[LT] Išradimas skirtas medicinai, o būtent - biologiškai aktyvių medžiagų, pasižyminčių imunoreguliavimo savybėmis, gavimo būdui, ir gali būti pritaikytas medicinoje, veterinarijoje, o taip pat eksperimentinėje biochemijoje.@Išradimo pagrindą sudaro naujo sintetinio biologiškai aktyvaus peptido, pasižyminčio imunoreguliavimo savybėmis sukūrimas, kurio formulė@@ X -A - D - Trp - Y, @kurioje@A - D-Glu, iD-Glu,@X - H arba Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, -aminobutano rūgštis, -aminokaprono rūgštis;@Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, -aminobutano rūgštis, -aminokaprono rūgštis, -OH arba pakeistasis amidas (C1-C3).@Peptido gavimo būdą sudaro glutamino peptidų sintezė tirpale, išskleidžiant tributiloksikarbonilglutamino (D arba L) rūgšties vidinį anhidridą preparato D-Trp-Y tinkama K-druska ir po to chromatografiškai atskiriant - ir -izomerus. Tolesnė sintezė vykdoma auginant peptido grandinę tributiloksikarbonilamino rūgščių aktyvuotųjų esterių pagalba.@
[EN] The invention pertains to medicine, specifically to methods of obtaining biologically active substances with immunoregulatory properties, and can be used in medicine, veterinary science and experimental biochemistry. the problem addressed by the invention is that of producing a novel synthetic biologically active peptide with immunoregulatory properties of formula X-A-D-Trp-Y, in which A is D-Glu, iD-Glu; X is H or Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVAL, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, -aminobutyric acid, -aminocaproic acid; Y is Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, -aminobutyric acid, -aminocaproic acid, -OH or substituted amide (C1-C3). The method of producing thepeptide involves the synthesis of glutamil-containing peptides in solution by scission of an internal anhydride of tributyloxycarbonyl glutamic (D or L) acid with the appropriate K-salt of D-Trp-Y. This is followed by chromatographic separation of the - and -isomers. Further synthesis was carried out by building up a peptide chain using activated esters of tributyloxycarbonylamino acids.
[0001] Išradimas skirtas medicinai, o būtent - biologiškai aktyvių medžiagų, pasižyminčių imunoreguliavimo sąvybėmis, gavimo būdui, ir gali būti pritaikytas medicinoje, veretrinarijoje, o taip pat eksperimentinėje biochemijoje.
[0002] Naujų, nekenksmingų imunoreguliavimo peptidų, galinčių sustabdyti progresuojantį tokių susirgimų, kaip piktybiniai dariniai, sepsis, chroniškos ir ilgalaikės infekcijos, besivystančios imunodeficito būsenos fone, sukūrimo aktualumą patvirtina daugybė tyrinėjimų, atliktų šioje srityje.
[0003] Labiausiai paplitęs naujų peptidų sukūrimo būdas yra aktyvių peptido frakcijų išskyrimas iš apjungtų audinių ekstraktų, frakcionavimas ir valymas, gaunant individualią identifikuotą medžiagą (SU Nr. 1600047, SU Nr. 1638849, SU Nr. 1737798). Praktinėje medicinoje kaip imuninių procesų reguliatoriai gerai žinomi timuso ekstraktai, būtent, timozino 5 frakcija /Goldstein A.L., Guna A., Latz M.M., Hardy H.A., VVhite A./, timalinas/CH, Nr.659586/. Šiuos ekstraktus sudaro polipeptidinės prigimties medžiagų kompleksas ir jų gavimą iš gamtinių šaltinių riboja gamybos sudėtingumas, maža aktyvių medžiagų išeiga ir didelis jų fizikinių-cheminių charakteristikų ir biologinių sąvybių kintamumas. Be to, timuso gamtinių praparatų sudėtyje yra balastinių komponentų, todėl, juos vartojant, ligoniai retkarčiais jaučia šalutinius poveikius. Pastaroji aplinkybė ir buvo stimulas sukurti sintetinius peptido preparatus. PCT WO 089/06134, SU 1541821, SU Nr. 1518956, EP Nr.230052, EP Nr.406931, US Nr.5021551, US
[0004] Nr.5013723 išradimuose aprašyti peptidų, pasižyminčių imunoreguliavimo sąvybėmis, sintezės būdai. Kiekvienas gautas sintetinis peptidas, turintis ribotą
[0005] būtinų sąvybių kompleksą yra labai aktyvus, netoksiškas, nesukelia šalutinių poveikių, apsprendžiančių jų galimą pritaikomumą medicinoje.
[0006] Šio išradimo tikslas - sukurti naują sintetinį biologiškai aktyvų, pasižymintį imunorogeliavimo sąvybėmis, peptidą kurio formulė:
[0007]
[0008] kurioje
[0009] A - D-Glu, iD-Glu;
[0010] X - H arba Gly, Ala, Leu, lle, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminobutano rūgštis, ę-aminokaprono rūgštis;
[0011] Y - Gly, Ala, Leu, lle, Vai, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-lle, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, y-aminobutano rūgštis, £-aminokaprono rūgštis, -OH arba pakeistasis amidas (C^ - C3).
[0012] Taip pat šio išradimo tikslas yra sukurti naują technologinį peptido medžiagos gavimo procesą kuris leistų nesudėtingai kelių stadijų metu gauti aukščiau parašytos formulės produktą.
[0013] Šio išradimo esmę sudaro glutamilo peptidų sintezė tirpale, išskleidžiant tributiloksikarbonilglutamino (D arba L) rūgštį atitinkamu dariniu D-Trp-Y ir po to chromotografiškai atskiriant a- ir y- izomerus. Tolesnė sintezė buvo atliekama, auginant peptido grandinę tributiloksikarbonilamino rūgščių aktyvuotųjų esterių pagalba.
[0014] 1 lentelėje pateiktos peptido junginių analogų reikšmės R» (chloroformas-metanolis-32 % acto rūgštis=60:45:20) ir Rc (butanolis-piridinas-vanduo-acto rūgštis=5:5:4:1) sistemoje.
[0015] Išradimas iliustruojamas pateiktu pavyzdžiu.
[0016]
[0017] 14,7 g (0,1 molio) H-D-Glu-OH buvo ištirpinta 200 ml distiliuoto vandens, vienmolio KOH tirpalo pagalba pH buvo nustatytas iki 10,2, intensyviai maišant buvo pridėta 33,0 g (0,3 molio) B0C20 tirpalo dioksane. Buvo stebimas pH dydis pH-metre. Pasibaigus reakcijai, mišinys buvo patalpintas į dalijamąjį piltuvą iš šarminės terpės ekstraguotas etilacetatu 3x150 ml, vandens fazė buvo iš lėto rūgštinama 0,2% sieros rūgšties tirpalu iki pH=3,0 ir Boc-D-Glu-OH ekstraguotas į organinę fazę (3x200 ml). Organinis sluoksnis buvo praplautas 3x200 ml sočiuoju Na2S04 tirpalu, gaunant neutralią terpę, džiovintas Na2S04, garintas vakuume iki aliejaus būvio. Išeiga: 16,7 g {68%).
[0018] 16,7 g (0,068 molio) Boc-D-Glu-OH buvo ištirpinta 200 ml dimetilformamide, tirpalas buvo atšaldytas iki 0°C ir maišant pridėta 20,6 g (0,1 molio) N,N'-dicikloheksilkarbodiimido, ištirpinto 100 ml dimetilformamido, tirpalo. Mišinys buvo maišomas 4 vai. +4°C temperatūroje, ir paliktas 8 vai. nusistovėti kambario temperatūroje. Iškritusios dicikloheksilkarbamido nuosėdos buvo nufiltruotos, praplautos 2x50 ml dimetilformamidu, filtratas buvo garintas vakuume, sumažinant jo tūrį perpus, ir, šaldant iki +4°C temperatūros bei
[0019] intensyviai maišant, buvo pridėta 24,3 g (0,1 molio) H-D-Trp-OK. Mišinys buvo paliktas palaipsniui įšilti iki kambario temperatūros. Apie reakcijos pabaigą spręsta pagal plonasluoksnės chromotografijos duomenis sistemoje (chloroformas:etilacetatas:metanolis 6:3:1) iki išnykstant rūgšties vidinio anhidrido Boc-D-Glu dėmei. Dicikloheksilkarbamido liekanos buvo nufiltruotos, dimetilformamidas garintas vakuume. Į aliejaus pavidalo liekaną buvo pridėta 200 ml etilacetato ir 200 ml 0,2% sieros rūgšties tirpalo. Organinis sluoksnis buvo atskirtas, praplautas, neutralizuojant jį sočiuoju Na2S04 tirpalu, džiovintas Na2S04, etilacetato tirpalas garintas vakuume. Taip buvo gautos aliejaus pavidalo nuosėdos, kurias sudarė Boc-D-Glu-D-Trp-OH ir Boc-iD-Glu-D-Trp-OH mišinys. Bendra masės išeiga sudarė 25,4 g (70%).
[0020] 25,4 g (0,048 molio) mišinio buvo ištirpinta 200 ml skruzdžių rūgšties, maišyta 1 vai 40°C temperatūroje ir garinta vakuume iki aliejaus būvio. Peptidų atskyrimas ir valymas jonų mainų chromotografijos pagalba buvo atliktas kolonėlėje su Sefadeksu piridinacetatinio buferio gradiente 0,01-0,2 M. Išeiga: 5,7 g (35%) H-D-Glu-D-Trp-OH ir 5,7 g (35%) H-iD-Glu-D-Trp-OH.
[0021] Ištyrus fizikines-chemines peptido savybes, gautos sekančios jo charakteristikos:
[0022] Tirpumas lengvai tirpstantis vandenyje, ribotai - spirite, netirpus chloroforme.
[0023] Ultravioletinis spektras yra 250-300 nm srityje, maksimumas - 280±2 nm, petys - 287±2 nm.
[0024] Biologinis naujojo peptido aktyvumas buvo išbandytas ant Balb/c linijos pelių. Pelių blužnies ląstelės buvo suspenduotos RPMI 1640 terpėje su 2 ml glutamino ir 5% neaktyvuoto fetalinio serumo ir 100 įJ buvo įvesta į plokščiadugnes planšetes po 200000 ląstelių į kiekvieną duobutę atitinkamai. Tiriamasis preparatas buvo įvestas kultivavimo pradžioje. Kaip mitogenas buvo panaudotas konkanavalinas A, kurio galutinė koncentracija sudarė 2 ug į kiekvieną duobutę. Planšetės buvo inkubuotos 48 vai, esant 37°C temperatūrai ir 5% C02. Ląstelių proliferacija buvo įvertinta pagal 3H-timidino, kurio 5 mkg/ml dozė buvo įvesta, likus 24 vai iki kultivavimo pabaigos, įsisavinimą apskaičiuotą scintiliacinio skaitiklio pagalba, ir išreikšta skilimų kiekiu per minutę (CPM). Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje. 2 lentelė
[0025]
[0026] Nustatyta, kad naujasis peptidas pasižymi savybe slopinti blužnies ląstelių proliferaciją.
[0027] jo ūmaus toksiškumo įvertinimas. Šis įvertinimas buvo atliktas pagal Rusijos Federacijos farmakologijos komiteto metodines rekomendacijas "Naujų farmakologinių medžiagų bendro toksinio poveikio priešklinikinio tyrinėjimo reikalavimai", M., 1985.
[0028] Tyrimų rezultatai parodė, kad, įvedus 1000 peptido dozių į pilvaplėvę, jis nesukėlė aštraus toksinio poveikė ir, esant tokioms dozėms, buvo neįmanoma pasiekti jų LD5o-Biologiškai aktyvus peptidas gali būti plačiai pritaikytas medicinoje ir veterinarijoje.
1. Peptidas, kurio formulė
2. Peptido, kurio formulė