[LT] Aprašyta pilna kDNR, koduojančios 14 kDa baltymą iš ožkos kepenų, pasižymintį citotoksinėmis savybėmis, seka.
[EN] The complete cDNA sequence coding for a 14 kDa protein from goat liver having cytotoxic properties, is descriebed.
[0001] Šis išradimas susijęs su kDNR, koduojančios 14 kDa
[0002] WO 92/10197 aprašo perchlotato rūgšties ekstraktus iš žinduolių organų, konkrečiai, iš ožkos kepenų, susidedančius iš mažiausiai trijų skirtingų baltymų ir pasižyminčių neįprastinėmis farmakologinėmis ir imunologinėmis savybėmis.
[0003] Kiek vėliau, publikacijoje WO 96/02567 aprašyta 14 kDa baltymo, išgryninto iš ekstraktų, aprašytų WO 92/10197, dalinė aminorūgščių seka. Šis baltymas pasižymi žymiu antineoplastiniu aktyvumu tiek in vitro, tiek in vivo, o gyvūnų, imunizuotų šiuo baltymu, serumas pasižymi citotoksiniu aktyvumu prieš žmogaus auglio ląstelių linijas.
[0004] 1993 m. Levy-Favatier et al. [ Eur. J. Biochem. 212 (3), 665-673] aprašė kDNR seką, koduojančią 23 kDa dimerinj polimerą, išgrynintą iš žiurkės kepenų ir inkstų 5 % perchlorato rūgštimi; atitinkama aminorūgščių seka pasižymi dideliu homologiškumu su 14 kDa baltymo, aprašyto WO 96/02567, seka. kDNR seka deponuota EMBL duomenų banke, registracijos Nr. X70825.
[0005] 1995 m. EMBL duomenų banke deponuota dar viena kDNR seka, koduojanti 14 kDa baltymą, išgryninta perchlorato rūgštimi iš žiurkės kepenų, pasižyminti dideliu homologiškumu su seka, aprašyta Levy-Favatier et al., registracijos Nr. D49363.
[0006] Šią seką aprašė Oka et al., [ J. Biol. Chem. (1995) 270 (50), 30060-30067J.
[0007] Be to, 1996 m. dvi naujos iRNR sekos, pasižyminčios dideliu homologiškumu kDNR, aprašytai Levy-Favatier et al. ir Oka et al., buvo deponuotos EMBL duomenų banke. Viena iš jų
[0008] (registracijos Nr. X95384) koduoja 14,5 kDa žmogaus baltymą ir neseniai buvo aprašyta Schmiedeknecht et al. [ Eur. J. Biochem.
[0009] (1996) 242 (2), 339-351]. Kita seka (registracijos Nr. U50631) koduoja " Mus Musculus j šilumą reaguojantį baltymą"; iki šiol nepaskelbta jokio išsamesnio tyrinėjimo apie šią seką. Mes radome naują kDNR seką, koduojančią visą 14 kDa baltymą, išekstrahuotą perchlorato rūgštimi iš ožkos kepenų ir aprašytą Wo 96/02567. Visa nukleotidų seka pateikta ID Nr. 1. kDNR seka, koduojanti 14 kDa baltymą, išekstrahuotą perchlorato rūgštimi iš ožkos kepenų ir aprašytą WO 96/02567 (seka ID Nr. 2) tinka minėto baltymo arba jo mutantų gavimui rekombinantinės DNR metodais arba diagnostiniam panaudojimui nukleotidinių zondų pagrindu. Šio išradimo kDNR seka gauta tokiu būdu: aminorūgščių sekos, aprašytos WO 96/02567, pagrindu susintetinti du degeneruotų oligonukleotidų mišiniai. Vienas mišinys (vadinamas PG-1) susideda iš 2.048 oligo-20-merų, atitinkančių aminorūgščių sekai nuo Met-1 iki Gln-7. Kitas mišinys (vadinamas PG-2) susideda iš 192 oligo-20-merų, atitinkančių aminorūgščių sekai nuo Ala-46 iki Xaa-52. Atlikta PCR reakcija, panaudojant šiuos oligonukleotidų mišinius praimeriais ir kDNR, gautas iš atvirkštinės transkripcijos nuo totalinės RNR, išskirtos iš ožkos kepenų, kaip šablonus. Atvirkštinės transkripcijos reakcija vykdyta 42 °C temperatūroje 60 min., naudojant oligo(dT)i5 kaip praimerj. Po 35 gausinimo ciklų šiose sąlygose: 95 °C - 2 min., -55 °C - 2 min., -72 °C - 1 min.; 2 mM MgCI2, pagausintas DNR fragmentas (155 bazių poros) subklonuotas i plazmidės vektorių pCRII ir trijų skirtingų klonų intarpo seka nustatyta naudojant T7 ir Sp6 sekos nustatymo praimerius. Šio fragmento nukleotidų seka (atitinkanti sekos ID Nr. 1 sritį nuo 215 iki 369 nukleotido) patvirtina VVO 96/02567 aprašytą aminorūgščių seką ir identifikuoja, kad Xaa-33 yra Cys. Nustačius pilną 14 kDa baltymo, aprašyto Ceciliani et al. [ FEBS Lett. (1996) 393, 147-150], aminorūgščių seką, po panašios kaip aukščiau aprašyta procedūros, nustatyta sekos ID Nr. 1 nukleotidų seka nuo 215 iki 511 nukleotido. Trumpai tariant, susintetinti degeneruoti ologonukleotidai (vadinami PG-9). Šis mišinys susideda iš 32.768 oligo-20-merų, atitinkančių aminorūgščių seką nuo Pro-131 iki Val-137. PCR reakcija vykdyta tokiose pačiose kaip anksčiau aprašyta sąlygose, naudojant oligonukleotidų mišinius PG-1 ir PG-9 praimeriais ir kDNR, gautas iš atvirkštinės transkripcijos nuo totalinės RNR, išskirtos iš ožkos kepenų, kaip šablonus. Pagausintas 296 bazių porų DNR fragmentas subklonuotas j plazmidės vektorių pCRII ir intarpo seka nustatyta' naudojant 17 ir Sp6 sekos nustatymo praimerius. Nukleotidų seka link poly(A) galo nustatyta tinkamai modifikuotu greito pagausinimo kDNR 3'-gale metodu (3'-RACE). Šiuo atveju šablonas, naudotas PCR reakcijoje buvo gautas iš atvirkštinės transkripcijos nuo totalinės RNR, išgrynintos iš ožkos kepenų, , praimeriu naudojant su adapteriu sujungtą oligo(dT)i7. PCR praimeriai susideda iš adapterio ir oligo-30-mero (vadinamo
[0010] PG-4), esančio srityje nuo 236 iki 265 nukleotido. PCR reakcijos sąlygos buvo tokios: reakcijos mišinyje, turinčiame 2 mM MgCI2
[0011] ir tik praimerį PG-4, atlikta 10 pagausinimo ciklų po dvi stadijas: 45 s 95 °C temperatūroje , 3 min. -72 °C temperatūroje. Po to, pridėjus antro PCR praimerio (adapterio) , atlikti 35 pagausinimo ciklai tokiose sąlygose: 45 s 95 °C temperatūroje, 1 min. -52 °C temperatūroje, 2 min. -72 °C temperatūroje. Siekiant išskirti individualesnį DNR fragmentą, atlikta iš eilės dar viena PCR reakcija, naudojant praimerį PG-5 , link 3'-galo, apimantį nukleotidus nuo 266 iki 289 sekoje ID Nr. 1. Šis DNR fragmentas (apie 800 bazių porų) taip pat buvo subklonuotas į plazmidės vektorių pCRII, ir seka nustatyta su 17 ir Sp6 sekos nustatymo praimeriais. Jo seka patvirtina 14 kDa baltymo, aprašyto Ceciliani et al. [ FEBS Lett. (1996) 393, 147-150] aminorūgščių seką nuo Lys-56 link C-galo, išskyrus paskutinę aminorūgštį: Val-137 yra pakeistas Leu-137.
[0012] Nukleotidų seka link kDNR 5'-galo nustatyta 5'-RACE metodu. Ši procedūra susideda iš dvigubos grandinės kDNR sintezės nuo RNR poly(A), išekstrahuotos iš ožkos kepenų, šių kDNR ligavimo adapteriu ir pagausinimo PCR reakcijoje, naudojant praimerj, esantį adapterio sekoje ir dar kitą praimerį, esantį kDNR sekoje. Šiuo atskiru atveju buvo naudotas praimeris, apimantis sekos ID Nr. 1 nuo 290 iki 316 nukleotido. Gautas DNR fragmentas, (apie 300 bazių porų) subklonuotas į plazmidės vektorių pCRII, ir seka nustatyta su sekos nustatymo praimeriais T7 ir Sp6.
[0013] Visa kDNR seka galutinai patvirtinta tiesiogiai nustatant dviejų DNR fragmentų, gautų skirtingose PCR reakcijose, seką. Kaip ir anksčiau, DNR šablonas buvo kDNR, gautos iš atvirkštinės transkripcijos nuo totalinės RNR iš ožkos kepenų, praimeriu naudojant oligo (dT) 15, o du gausinimo praimeriai buvo kDNR sekos ID Nr. 1 5'-gale nuo 1 iki 26 nukleotido ir 3'-gale nuo 984 iki 1007 nukleotido. Po 35 pagausinimo ciklų (sąlygos: 45 s 95 °C temperatūroje, 45 s -60 °C temperatūroje, 1 min. 30 s -72 °C temperatūroje, 2 mM MgCI2), 1007 bazių porų DNR fragmento seka nustatyta pagal standartinę metodiką.
[0014]
1. kDNR seka, pateikta ID Nr.1, o ID Nr.1 yra šios apibrėžties dalis, ir jos fragmentai.