu pašalinami vabzdžių ląstelių tirpūs ir periferinių membranų baltymai ir nereikia integralinių membranų baltymų, kuriems priklauso rHA, ekstrakcijos. Tam, kad būtų ekstrahuotas rHA, nuosėdos homogenizuojamos 2 min ledo vonioje atšaldytame 40 ml_ tirpale, kurį sudaro 30 mM Tris, 10 mM etanolamino, pH11, 25 mM LiCI, 2% Tween-20. Po to inkubuojama 60 min ledo vonioje, homogenato pH keičiamas iki 8.4 pridedant 1N HCI ir netirpioji frakcija pašalinama centrifūguojant 30 min 9,200 x g. Supernatantas, turintis tirpų rHA, surenkamas, patikrinamas ph ir, jeigu reikia, keičiamas iki 8.4 kambario temperatūroje. Netirpi frakcija resuspenduojama 40 mL vandens analizei. HA integralus membranos baltymas soliubilizuojamas esant aukštam pH, Tween-20 detergente ir lieka tirpus net sumažėjus pH.
[0125] Baltymai tirti SDS poliakrilamido gelio elektroforezės metodu.
[0126] Pavyzdžiai suardyti verdančio vandens vonioje 2% natrio dodecilsulfato (SDS) ir 5% beta-merkatoetanolio tirpale, po to elektroforezuoti 11% polakrilamido gelyje, kuriame buvo 0.1% SDS, ir nudažyti Coomassie mėliu.
[0127] Rekombinantinio HA išskyrimui panaudota chromatografija, kurios metu gautas labai išgrynintas rekombinantinio HA antigenas, kuris buvo nedenatūruotas ir tiko kaip komponentas žmogaus gripo vakcinos gamybai. Sekantis būdas buvo panaudotas gripo viruso A/Pekinas/353/89 HA išskyrimui iš S. frugiperda ląstelių, užkrėstų rekombinantiniu virusu A8611.
[0128] HA išskyrimo iš 0.5 L infekuotų S. frugiperda ląstelių metu chromatografijos gelio matricoms naudota - 30 mL Pharmacia DEAE
[0129] greitos tėkmės Sefarozė (Pharmacia C16/20 kolonėlė) ir 4 mL Pharmacia Lęšinio Lėktino Sefarozė 4B (Pharmacia' C10/10 kolonėlė). DEAE
[0130] kolonėlės išleidimas buvo sujungtas su lęšinio lėktino kolonėlės įleidimu, ir S/N 2 ląstelių ekstraktas, paruoštas kaip aprašyta aukščiau, įvestas į suporintas kolonėles tėkmės greičiu 1mL/min. Kolonėlės plautos-30 mM Tris-HCI, pH 8.4, 25 mM LiCI. 0.5% Tween-20, pakol lęšinio lėktino efluento 280 nm UV absorbcija sugrįžo prie pamatinės linijos. Esant šioms sąlygoms, dauguma pašalinių baltymų jungėsi prie DEAE, o rekombinantinis HA pratekėjo pro kolonėlę. Likusieji kontaminantai praėjo pro lęšinio lėktino kolonėlę, o glikozilintas rHA prisijungė prie lęšinio lėktino afininės matricos. DEAE kolonėlė! buvo atjungta, o lektininio lęšio
[0131] kolonėlė praplauta kita porcija 40 mL 30 mM tris-HCI, 25 mM LiCI. 0.5 naudota Tween-20. Po to lektininė kolonėlė praplauta 40 mL 30 mM Tris-HCI, pH 8.4, 25 mM LiCI, 0.4 % (v/v) natrio dezoksicholato (DOC). Šio plovimo metu detergentas Tween-20 pakeičiamas kitu detergentu - DOC, kuris gali būti pašalintas nuo baltymo dializės metu. Rekombinantinis HA eliuotas iš lektininės kolonėlės panaudojant 20 mL' iš 40 mL 30 mM Tris-HCI, pH 8.4, 25 mM LiCI, 0.4% (v/v) natrio dezoksicholato, turinčio 0.3 M a
[0132] Dėl gripo viruso HA baltymų genetinio variabilumoaukščiau aprašyta išskyrimo eiga gali varijuoti, priklausomai nuo kiekvieno unikalaus rekombinantinio HA baltymo. Pavyzdžiui, rHA gali jungtis prie DEAE jonų kaitos kolonėlės vietoje to, kad ją pratekėtų. Jeigu tai atsitiktų rHA galima būtų pašalinti iš DEAE kolonėlės plaunant kolonėlę buferiu, turinčiu didesnes LiCI, NaCI ar kitų druskų koncentracijas.
[0133] Tam, kad būtų pašalinta DOC detergentas bei kiti buferio komponentai, Lektininės kolonėlės eliuatas, turintis išskirtą rHA, buvo dializuotas panaudojant fosfatais užbuferintą druskos tirpalą, pH 7.5 (PBS), Išskirtas rekombinantinis rHA, patikrintas SDS poliakrilamido gelio elektroforeze, pasirodė besą mažiausiai 95% grynumo.
[0134] Pavyzdys 6: rHA atsparumo proteazei analizė
[0135] Subrendę HA buriasi į trimeres struktūras, kurios yra atsparios įvairių proteazių, įskaitant tripsiną, poveikiui, kai tuo tarpu HA monomerai yra jų degraduojami (Murphy ir VVebster, 1990). Todėl atsparumas tripsino ' poveikiui gali būti panaudotas kaip funkcionalaus trimero susidarymo įrodymas. rHA atsparumas proteazės poveikui patikrintas sekančiu būdu.
[0136] Išskirto rHA (A/Pekinas/353/89) du bandiniai po 60 įig/ rc\ L buvo inkubuoti 30 min. ledo vonioje su 30 mM Tris-HCI, pH 8.4, 150 mM NaCI, pridėjus ar nepridėjus 50 /y l/m L TPCK-paveikto tripsino. Reakcija sustabdyta pridėjus 57.4 mM fenilo metilo sulfonilfluorido izopropanolyje iki 1 mM galutinės koncentracijos. Kiekvieno bandinio reakcijos mišinys denatūruotas virinant 3% SDS redukcinėmis sąlygomis, po to tirti elektroforezės 11.5% poliakrilamido geliuose būdu ir pernešti ant nitroceliuliozės filtrų pagal standartinį VVestern blotingo metodą. HA polipeptidai nustatyti panaudojant jūros kiaulyčių anti-HA serumą, gautą imunizuojant išskirtu rHA, ir ožkos antiserumą jūros kiaulytės imunoglobulinams, konjuguotąsu šarmine fosfataze.
[0137] Nepaveiktas rHA keliauja kaip HA pirmtakas (HAO). Paveikus proteaze, gaunamos dvi pagrindinės juostos, kurios keliauja kaip gripo viruso hemagliutininas HA1 ir HA2. Gauti rezultatai parodė, kad tripsinas skaido rHA baltymą į du polipeptidus, kurie yra panašaus j HA1 ir HA2 dydžio. Tolimesnė proteolizė nebevyksta. Šie rezultatai rodo, kad rHA, išskirtas aukščiau aprašytu būdu, yra atsparus proteazės degradacijai. Šis ypatumas susijęs su išskirtojo rHA trimerine forma.
[0138] Pavyzdys 7: rHA imunogeniškumo nustatymas standartiniu pelių potencijos įvertinimo būdu.
[0139] Vienas iš antigeno imunogeniškumo nustatymo būdų yra kiekio, reikalingo apčiuopiamo antikūnų atsako pelėse indukcijai, nustatymas (pelių potencijos įvertinimo būdas). Standartinis pelių potencijos potencijos įvertinimo būdas naudojamas rHAO vakcinos imunogeniškumo nustatymui. 5-10 pelių grupės vieną kartą imunizuojamos vakcina, turinčia įvairius išskirto rHA atskiedimus, pvz., 0.500 jig, 0.1 ng, 0.02 ng, ir 0.004 jig. Serumai surenkami praėjus 28 dienoms po imunizacijos ir naudojant standartinį imunofermentinės analizės metodą (ELISA) 96 šulinėlių mikroplokšteiėse, nustatomi antikūnai rHA antigenui. Pelė laikoma serokonvertuota,.jeigu OD450 esant 1:100 atskiedimui yra didesnis negu trys standartiniai nuokrypiai nuo pelės preimuninio ■ serumo OD450 vidurkio. Vakcinos efektyvi dozė, reikalinga pelės 50 % serokonversijai (ED50), yra antigeno imunogeniškumo matas.
[0140] Pavyzdžiui, keturios grupės po 10 pelių, yra imunizuojamos vieną kartą rHAO vakcinos arba 0.1 ng, 0.02 jj.g( 0.004 jag, arba 0.0008 ng (5-kartis atskiedimas). Serumai surenkami praėjus 28 dienoms po imunizacijos ir ELISA metodu įvertinama serokonversija rHAO antigenui. Dozė, reikalinga pelės 50 % serokonversijai (ED50) apskaičiuojama kaip minimali ED5o, nustatyta kiekvienam rHA antigenui.
[0141] Preliminarus duomenys rodo, kad vienkartinė rHAO 0.004 jj.g dozė sukels pelių 50% serokonversiją.
[0142] Pavyzdys 8: rHA panaudojimas derinyje su adjuvantu ir palyginimas su kitomis komercinėmis gripo viruso vakcinomis.
[0143] Pelių potencijos įvertinimo būdu testuotas išskirto gripo viruso A/Pekinas/353/89 rHA imunogeniškumas panaudojant jj drauge su alūnu arba be jo (gryną) ir palygintas su komercine gripo viruso vakcina, FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, PA), turinčia gripo virusą A/Pekinas/353/89. Naudotos šios vakcinos dozės 0.5 pig, 0.1 ng. 0.02 ng ir 0.04 p.g. 28 dieną pelės buvo paskiepytos išskirto rHA dozėmis, nurodytomis aukščiau. 42 dieną serumai surinkti ir titruoti naudojant ELISA būdą ir nustatant IgG anti-HA antikūnus.
[0144] Rezultatai pateikti Fig. 3. Imunizuojant be adjuvanto, tik 0.5 jag doze indukavo žymesnį antikūnų gamybos titrą (200,000). Naudojant su adjuvantu, prireikė tik tokios mažos, kaip 0.004 (ig, rHA dozės, kad būtų indukuoti žymūs antikūnų titrai. Gyvuliukai, imunizuoti rHA (grynu) produkavo beveik tuos pačius anti-rHA antikūnų kiekius kaip ir imunizuotieji komercine vakcina. Alūnas padidino rHA imunogeniškumą ir buvo indukuoti tokie anti-rHA antikūnų titrai, kurie buvo 10 kartų ar daugiau didesni negu imunizuojant be adjuvanto.
[0145] Tokiu būdu, išskirtų rHAO imunogeniškumo palyginimas su gripo viruso pilno viriono vakcina FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) rodo, kad rHAO sukelia pelėse panašų imuninį atsaką 42 dienų laikotarpyje. rHAO absorbcija alūnu ženkliai padidina išskirto rHAO imunogeniškumą pelėse, kaip tai buvo įvertinta būdu, aprašytu 7 pavyzdyje. Imunizuojant derinyje su alūnu indukuojami didesni IgG hemagliutininiai antikūnų kiekiai negu imunizuojant gripo vakcina
[0146] Pavyzdys 9: Hemagliutinacijos slopinimo tyrimai.
[0147] Hemagliutinacijos inhibicijos (HAI) antikūnai jungiasi prie trijų iš keturių žinomų hemagliutinino epitopų ir blokuoja gripo viruso gebą agiiutinuoti eritrocitus (VVilson ir kt., "Gripo viruso apvalkalėlio glikoproteino hemagliutinino sandara 3A skiriamoje geboje", Nature. 289: 366-378 (1981). Šie antigeniniai determinantai yra susikaupę apie hemagliutininių trimerų sialo rūgšties receptoriaus jungiamąją vietą. Antikūnai šioms vietoms neutralizuos viruso infektyvumą (Weis ir kt., " Gripo viruso hemagliutinino, sujungto su jo receptoriumi, sialo rūgštimi, sandara", Nature. 333: 426-431 (1988). HAI antikūnų titras ir specifiškumas yra svarbus gripo viruso vakcinos apsauginės galios prieš panašių ar giminingų gripo viruso kamienų infekciją rodiklis.
[0148] Tyrimai atlikti pelėse palyginant iš kamieno A/Pekinas/353/89 išskirto rHA ir vakcinos FLUZONE® (Connaught Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) sugebėjimą indukuoti HAI antikūnus. Grupėms po 5 peles 0 ir 28 dieną suleista po 0.5 (j.g, 0.1 jj.g. 0.02 ng ar 0.04 Įig rHAO arba tris kartus didesnes dozes FLUZONE® hemagliutinino taip, kad būtų suleisti vienodi rekombinantinio ar virusinio A/Pekinas/353/89 hemagliutinino kiekiai. Pavyzdžiui, didesnės dozės grupės pelės buvo imunizuotos 1.5 ?g FLUZONE® hemagliutinino (kiekvieno kamieno po 0.5 jj.g hemagliutinino) ir 0.5 ng rHAO. Tai, kad FLUZONE® yra papildomas hemagliutininis antigenas dėl kitų dviejų gripo viruso kamienų, gali būti kai kurių kryžmiškai reaguojančių antikūnų priežastimi.
[0149] Anti-hemagliutinininiai antikūnai (hemagliutinininiai IgG) nustatyti standartiniu skiedimo ELISA metodu kaip antigeną naudojant rHAO. HAI antikūnai įvertinti prieš 4,sekančių antigenų hemagliutinino vienetus: pilnas gripo kamieno A/Pekinas/353/89 virusas (A/bei), išskirtas iš kamieno A/Pekinas/353/89 rHA antigenas, ir FLUZONE® . HAI titrai yra reciprokiniai didžiausio antiserumo atskiedimo, slopinančio 50 % viščiuko eritrocitų agliutinaciją, atžvilgiu.
[0150] Lentelėje 3 susumuoti pelių serumo hemagliutinino IgG ir HAI titrai 42 dieną. Dideli anti-hemagliutinino antikūnų kiekiai gauti imunizuojant rekombinantinio rHA vakcina. Jų titrai buvo apie 10 kartų didesni negu FLUZONE® atveju. Svarbiausia yra tai, kad rHAO vakcina sąlygojo gerus titrus antikūnų, blokuojančių eritrocitų agliutinaciją, kurią galėjo sukelti A/pekinas/353/89 virusas ir rHAO antigenai. Tokiu būdu, rHAO vakcina indukavo HAI antikūnus, kurie gerai atpažino tiek pati imunogeną, tiek ir gripo virusą A/Pekinas/353/89. Žemesni HAI titrai FLUZONE® .atveju gali būti sąlygoti antiserumo nesugebėjimo blokuoti agliutinaciją, kurią sukelia kitų kamienų virusų, esančių FLUZONE® hemagliutininas. Tuo tarpu, priešingai, pelės, imunizuotos FLUZONE®, gamina didelius HAI antikūnų titrus, kurie nustatomi tik prieš FLUZONE® antigenus. Tuo tarpu HAI titrai prieš gripo virus1 A/Beijing/353/89 ir rHA antigeną yra sumažėję. Panašus atsakas stebėtas ir žemesnių dozių grupėse.
[0151] Šie duomenys taip pat pagrindOia prielaid1, kad galimi genetiniai skirtumai tarp gripo viruso kamieno A/Pekinas/353/89, esančio FLUZONE® ir to paties viruso kamieno, gauto iš FDA ir auginto kiaušinyje,
[0152] kol buvo atliktas HAI testas. Tai, kad antikūnai, pasigaminę atsakant j rekombinantinj HAO, gautą klonuojant gripo viruso kamieną A/Pekinas/353/89, blokuoja eritrocitų agliutinaciją, kurią sukelia šio kamieno gripo virusas, jau savaime yra geras įrodymas , kad klonavimo eigoje nejvyko genetiniai pokyčiai, galėję paveikti sialo rūgšties receptoriaus sujungimo vietą, esančią išskirtame rHAO antigene.
[0153]
[0154] Pavyzdys 10: 1993/ 1994 gripo vakcinos vaisto forma ir klinikinis efektyvumas
[0155] Su žmonėmis atlikta kelios serijos klinikinių tyrimų nustatant eksperimentinės gripo vakcinos, j kurios sudėtį įeina rekombinantinis HA, saugumą ir imunogeniškumą bei gaunant preliminarius duomenis apie tokios vakcinos apsauginį efektyvumą prieš natūralią infekciją epideminio sezono metu. Gauti rezultatai rodo, kad vakcinos, turinčios savo sudėtyje rekombinantinį gripo viruso hemagiiutininą (rHAO), pagamintos pagal aukščiau aprašytą metodiką, sukėlė stebėtinai mažai pašalinių vietinių reakcijų ir sąlygojo ekvivalentinį ar didesnį apsauginį imuninį atsaką, palyginus su komercine, licenzine atenuota gripo vakcina, pagaminta auginant virusą kiaušiniuose.
[0156] Vakcinos. Rekombinantinės HA vakcinos, naudotos šiame tyrime, savo sudėtyje turėjo pilno ilgio nesuskaldytą HA (HAO) (H3N2) virusą. Rekombinantinis HAO (rHA) produkuotas Lepidopteran (vabzdžių) kultūros ląstelėse, kuomet j jas buvo eksponuotos su bakuloviruso vektoriumi, savo sudėtyje turinčiu cDNR su HA koduojančiu genu. Ekpresuotas baltymas buvo išskirtas nedenatūruojančiomis sąlygomis iki
[0157] >95% grynumo, vertinant kiekybine skenuojančia densitometrija antigeną, gautą po elektroforezės natrio dodecilsulfato poliakrilamido geliuose. Peptidas identifikuotas panaudojant aminorūgščių analizę, N-terminalinj sekvenavimą ir VVestem bloto analizę su antiserumu prieš gripo virusą A/Pekinas/32/92. rHAO vakcinos turėjo nustatytą kiekj sintetinio HA antigeno, ištirpinto fosfatais užbuferintame druskos tirpale arba aliuminio fosfato (alūno) adjuvanto adsorbuoto gelio suspenzijos formoje. Licenzinė trivalentinė subviriono vakcina, naudota šiame tyrime, turėjo po 15 ?g/dozei įvairių gripo viruso kamienų A/Teksasas/36/91 (N1N1), A/Pekinas/32/92 (H3N2) ir B/Panama/45/90 hemagliutininų (FLUZONE® atenuotos gripo vakcinos, pagamintos kiaušiniuose, Connaught Laboratories, Svviftvvater, PA).
[0158] Klinikiniai tyrimai. Saint Louis Universiteto ir Rochester Universiteto Institucinių Peržiūrų Tarybos išbandė tapačius tyrimų protokolus. Abiejų institucijų organizuotuose tyrimuose dalyvavo sveiki suaugę žmonės nuo 18 iki 45 metų amžiaus. Tiriamieji buvo parinkti atsitiktinai tam, kad panaudotų vieną iš sekančių penkių vakcinų pagal dvigubo-aklumo būdą: (1) 15 |.'.g rHAO, (2) ^g .rHAO plius alūnas, (3) 90 lig rHAO, (4) licenzine trivalentė inaktyvuota gripo viruso vakcina, arba (5) • druskos tirpalo-placebo. Vakcinos suleistos į raumenis 0.5 ml tūryje. Tam, kad būtų preliminariai įvertintas trijų vakcinų preparatų, į kurių sudėti įėjo rHAO, saugumas, pirmieji 25 asmenys buvo vakcinuoti randomizuotai (t.y.
[0159] 5 asmenys tyrimui) nepriklausomai nuo kitų asmenų ir buvo sekami apklausiant telefonu 48 vai po vakcinacijos pakol vėl bus atiktos likusios vakcinacijos.. Visi asmenys buvo apmokyti, kaip pirmąsias 6 dienas po vakcinacijos pildyti kasdienę pašalinių reakcijų stebėjimo kortelę, Įskaitant tiek vietinius, tiek sisteminius simptomus. Simptomai buvo suskirstyti j silpnai išreikštus, vidutinius ir stipriai išreikštus. Temperatūra matuota kasdien oraliniu būdu ir tyrimų dalyviai ją užrašydavo karščiavimo atveju. Injekcijos vietoje atsiradęs patinimas ar paraudimas buvo įvertinami pagal pasireiškimo laipsnį priklausomai nuo to, ar plotas savo diametru buvo didesnis ar mažesnis už ketvirčio dolerio monetą. Visos vakcinacijos atliktos laikotarpyje tarp 1993 metų lapkričio mėnesio paskutinės savaitės ir gruodžio mėnesio pirmosios savaitės. Serumo bandiniai imti iš kiekvieno tiriamojo prieš pradedant vakcinaciją, 3 savaitės po vakcinacijos ir dar vieną kartą 1994 metais kovo pabaigoje ar balandžio mėnesį, praėjus mažiausiai 2-3 savaitėms po to, kai gripo virusai jau nebecirkuliavo vietinėje bendruomenėje. Kiekvienoje institucijoje savanoriai buvo apmokyti, kaip susisiekti su tyrimų centru, jeigu pajustų į gripą panašius požymius žiemos epideminio sezono metu. J gripą panašiems požymiams buvo priskiriami bet kuris respiratorinis simptomas (ai), besitęsiantys dvi ar ilgiau dienų ir lydimas karščiavimo ir/ar tokių sisteminių simptomų kaip raumenų skausmai ar šalčio krėtimas. Iš asmenų, kurie pranešdavo apie į gripą panašius simptomus, buvo imami šluostiniai bandiniai iš nosies ir ryklės tam, kad būtų gauta viruso kultūra ir virusas būtų identifikuotas. Klinikiniai bandiniai buvo numeruojami koduojant ir tiriami aklai.
[0160] Serologija. Kiekvienam serologiniam tyrimui abiejų institucijų visi bandiniai buvo testuoti kaip vienas rinkinys vienoje laboratorijoje. Hemagliutinacijos inhibicijos (HAI) antikūnai gripo viruso A/Pekinas/32/93 (H3N2) antigenui nustatyti serumuose - panaudojant standartinį mikrotitravimo būdą, prieš tai pašalinus nespecifinį inhibitorių receptorių skaidančiu fermentu bei šalčio agliutininus tam tikslui panaudojus hemadsorbciją 4° C. Titras nustatytas. kaip didžiausias serumo atskiedimas, kuris apsaugo nuo hemagliutinacijos viruso 4 antigeninius vienetus, pradėjus skiesti serumą nuo 1 : 4. Serumo HA-specifiniai imunoglobulininiai G (IgG) antikūnai tirti imunofermentiniu metodu (ELISA), panaudojant išskirtą gripo viruso A/Pekinas/32/93 (H3N2) rHAO kaip dengiantį antigeną. Kietoje fazėje naudotų reagentų seka buvo ši: (1) išskirtas rHAO antigenas, (2) serumo bandinys, (3) su šarmine fosfataze konjuguotas ožkos serumas prieš žmogaus IgG, ir (4) p-nitrofenilo dinatrio fosfato substratas. ELISA titras išreikštas kaip didžiausias atskiedimas, kuriam esant šulinėlio, padengto antigenu, optinis tankis yra bent du kartus didesnis negu atitinkamo kontrolinio šulinėlio be antigeno. Neutralizuojantys antikūnai išmatuoti panaudojant mikroneutralizacijos testą, anksčiau aprašytą pas Treanor J.J., Betts R.F.. J. Infect. Dis. 168: 455-459 (1993). Trumpai, karščiu inaktyvuoto serumo serijiniai skiedimai buvo sumaišyti su gripo viruso A/Pekinas/32/93 (H3N2) maždaug 100 TCID50 ir inkubuoti 37° C 1 vai. Po to viruso-serumo mišinys adsorbuotas ant Madin-Darby šuns inksto ląstelių (MDCK) ištisinio vienasluoksnio 96-šulinėlių planšetėse 1 vai. kambario temperatūroje. Planšetės atplautos, kad būtų pašalintas likęs inokuliumas, pripilta beseruminės Dulbecco MEM terpės su 2|ig/ml tripsino ir inkubuota 5% C02 atmosferoje 33° C 72 vai. Ląstelės fiksuotos metanoliu ir viruso replikacija jvertinta panaudojant pelių monokloninių antikūnų, specifinių matriksui ir gripo viruso A kamieno nukleoproteinams panelj (Ligų Kontrolės Centrai, Atlanta,GA) bei po to sekančiame etape - su šarmine fosfataze konjuguotus antikūnus pelių IgG. Galutinis serumo titras nustatytas kaip didžiausias jo atskiedimas, sąlygojantis didesnj negu 50% signalo sumažėjimą palyginus su kontroliniais neneutralizuotais šulinėliais.
[0161] Virusologija. Nosiaryklės šluostinių bandinių virusų kultūros užaugintos kiekvienoje institucijoje naudojant standartinius metodus. Bandiniai inokuliuoti arba į MDCK, arba rhesus beždžionių inkstų ląsteles ir inkubuoti 33° C 4 dienas. Hemadsorbcija ant ląstelių vienasluoksnių išbandyta panaudojant 0.4% jūros kiaulytės eritrocitų suspenziją. Gripo virusai identifikuoti HAI būdu hemadsorbcijos pozityviose kultūrose panaudojant H3-specifinius antiserumus (Ligų Kontrolės Centrai). Statistinė analizė. Statistinei analizei reciprokiniai HAI, ELISA IgG • ir neutralizuojančių antikūnų titrai buvo logaritmiškai transformuoti. Žymiu atsaku j vakcinaciją buvo laikomas 4-kartis ar didesnis antikūnų titrų pakilimas, nustatytas palyginus antikūnų titrą prieš vakcinaciją su antikūnų titru, praėjus 3 savaitėms po vakcinacijos. Gripo viruso A (H3N2) infekcijos laboratorinis įrodymas buvo laikomas tuomet, jeigu iš nosiaryklės išskyrų buvo išsirtas virusas ir/arba serume buvo nustatytas 4-kartis ar didesnis HAI antikūnų titras tarp postvakcinacijos 3 savaitės (prieš sezoną) bandiniuose, surinktuose gruodžio mėnesj ir atitinkamuose posezoniniuose bandiniuose, surinktuose sekantį pavasarj. Skirtumai tarp vakcinuojamų grupių išanalizuoti naudojant Fisher'io tikslųjį testą, skirtą palyginti asmenų su pašalinėmis reakcijomis kiekį, žymų antikūnų atsaką arba laboratoriškai patvirtintą gripo susirgimą ar infekciją, o taip pat panaudojant variantų analizę (ANOVA) tam, kad būtų palyginti postvakcinaciniai vidurkiniai reciprokiniai log2 antikūnų titrai. Modifikuoti Bonferroni nelygybės ir Tukey-Kramer testai buvo panaudoti daugybiniams galimiems palyginimams.
[0162] Reaktogeniškumas. rHAO vakcinos, naudotos šiame tyrime, buvo saugios ir gerai toleruojamos. Pašalinių reakcijų dažnis nebuvo įtakojamas besikeičiančių rHAO antigeno dozių nuo 15 ng iki 90 jag, tačiau jos nežymiai padažnėdavo pridėjus alūno. Vietinis paraudimas, skausmas ir jautrumas injekcijos vietoje buvo stebimi žymiai dažniau, kai recipientai naudojo licenzinę subviriono vakciną, negu tada, kai recipientai naudojo arba 15 ng, arba 90 Įag rHAO druskos tirpale. Išskirtinai tik vienas asmuo patyrė stiprų skausmą, jautrumą ir nepatogumą žąste po imunizacijos licenzine vakcina, kai tuo tarpu kitiems visi simptomai buvo priskirti vidutiniškai išreikštiems ir tęsėsi 1-2 dienas. Jei išsivystydavo vietinis paraudimas ir/ar sukietėjimas, jis buvo mažesnis negu ketvirčio dolerio moneta.
[0163] Imunogeniškumas. Pagrindiniai serumo HAI titrai gripo viruso A/Pekinas/32/92 (H3N2) buvo mažesni ar lygūs 1 8 pas 64 (50%) asmenis iš 127 tiriamųjų. Dauguma asmenų kiekvienoje iš 4 vakcininių grupių pasižymėjo HA-specifiniais serologiniais atsakais, įvertintais HAI ir ELISA. būdais (lentelė 4). Serume HAI antikūnų postvakcinaciniai titrai buvo didesni arba lygūs 1 : 32 pas visus vakcinos recipientus, išskyrus du asmenis, kurių vienas gavo 15 jag rHAO, o kitas gavo licenzine vakciną. Atrodo, kad pas daugumą savanorių vakcinacija buvo susijusi su neutralizuojančių antikūnų produkcija. Vidutiniškai antikūnų titrų ir serokonversijos lygio pakilimas turėjo tendenciją būti truputį mažesniu po imunizacijos 15 jag rHA, palyginus su licenzine vakcina, tačiau šie skirtumai statistiškai nebuvo patikimi. Pridėjus alūno, antikūnų atsakas j rHAO nepadidėjo. Pas asmenis, imunizuotus 90 ng rHAO, vidutiniškai postvakcinaciniai HAI ir ELISA IgG antikūnų titrai buvo nuo dviejų iki penkių kartų aukštesni negu bet kurioje kitoje iš trijų vakcinavimo grupių
[0164] Apsauginis efektyvumas. Tiriamuoju laikotarpiu 26 asmenys pranešė apie 28 j gripą panašius susirgimus. Keturi iš šių individų (trys iš jų gavo placebo ir vienas buvo imunizuotas 15 Įig rHAO) turėjo gripo A kamieno (H3N2) virusą, išskirtą iš jų nosiaryklės kultūrų. Žymus HAI antikūnų gripo virusui A/Pekinas/32/92 titrų pakilimas stebėtas tiriant presezoninius ir postsezoninius serumų bandinius trijų iš keturių kultūrose patvirtintų atvejų metu, tačiau šis reiškinys nebuvo stebėtas tiriant gripu susirgusius individus. Vienintelis rHAO recipientas, kuris vėliau susirgo laboratoriškai patvirtintu gripu, turėjo pozityvią kultūrą, gautą praėjus 31 dienai po imunizacijos ir turėjo išreikštą serokonversiją nuo prevakcinacinio HAI titro mažiau kaip 1 : 4 iki postvakcinacinio (presezoninio) titro 1 : 32. Dviems papildomiems placebo recipientams ir vienam savanoriui, imunizuotam licenzine vakcina, serologiškai įrodyta gripo viruso A (H3N2) infekcija, įvykusi epideminio sezono metu, tačiau praėjusi be klinikinių ligos požymių. Palyginant visus vakcinuotus asmenis (arba visus asmenis, gavusius bet kurią rHAO vakciną) kaip vieną grupę, žymiai didesnė placebo recipientų dalis turėjo laboratoriškai patvirtintą A kamieno (H3N2) gripo viruso sukeltą susirgimą (p<.05) arba infekciją (p<.005).
[0165] Išvardinti duomenys rodo, kad gripo vakcinos, į kurių sudėtį įeina išskirtas rHAO antigenas, paruoštas kaip aprašyta aukščiau patentinėje paraiškoje, yra gerai toleruojamos ir sugeba pas žmones sukelti apsaugini imuninį atsaką. Netgi naudojant 90 Įig dozę, šiame tyrime rHAO nebuvo reaktogeniškesjiis negu druskos tirpalo placebo ir sukėlė žymiai mažiau vietinių pašalinių reakcijų negu licenzinė trivalentė subviriono vakcina, turinti pusę (t.y. 45 jj.g) totalinio HA antigeno.
[0166] Neutralizuojantys, HA-specifiniai antikūnų atsakai į 15 jag rHAO preparatą buvo panašūs į tuos, kuriuos sukėlė subvirioninė vakcina, ir žymiai išaugo, kai rHAO dozė buvo padidinta iki 90 Įig.
[0167] Visumoje infekcijos ir susirgimų dažnis, kurį sąlygojo gamtinė ekspozicija su cirkuliuojančiu epideminiu gripo viruso A (H3N2) kamienu, buvo žymiai mažesnis tarp vakcinuotų asmenų negu tarp placebo recipientų. Duomenys leidžia prielaidą, kad apsauginis efektas, kurj sukėlė rHAO, ypač tais atvejais, kai buvo taikytas didesnėmis dozėmis, gali būti prilygintas arba yra aukštesnis už tą, kurj sąlygojo šiuolaikinės komercinės vakcinos.
[0168] Pavyzdys 11: Pagerinto HAO klonavimo vektoriaus gavimo būdas
[0169] Pagerintas klonuojantis vektorius, skirtas subrendusio HA ekspresijai, lokalizuotas tuoj pat žemiau sekos, koduojančios chitinazės signalinį peptidą, buvo sukurtas.
[0170]
[0171] Plazmidė pMMGS27 paversta linijine panaudojant Pst1.
[0172]
[0173] Tikslinis genas HA buvo klonuotas PMGS27 - - 1 etapas. PGR pradmenys buvo sintezuoti.
[0174] 5' GTC GCC GTG TCC AAC GGG (subrendusio HA 5' galo 20 bazių) Reversinis oligonukleotidas (SEQ ID No.26 komplementarus):
[0175]
[0176] Tikslinio HA geno PGR atlikta panaudojant du oligonukleotidus tam, kad būtų gauta (SEQ ID No.25 ir SEQ ID No. 26):
[0177] Tikslinio HA geno prijungimas prie pMGS ir E . coli transformacija Sumaišomi linijinė pMGS27 ir T4 DNR polimeraze paveiktas HA geno fragmentas. Dvi molekulės prijungiamos viena prie kitos taip, kad susidarytų žiedinė plazmidė, kurią galima būtų panaudoti E. coli transformacijai. Diagramoje parodytas SEQ ID No. 25 ir 26, ir SEQ ID No.
[0178]
[0179] Kaip parodyta aukščiau, čia nėra papildomų aminorūgščių tarp signalinio peptido ir subrendusio HA.
[0180] Pavyzdys 12: 1995- 1996 metų trivalentės gripo viruso A ir B
[0181] Gripo viruso vakcina, išskirtas rekombinantinis hemagliutininas, trivalentė, tipai A ir B (A/Teksasas/36/92\1 (H1N1), A/Johanesburgas/33/94 (H3N2) ir B/Harbinas/7/94) yra neinfekcinis subvienetas, kilęs iš išskirto rekombinantinio gripo viruso hemagliutinino antigeno (HA). Naudojant aukščiau aprašytą būdą, buvo klonuoti A ir B kamienų gripo virusų, gautų iš Ligų Kontrolės Centro/Maisto ir vaistų administravimo, HA genai ir kiekvienas klonuotas genas buvo identifikuotas pagal sekų analizės duomenis. Bakuloviruso ekspresijos vektoriai, turintys gripo viruso kamienų A/Teksasas/36/91 (H1N1), A/Johanesburgas/33/94 (H3N2), B/Harbinas/7/94 klonuotus HA genus, buvo panaudoti rekombinantinių HA antigenų produkcijai vabzdžių ląstelių kultūrose. Rekombinantiniai HA baltymai yra pilno ilgio, nesuskaldyti hemagliutininai (rHAO). jų molekulinė masė apie 69,000. rHAO produkuoti Spodoptera frugiperda (Lepidopteran) ląstelių linijoje, augintoje beseruminėje terpėje. Trivalentės vakcinos sudarytos iš išvalytų (daugiau negu 95% ar net daugiau 99% grynumo) rHA, išskirtų iš dviejų gripo viruso A kamienų ir vieno B kamieno sumaišant juos lygiomis dalimis. Vakcina pateikiama klinikiniam naudojimui kaip išvalyti A ir B tipų rHAO baltymai fosfatais užbuferintame druskos tirpale nepridedant konservanto.
[0182] Monovalentinės, bivalentinės ir trivalentinės rHAO vakcinų eksperimentiniai tyrimai, atlikti su gyvuliukais, parodė, kad jos nepasižymi žymiu toksiškumu, Vakcinoje nestebėti toksiški ar atsitiktiniai agentai. A/Pekinas/32/92 ir A/Teksasas rHAO saugumo ir imunogeniškumo tyrimai atlikti pelėse ir jūrų kiaulytėse. Nepastebėta pašalinių reakcijų. Pelėse, vienkartinė imunizacija panaudojant 15 mikrogramų rHAO antigenų be adjuvanto, per dvi - tris savaites iššaukia anti-HA IgG antikūnų, hemagliutinino inhibicijos (HAI) antikūnų ir neutralizuojančių antikūnų aukštų lygių pasirodymą.
[0183] Viename tyrime, pelių grupės po 10 pelių buvo imunizuotos 15 mikrogramų išskirto A/Pekinas/32/92 (H3N2) rHAO, kuris buvo produkuotas vabzdžių ląstelių kultūroje, adaptuotoje augti beseruminėje terpėje (rHA-SF). Praėjus dviems - trims savitėms po injekcijos, pelės buvo nukraujinamos ir paruošiami serumo bandiniai. Serumuose įvertinti anti-HA IgG ir HAI antikūnai.. Tiek rHA, tiek rHAO-SF antigenai sukėlė panašius anti-HA ir HAI antikūnų titrus. Praėjus dviems savaitėms po vienkartinės imunizacijos, daugumoje pelių pastebėti aukšti HAI antikūnų titrai, o trečią savaitę 8/10 pelių HAI titrai buvo 32 ar dar aukštesni. Šie ir kiti biocheminiai ir imunologiniai tyrimai rodo, kad rHAO, produkuotas beseruminėje vabzdžių ląstelių kultūroje, savo ypatumais nesiskiria nuo rHA, pagaminto fermentacinėse sąlygose terpėje su serumu.
[0184] Atliktas tyrimas, norint palyginti 1994-1995 metų trivalentės gripo vakcinos rHAO vaistinę formą su licenzine išskirto viruso paviršiaus vakcina, Fluvirin® (atenuota gripo viruso vakcina, pagaminta kultivuojant kiaušiniuose). J kiekvienos vakcinos sudėtj įėjo 15 mikrogramų rHAO arba po 0.5 ml gripo viruso kamienų Teksasas/36/91 (H1N1), A/Šangdongas/9/93 (H3N2) ir B/Panama/45/90 virusinio HA. Tiek rekombinantinis rHAO, tiek Fluvirin® vakcinos pateikiamos fosfatais užbuferintame druskos tirpale. Pelių grupės po 10 pelių buvo nukraujinamos praėjus 0, 2 ir 3 savaitėm po injekcijos ir paruošti serumo bandiniai. Serume įvertinti anti-HA IgG antikūnų, antikūnų, slopinančių virusus, auginamus kiaušiniuose, ir neutralizuojančių antikūnų, nukreiptų prieš įvairių kamienų virusus, auginamus kiaušiniuose, kiekiai.
[0185] Kaip parodyta Fig. 4a, 4b, ir 4c, tiek rekombinantinis rHAO, tiek licenzinės gripo vakcinos, sukėlė pasirodymą didelių kiekius serumo IgG antikūnų, nukreiptų prieš kiekvieno iš trijų vakcinos viruso kamienų hemagliutininus. Palyginus su licenzine vakcina, rHAO vakcina sukėlė nuo 4 iki 10 kartų didesnius IgG antikūnų titrus. Kaip parodyta 5 lentelėje, pasigamino taip pat antikūnai, kurie slopino kamienų A ir B virusų sukeltą viščiukų eritrocitų hemagliutinaciją. Palyginus antikūnų kiekj, sukeltą po imunizacijos trivalente rHAO vakcina, su kiekiu, atsiradusiu po imunizacijos licenzine vakcina, rasta kad pirmuoju atveju HAI titrai buvo ekvivalentiški arba aukštesni kiekvieno iš trijų viruso kamienų atžvilgiu. Vakcinos taip pat indukavo atsiradimą didelių kiekių antikūnų, nukreiptų prieš specifinius gripo viruso A ir B kamienus, nustatant juos standartiniu mikrotitro viruso neutralizacijos testu. Geometriniai neutralizuojančių antikūnų titrai buvo beveik du kartus aukštesni pas peles, kurios buvo imunizuotos rHAO, palyginus su pelėmis, imunizuotomis licenzine išskirto viruso paviršiaus vakcina, Fluvirin®. Šie duomenys rodo, kad rHAO vakcinos trivalentinė vaisto forma, kurios pagrindą sudaro 1994-1995 metų viruso A ir B kamienai, yra ekvivalentinė arba net efektyvesnė už licenzinę subvienetinę gripo vakciną ir sukelia serume veiklius HAI ir neutralizuojančius antikūnus, nukreiptus prieš visus tris vakcinos viruso kamienus.
[0186] Čia aprašytų būdų ir sudėčių, naudotų ruošiant ir vartojant rekombinantinę gripo viruso vakciną, modifikacijos ir variacijos bus aiškios patyrusiems. Tokias modifikacijas ir variacijas ketinama paminėti pridedamose išradimo apibrėžtyse.
[0187]
[0188] SEKŲ SĄRAŠAS (1) BENDRA INFORMACIJA:
[0189] MULTIVALENTINIŲ VAKCINŲ GAMYBOS BUDAS (III) SEKŲ SKAIČIUS: 32
[0190] (F) KODAS: 3039-3450
[0191] (C) OPERACINĖ SISTEMA: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMINĖ ĮRANGA: Patentln Release # 1.0, versija #1.25
[0192] (A) PARAIŠKOS NUMERIS: PCT/US95/06750
[0193] (A) ILGIS: 12 bazių porų
[0194] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
[0195] (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
[0196] (B) PAVADINIMAS: Bakterinio klono, turinčio gripo, viruso WSN kamieno
[0197] (H0N1) hemagliutinino geną, konstravimas ir apibūdinimas.
[0198]
[0199] (A) ILGIS: 39 bazių porų
[0200] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 2:
[0201] (A) ILGIS: 35 bazių porų
[0202] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 3:
[0203] (A) ILGIS: 39 bazių porų
[0204] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 4:
[0205] (A) ILGIS: 35 bazių porų
[0206] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūle (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė (xi) ' SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 5:
[0207] (A) ILGIS: 1793 bazių porų
[0208] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULĖS TIPAS: DNR (genominė
[0209] (vi) PRADINIS ŠALTINIS:
[0210] (C) INDIVIDUALUS IZOUATAS: A/Pekinas/32/92/rHA
[0211] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalinę seką
[0212] (A)VARDAS/RAKTAS: Smal restrikcijos saitas
[0213] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA
[0214] (A)VARDAS/RAKTAS: Kpnl restrikcijos saitas
[0215] (A) VARDAS/R AKTAS: Bg1 II restrikcijos saitas
[0216] (A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas
[0217]
[0218] (xii) SEKOS CHARAKTERISTIKOS: (A) ILGIS: 570 bazių porų
[0219] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiOlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
[0220] (v) FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis
[0221] (C) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Pekinas/32/92/rHA
[0222] (A)VARDAS/RAKTAS:AcNPV 61K baltymo signalinė seka
[0223]
[0224] (A) ILGIS: 1766 bazių porų
[0225] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė
[0226] (A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B)INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Teksasas/36/91/rHA
[0227] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalinį peptidą
[0228] (A)VARDAS/RAKTAS: SmaI restrikcijos saitas
[0229] (A)VARDAS/RAKTAS: KpnI restrikcijos saitas
[0230] ( A)VARD AS/RAKTAS: SmaI restrikcijos saitas
[0231] (A)VARD AS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA
[0232] A) V ARD AS/RAKT AS: KpnI restrikcijos saitas
[0233] (ix) YPATUMAS (A) VARD AS/RAKT AS: Bg 1II restrikęijos saitas
[0234] (A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas
[0235] (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 8:
[0236]
[0237] DUOMENYS APIE SEQID No: 9: (vii) SEKOS CHARAKTERISTIKOS: (A) ILGIS: 572 bazių porų
[0238] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė
[0239] (xi) FRAGMENTO TIPAS: N-terminaJinis (xii) PRADINIS ŠALTINIS:
[0240] (B) INDIVIDUALUS IZOLLATAS: A/Teksasas/36/91/rHA
[0241] (A)VARDAS/RAKTAS: AcNPV 6IK baltymo signalinė seka
[0242] (ix) YPATUMAS (A)VARDAS/RAKTAS: subrendęs r HA
[0243] (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 9:
[0244]
[0245] (A) ILGIS: 1799 bazių porų
[0246] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
[0247] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis HA signalinio peptido seka
[0248] (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ED No:-10:
[0249]
[0250] (C) SrOLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii) MOLEKULES TIPAS: peptidas
[0251] (v) FRAGMENTO TIPAS: N-tenninalinis
[0252] (A) ORGANIZMAS: gnpo virusas (C)INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Panama/45/9o'rHA (ix) YPATUMAS (A)VARDAS/RAKTASHA signal peptide
[0253] (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 11:
[0254]
[0255] (A) ILGIS: 1811 bazių porų
[0256] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiolė (D) TOPOLOGDA: linijinė
[0257] (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Nyderlandai/13/94 rHA
[0258] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signaline seka (B)BUVIMO VIETA: 19 iki 72
[0259] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA
[0260] A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas
[0261]
[0262] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė
[0263] (A) ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Nyderlandai/l 3/94 rHA
[0264] (A)VARDAS/RAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinė seka
[0265] (ix) YPATUMAS
[0266]
[0267] ( 2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
[0268] (A) ILGIS: 1757 bazių porų
[0269] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
[0270] (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Šandongas/9/93 rHA
[0271] (A)VARDASZRAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalą
[0272] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA
[0273] (A)VARDAS/RAKTAS: KpnI restrikcijos saitas (B)BUVIMO VIETA: 1735 iki 1740
[0274] ( (ix) YPATUMAS"
[0275] VARDAS/ RAKTASiiBglII restriction site BUVIMO VIETA:: 1741 to 1746
[0276] (ix) YPATUMAS A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas
[0277]
[0278] (A) ILGIS: 571 aminorūgštis
[0279] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė
[0280] (A)VARDAS/RAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinė seka
[0281] (B)BUVIMO VIETA: 19 iki 553
[0282]
[0283] (A) ILGIS: 1814 bazių porų
[0284] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii)MOLEKUL £ S TIPAS: DNR (genominė) (iii)HIPOl h 1 INE: NE
[0285] (C) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Šanchajus/4/94 rHA
[0286] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalą
[0287] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA
[0288] A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas (B)BUVIMO VIETA: 1804 iki 1814 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ED No: 16:
[0289] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė
[0290] (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Šanchajus/4/94 rHA
[0291] (A) VARDAS/RAKTAS: AcNPV 61K baltymo signalinis peptidas
[0292]
[0293] (A) ILGIS: 1802 bazių porų
[0294] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D)TOPOLOGUA: linijinė
[0295] (iv) ANTISENSINE: NE . '
[0296] (A) VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis HA baltymo signalinį peptidą
[0297] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA
[0298] A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas
[0299]
[0300] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA, linijinė
[0301] (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: B/Harbmas/7/94 rHA
[0302] (B) BUVIMO VIETA: 18 iki 569 (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 19:
[0303] (A) ILGIS: 1757 bazių porų
[0304] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGUA: linijinė
[0305] (A )ORGANIZMAS: gripo virusas (B) INDIVIDUALUS EOLIATAS: A/Johanesburgas/33/94 rHA (ix) YPATUMAS
[0306] (ix) YPATUMAS (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis AcNPV 61K baltymo signalinį peptidą
[0307] (A)VARDAS/RAKTAS: rajonas, koduojantis subrendusį rHA
[0308] A)VARDAS/RAKTAS: universalus transliacijos terminacijos signalas
[0309]
[0310] (C) SIŪLŲ SKAIČIUS: vienasiūlė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ii)MOLEKULĖS TIPAS: peptidas
[0311] (iv)ANTISENSIN £ : NE (v)FRAGMENTO TIPAS: N-terminalinis
[0312] (B) INDIVIDUALUS IZOLIATAS: A/Johanesburgas/33/94 r HA
[0313] (A) VARDAS/RAKTAS: AcNPV61K baltymo signalinė seka
[0314] (xi) SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No: 21:
[0315]
1. Rekombinantinis gripo viruso HAO hemagliutinino baltymas, ekspresuotas bakuloviruso ekspresijos sistemos pagalba vabzdžių ląstelių kultūroje.
2. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad bakuloviruso signalinis peptidas prijungtas tiesiogiai prie HAO baltymo be įsiterpiančių sekų.
3. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi vaistiniu požiūriu tinkamą nešiklj ir yra paruoštas naudoti kaip vakcina.
4. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi adjuvantą ir vaistiniu požiūriu tinkamą nešiklj ir yra paruoštas naudoti kaip vakcina.
5. Baltymas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad vaistiniu požiūriu tinkamas nešiklis yra polimerinė pateikimo sistema.
6. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad gripo virusas yra atrinktas iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų.
7. Baltymas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad gripo virusas infekuoja žmones.
8. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi antrąjį baltymą, kuris yra sulietas su hemagliutininu.
9. Baltymas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra atrinktas iš grupės, sudarytos iš hepatito B viruso baltymų, ŽIV baltymų, karcinoembrioninio antigeno ir neuraminidazės.
10. Vektorius, naudojamas, rekombinantinio gripo viruso HAO hemagliutinino baltymo gamybai, susidedantis iš šių 5' - >3' sekų: bakuloviruso polihedrino promotoriaus, ATG transliacijos startinio kodono, signalinio peptido, sekų, koduojančių gripo viruso kamieno subrendusi hemagliutininą, transliacijos terminacijos kodono ir polihedrino RNR poliadenilinimo signalo.
11. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo signalinis peptidas yra bakuloviruso baltymas, kurio molekulinė masė apie 61K ir aminorūgščių sekų rinkinys yra tarp pirmųjų 18 aminorūgščių, nurodytų Sekų Sąraše ID No. 7.
12. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi signalinj peptidą, kuris yra gripo viruso hemagliutinino baltymo promotorius.
13. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo seka, koduojanti signalinj peptidą ir hemagliutininą, nekoduoja jokių įsiterpiančių aminorūgščių.
14. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi seką, koduojančią antrąji baltymą, kuris yra ekspresuojamas kaip sulietas su hemagliutininu baltymas.
15. Vektorius pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra transfekuotas j kultivuojamas vabzdžių ląsteles.
16. Rekombinantinio gripo viruso hemagliutinino baltymo gavimo būdas, susidedantis iš vabzdžių ląstelių kultūros užkrėtimo panaudojant vektorių, turintį šias 5' -> 3' sekas:bakuloviruso polihedrino promotoriaus, ATG transliacijos startinio kodono, signalinio peptido, sekų, koduojančių gripo viruso kamieno, atrinkto iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų, hemagliutininą, transliacijos terminacijos kodono ir polihedrino RNR poliadenilinimo signalo, ir ląstelių auginimo maitinančioje terpėje.
bakuloviruso polihedrino promotoriaus, ATG transliacijos startinio kodono, signalinio peptido, sekų, koduojančių gripo viruso kamieno, atrinkto iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų, hemagliutininą, transliacijos terminacijos kodono ir polihedrino RNR poliadenilinimo signalo, ir ląstelių auginimo maitinančioje terpėje.17. Būdas pagal 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad galima išskirti HA0 gripo viruso hemagliutinino baltymą iki mažiausiai 95% grynumo.
18. Būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kact baltymą gauna išskiriant hemagliutininą iš nemembraninių baltymų šarminiame pH, plaunant su membrana susijusius baltymus tam, kad būtų eliuotas hemagliutininas, išskiriant hemagliutininą iš kitų baltymų, pririšant juos prie anijonų kaitos celiuliozės keičiant druskos koncentraciją.
19. Vektoriaus, turinčio šias 5' -> 3' sekas: bakuloviruso polihedrino promotoriaus, ATG transliacijos startinio kodono, signalinio peptido, sekų, koduojančių gripo viruso kamieno, atrinkto iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų, hemagliutininą, transliacijos terminacijos kodono ir polihedrino RNR poliadenilinimo signalo, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad virusas surenkamas iš ląstelių kultūros terpės ir išskiriama arba gripo viruso A kamienų virusinė RNR , arba B kamienų mRNR; sintezuojama cDNR naudojant arba universalų pradmenį (5' - AGCAAAAGCAGG-3' ( SEQ ID No. 1), kuomet dirbama su gripo viruso A kamienų virusine RNR, arba atsitiktinius pradmenis, kuomet dirbama su gripo viruso B kamienų mRNR, ir kuomet 5' ir 3' pradmenys turi tokius restrikcijos enzimų saitus galuose, kurie nerandami hemagliutininų genų viduje; amplifikuojami A arba B gripo viruso pradmenys ir gripo viruso cDNR sumaišant su hemagliutinino geno segmentais, tam, kad būtų gauti dvisiūliai DNR fragmentai, turintys sekas, koduojančias pilną subrendus] hemagliutininą; identifikuojamas hemagliutinino genų signalinis peptidas ir tuomet amplifikuojami hemagliutinino genai be signalinio peptido; ir klonuojami hemagliutinino genai be signalinio peptido vektoriuje, turinčiame savo sudėtyje AcNPV polhedrino promotorių.
20. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad hemagliutinino genus klonuoja vektoriuje, panaudojant PCR tokiu būdu, kad vektorius koduotų signalini peptidą, sujungtą tiesiogiai su hemagliutininu be jsiterpiančių aminorūgščių.
21. Būdas pagal 19 punktą, besiskiriantis tuo, kad vektorių transfekuoja j vabzdžių ląsteles ir atrenka ląsteles, ekspresuojančias hemagliutininą.
22. Rekombinantinio HAO hemagliutinino baltymas, ekspresuotas bakuloviruso ekspresijos sistemos pagalba vabzdžių ląstelių kultūroje, skirtas panaudoti vakcinacijai nuo gripo.
23. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudoja baltymą polimerinėje pateikimo sistemoje.
24. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad gripo virusą atrenka iš grupės, sudarytos iš gripo viruso A ir B kamienų.
25. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad gyvūną pasirenka iš grupės, kuriai priklauso žinduolių ir paukščių rūšys.
26. Baltymas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad gyvūnas yra žmogus.