[LT] Išradimas skirtas glutamato dehidrogenazės, -acetilheksozaminidazės ir @-aktino genų promotoriams ir jų panaudojimui filamentinių grybų ekspresijos, sekrecijos ir antisensinėse sistemose. Išradimas taip pat skirtas genų promotorių panaudojimui, kurių genai koduoja: (I) Penicillium chrysogenum NADP priklausančią glutamato dehidrogenazę (EC.1.4.1.4), (II) Penicillium chrysogenum -N-acetilheksozaminidazę (EC.3.2.1.52) ir (III) Penicillium chrysogenum ir Acremonium chrysogenum -aktiną, kurie gali būti panaudoti galingų ekspresijos ir sekrecijos vektorių konstrukcijai, naudingų tiek P.chrysogenum, tiek A. chrysogenum bei giminingoms rūšims. Taip pat šie promotoriai gali būti panaudoti genų ekspresijai blokuoti per antisensines konstrukcijas. Reguliuojant aukščiau minėtiems promotoriams, įmanoma valdyti kitų genų ekspresiją filamentiniuose grybuose, taip pat padidinant antibiotikų ir/arba jiems būdingų baltymų gamybą.
[EN] The invention relates to promoters of the genes glutamate dehydrogenase, beta-acetylhexosaminidase and gama-actine and their use in systems of expression, secretion and anti-sens of filamentary fungi. The invention alsorelates to the use of the promoters of the genes with code: (I) glutamate dehydrogenase NADP depending (EC.1.4.1.4) of Penicillium chrysogenum, (II) gama-N-acetylhexosaminidase (EC.3.2.1.52) of Penicillium chrysogenum and (III) gama-actine of Penicillium chrysogenum and Acremonium chrysogenum, which can be used in the construction of potent vectors of expression and secretion useful both for P. chrysogenum and for A. chrysogenum and related species. Said promoters can also be used for blocking the genic expression through anti-sens construction. Under the control of the above mentioned promoters, it is possible to conduct the expression of other genes in filamentary fungi, thereby increasing the production of antibiotics and/or proteins inherent to the same.
[0001] Išradimas skirtas Penicillium chrysogenum gdh ir hex genų bei P. chrysogenum ir Acremonium chrysogenum act geno ekspresijos techninei sričiai. Analizuojant šių genų nukleotidų seką, aptikta promotorių sritis, turinti transliacijos inicijavimo vietą, kuri gali būti panaudota sukurti galingus ekspresijos ir sekrecijos vektorius, naudojamus tiek P. chrysogenum, tiek A. chrysogenum ir jų giminingoms rūšims. Be to, šie promotoriai gali būti panaudoti genų ekspresijos blokavimui antisensinėmis konstrukcijomis. Kitų genų ekspresija filamentiniuose grybuose gali būti vykdoma, reguliuojant aukščiau minėtais promotoriais, gaunant padidintą kiekj būdingų antibiotikų ir/arba baltymų.
[0002] P. chrysogenum ir A. chrysogenum yra filamentiniai grybai, keliantys pramoninį susidomėjimą dėl jų gebos gaminti atitinkamai peniciliną ir cefalosporiną. Pastarojo dešimtmečio metu buvo žymiai išvystyta genetinės manipuliacijos technika, pritaikoma abiejuose mikroorganizmuose.
[0003] P. chrysogenum ir A chrysogenum genetinės manipuliacijos techniką sudaro protoplastų transformavimas vektoriais, kurie turi fleomicino atsparumo geną
[0004] (toliau vadinamas bleR genu) (Kolar, M. et al. (1988), Gene 62, 127-134) kaip selektyvią žymę, o taip pat papildomų -dominančių nepaliestų genų kopijų ekspresija ir tiriamo geno promotoriaus pakeitimas kitu promotoriumi, kuris gali pagerinti jo ekspresiją. Homologinių genų ekspresija grybuose, tokiuose, kaip P. chrysogenum ar A. chrysogenum, gali būti reguliuojama neigiamai, tuo tarpu, kalbant apie heterologinius genus, yra įmanoma, kad jų promotorius nebus efektyviai atpažintas šiais grybais. Siekiant išvengti šių problemų, buvo identifikuoti ir klonuoti genai, kurie yra ekspresuoti esminiai ir kuriuose ši ekspresija neturi neigiamo katabolinio reguliavimo, toliau vadinami stipriais promotoriais. Bendru atveju, manoma, kad aukštos ekspresijos genai turi signalus promotoriaus srityje, kurie palengvina aukštus transkripcijos lygius ir kurie atlieka pagrindinį vaidmenį funkcijose, vykstančiose pirminiame ląstelės
[0005] metabolizme. Šie genai yra: genai, kurie koduoja NADP priklausančią glutamato dehidrogenazę (EC. 1.4.1.4) (toliau vadinamas gdh genu), 0-N-acetilheksozaminidazę (EC.3.2.1.52) (toliau vadinamas hex genu) ir y-aktiną
[0006] kitokių nei tie, kurie naudojami šiame išradime. Tinkamiausi bibliografiniai šaltiniai yra: (I) grybo Neurosporra crassa gdh geno nukleotidų seka (Kinnaird,
[0007] Gen. Genet. 418, 105-111), (II) Candida albicans grybo hex1 geno klonavimas ir ekspresija (Cannon, R.D. etai. (1994), J. Bacteriol. 2640-2647) ir (III) A nidulans grybo act geno charakteristika (Fidel, S. et al. )1988), Gene 70, 283-293). P. chrysogenum heterologinių genų ekspresija, naudojant pcbC ar penDE genų promotorius, buvo aprašyta Cantvvell, C.A. et al. 1992 m. (Proc. R. Soc. London Ser. B 248, 283-289). Be to, A chrysogenum heterologinių genų ekspresija, naudojant p-izopropilmalato dehidrogenazės (Japonijos patentas Nr. 80295/1989) ir gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės genų promotorius (EP A 037622A1/1989) taip pat yra aprašyta.
[0008] Genų ekspresijos inaktyvavimas pramoniniuose kamienuose kartais yra reikalingas, siekiant eliminuoti nepageidaujamus fermentų poveikius. Kadangi dėl daugelio pramoninių kamienų chromosomų pasikartojimo laipsnio ploidiškumo lygio labai dažnai yra sunku blokuoti ekspresiją tiesioginiu genų suskaldymu, tenka naudoti sistemas ekspresijos inaktyvinimui, kurios yra nepriklausomos nuo chromosomų pagrindinio skaičiaus pasikartojimo laipsnio lygio. Sukūrus antisensines konstrukcijas, ekspresuotas stiprių promotorių
[0009] jtakoje, tapo jmanoma nutraukti genų ekspresiją. Tokios rūšies konstrukcijos yra ypatingai naudingos pramoniniuose kamienuose, nes dėl jų chromosomų pagrindinio skaičiaus pasikartojimo laipsnio lygių (Kunkel et al. (1992) Appl. Microbiol. Biotech. 36, 499-502) yra sunku visiškai inaktyvuoti genus. Yra aprašytas antisensinių konstrukcijų naudojimas blokuoti fermentų veiklą mielėse (Atkins, D. etai. (1994), Biol. Chem. H-S 375, 721-729) ir augaluose (Hamada, T.
[0010] (1996), Transgenic research 5, 115-121; John, M.E. (1996) Plant Mol. Biol. 30, 297-306). Hex promotorius pasižymi ypatinga ekstraląstelinio fermento kodavimo sąvybe, kuri leidžia jį panaudoti ekstrai ąstel i nių baltymų ekspresijai.
[0011] Tačiau nėra nuorodų į jokius šaltinius, kuriuose aprašytos arba filamentinių grybų naudojamų šiame išradime genų sekos arba fermentų , kurie sintezuojami ekspresuojant tuos genus, sekos. Taip pat niekur nėra aprašytas grybų genų stipriųjų promotorių panaudojimas genų ekspresijai, sekrecijai ar inaktyvavimui, aprašytas šiame išradime.
[0012] Stipriųjų promotorių naudojimas tam tikrų genų padidintai ekspresijai gali iššaukti penicilino ar cefalosporino gamybos pagerinimą ir taip pat naujų antibiotikų, gautų pakeitimo būdu iš pastarųjų, sintezę.
[0013] Šiame išradime aprašytas naujas P. chrysogenum ir A. chrysogenum kamienų, galinčių ekspresuoti homologinius ar heterologinius genus, kontroliuojamus promotorių, gavimo būdas. Yra aprašytas promotorių, atitinkančių genus, kurie koduoja P. chrysogenum NADP priklausančią glutamato dehidrogenazę (EC.1.4.1.4) - gdh geno, P. chrysogenum p-N-acetilheksoaminidazę (EC.3.2.1.52) - hex geno ir P. chrysogenum bei A. chrysogenum y-aktiną - act geno, apibūdinimas ir po to sekantis panaudojimas. Šių promotorių panaudojimas padidintai ekspresuoti genus, susijusius su penicilino ir/arba cefalosporino biosinteze aukščiau minėtuose kamienuose yra vienas iš šio išradimo tikslų. Šie promotoriai taip pat gali būti panaudoti blokuoti genų ekspresiją antisensinių konstrukcijų pagalba.
[0014] Šis išradimas yra pagrįstas tuo, kad P. chrysogenum ir A. chrysogenum yra nukleino rūgšties donorai. Turint išgrynintą genominę DNR, buvo sukonstruotos abiejų mikroorganizmų DNR sekų bibliotekos, kaip aprašyta 1 ir 4 pavyzdžiuose, ir buvo atliktas jų skryningas: (I) sintetiniais oligonukleotidais, atitinkančiais N. crassa gdh geną, siekiant klonuoti homologinį P. chrysogenum geną, (II) oligonukleotidų deriniais, sintezuotais pagal (3-N-acetilheksoaminidazės fermento amino galo seką, siekiant klonuoti P. chrysogenum hex geną, ir (III) A. nidulans act geno fragmentu, siekiant klonuoti homologinius P. chrysogenum ir A. chrysogenum genus. Klonai, išgryninti jų
[0015] teigiamos hibridizacijos su atitinkamu mėginiu gebos dėka, vėliau buvo analizuojami, bandant aptikti ieškomus genus.
[0016] P. chrysogenum grybo gdh genas buvo identifikuotas 7,2 kb EcoRI fragmente ir dviejuose atitinkamai 2,9 ir 1,5 kb BamY\\ fragmentuose. DNR
[0017] srities, turinčios šj geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.1. Po to buvo nustatyta 2816 nukleotidų seka (SEQ ID No:1), turinti atvirą skaitymo rėmelį
[0018] (ORF) su ryškiai išreikštu pirmenybiniu kodono naudojimo pavyzdžiu, kurio ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 922 pozicijoje ir TAA transliacijos beprasmis kodonas buvo aptiktas 2522 pozicijoje. Taip pat buvo aptikti du 159
[0019] bp ir 56 bp intronai atitinkamai pozicijose tarp 971-1130 ir 1262-1318. Šis ORF koduoja 49837 Da baltymą, turintj izoelektrinj tašką 6,18, kurio 461 aminorūgščių
[0020] seka (SEQ ID No:5) turi 72,4% tapatumą su N. crassa fermento NADP priklausančio glutamato dehidrogenazės fermento aminorūgščių seka. Promotoriaus srityje rastos pirimidinu praturtintos zonos, panašios į tas, kurios
[0021] yra labai ekspresuotuose genuose, o taip pat dvi numanomos TATA sekos (šios sekos aptinkamos tam tikrų grybų promotoriuose nuo 30 iki 50 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą) (Davis, M.A. ir Hynes, M.J. (1991), More Gene manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, California) ir CCAAT seka (kuri aptinkama maždaug 30% eukariotinių genų promotorių nuo 50 iki 200 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą) (Bucher, P. (1990) J. Mol. Biol. 212: 563-
[0022] 578). Šis promotorius buvo panaudotas ekspresuoti P. chrysogenum ir A chrysogenum E. coli geną, kuris koduoja p-galaktozidazę (toliau vadinamas lacZ genu) ir S. hindustanus bleR geną. Tuo tikslu, kaip aprašyta 1 pavyzdyje,
[0023] buvo sukurtos plazmidės pSKGSu ir pALfleo7 (fig.5). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad gdh promotorius (toliau vadinamas Pgdh) gali valdyti heterologinių
[0024] Antisensinių konstrukcijų, ekspresuojamų nuo stiprių promotorių, sukūrimas leidžia nutraukti genų ekspresiją. Šiuo tikslu buvo sukurta plazmidė pALP888 (fig.5), kaip tai aprašyta 1 pavydžio 1.3 skyriuje. Gauti rezultatai patvirtina galimybę visiškai ar dalinai blokuoti nepageidaujamą fermentų veiklą
[0025] P. chrysogenum hex genas buvo identifikuotas 3,2 kb Sacl fragmente ir 3.1 kb Sa/I fragmente. DNR srities, turinčios hex geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.2. Tuomet buvo nustatyta 5240 nukleotidų seka (SEQ ID No:2), patvirtinanti dviejų ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą, vienas iš jų atitiko hex geną. Hex geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 1324 pozicijoje, o TGA terminacijos kodonas - 3112 pozicijoje. Šis ORF neturi intronų ir koduoja 66545 Da baltymą, turintį izoelektrinj tašką 5,34, kurio 596 amino rūgščių seka (SEQ ID No:6) turi 49,0% identiškumą su Candida albicans fermento p-N-acetilheksozaminidazės aminorūgščių seka. Be to, nustatytoji amino rūgščių seka turi polipeptidus, nustatytus chemiškai iš išgryninto fermento 19-40 ir 99-120 pozicijose. Promotoriaus srityje aptiktos dvi pirimidinu praturtintos zonos, numanoma TATA seka ir CAAT seka. Tuomet šis promotorius buvo naudojamas ekspresuoti S. hindustanus bleR geną P. chrysogenum. Šiuo tikslu, kaip aprašyta 2 pavyzdyje, buvo sukurta plazmidė pALP480 (fig.6). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad hex promotorius (toliau vadinamas P hex) gali kontoliuoti heterologinio bleR geno ekspresiją P. chrysogenum grybelyje. Be to, faktas, kad fermentas (3-N-acetilheksozaminidazė yra baltymas, gausiai sekretuotas P. chrysogenum j kultūrinę terpę, leidžia panaudoti hex geną homologinių ar heterologinių baltymų ekspresijai ir sekrecijai P. chrysogenum ar gimininguose grybuose. Ekspresuojami genai gali būti sulieti su promotoriaus sritimi, turinčia hex geno sekrecijos signalo seką tuo pačiu skaitymo rėmeliu, ar dar jie gali būti sulieti su pilnu hex genu.
[0026] P. chrysogenum act genas (toliau vadinamas actPc) buvo identifikuotas 5.2 kb BamH\, 4,9 kb EcoRI ir 5,9 kb Hind\\\ fragmentuose. DNR srities, turinčios actPc geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.3. Turint nustatytą 2994 nukleotidų seką (SEQ ID No:3), buvo patvirtintas ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimas. ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 494 pozicijoje, o TAA beprasmis kodonas - 2250 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus ir koduoja 41760 Da baltymą, turintį izoelektrinj tašką 5,51, kurio 375 aminorūgščių seka (SEQ ID No:7) turi 98,1% identiškumą su A nidulans y-aktino baltymo aminorūgščių seka. Promotoriaus srityje aptiktos dvi pirimidimu praturtintos zonos, numanoma TATA seka ir keturios CAAT sekos. Tuomet šis promotorius buvo naudojamas ekspresuoti S. hindustanus grybo bleR geną P. chrysogenum grybe. Šiuo tikslu, kaip aprašyta 3 pavyzdyje, buvo sukurta plazmidė pALPfleol (fig.6). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad P. chrysogenum act promotorius (toliau vadinamas PactPc) gali valdyti heterologinio bleR geno ekspresiją P. chrysogenum .
[0027] 2,4 ir 1,1 kb Sa/I fragmentuose, 3,9 kb Smal fragmente ir 8,7 kb Hind\\\ fragmente. DNR srities, turinčios actAc geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.4. Nustatyta 3240 nukleotidų seka (SEQ ID No:4) patvirtino ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 787 pozicijoje, o TAA terminacijos kodonas - 2478 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus ir koduoja 41612 Da baltymą,
[0028] turintį izoelektrinį tašką 5,51, kurio 375 amino rūgščiųseka (SEQ ID No:8) turi 98,4% ir 98,1% identiškumą su aminorūgščių sekomis, atitinkančiomis A
[0029] nidulans ir P. chrysogenum grybų y-aktino baltymus. Promotoriaus srityje aptiktos pirimidimu praturtintos zonos ir CAAT seka, tačiau TATA sekos egzistavimas nenustatytas. Tuomet šis promotorius buvo naudojamas ekspresuoti S. hindustanus bleR geną A chrysogenum. Šiuo tikslu, kaip aprašyta 4 pavyzdyje, buvo sukurta plazmidė pALCfleol (fig.6). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad A chrysogenum act promotorius (toliau vadinamas PactAc) gali kontroliuti heterologinio bleR geno ekspresiją A chrysogenum .
[0030] Visais atvejais heterologinio geno ekspresija P. chrysogenum ar A chrysogenum, reguliuojant grybų promotoriui, buvo pasiekta, suliejant šj geną teisingame skaitymo rėmelyje. Nors lacZ ir bleR genai buvo ekspresuoti kaip pavyzdžiai, panašiu būdu būtų jrhanoma ekspresuoti genus, kurie koduoja fermentus, dalyvaujančius penicilino biosintezėje: pcbAB (<x-aminoadipilcisteinilvalino sintetazė), pcbC (izopenicilino N sintetazė), penDE
[0031] (acil-CoA:6-APA aciltransferazė), pcl (fenilacetil-CoA ligazė) ir t.t; ar cefalosporino biosintezėje: pcbAB (a-aminoadipilcisteinilvalino sintetazė), pcbC (izopenicilino N sintetazė), cefD (izopenicilino N izomerazė), cefEF (deacetoksicefalosporino C sintazė/hidroksilazė), cefG (deacetoksicefalosporino
[0032] C acetiltransferazė) ir t.t. Ekspresuojamas genas gali būti gautas įvairiais būdais: išskirtas iš chromosominės DNR, cDNR sintezuota iš mRNR, sintezuotas chemiškai ir t.t. Pagrindiniai teisingo promotoriaus-geno suliejimo procesai yra aprašyti Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, ir Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John VViley & Sons, New York, USA.
[0033] P. chrysogenum ir A. chrysogenum buvo panaudoti kaip šeimininko kamienai, tačiau gali būti panaudotas bet koks giminingas ar išvestas iš jų kamienas. Būdas, naudojamas protoplastų gavimui ir P. chrysogenum transformacijai, pagrjstas Contoral et al. 1987 m., (Biotechnology 5: 494-497) ir Diez et al. 1987 m. (Curr. Genet. 12: 277-282) ir aprašytas 1 pavyzdyje. Protoplastų gavimas ir A. chrysogenum transformacija aprašyti 4 pavyzdyje. Abiem atvejais selektyvia žyme buvo naudojamas antibiotikas fleomicinas, ir plazmidės pALfleo7, pALP480, pALPfleol ar pALCfleol, turinčios bleR geną, ekspresuojamą, atitinkamai reguliuojant, P gdh, P hex, PacfPc ir PactAc. Tačiau būtų galima panaudoti bet kurią žymę, kuri galėtų selektyviai atskirti transformanto kamienus nuo kitų.
[0034] Transformantas gali būti užaugintas kultūrinėje terpėje, turinčioje anglies ir azoto šaltinių, kurie gali būti asimiliuoti. Anglies šaltiniais galėtų būti gliukozė, sacharozė, laktozė, krakmolas, glicerinas, organinės rūgštys, alkoholiai, riebalų rūgštys ir t.t., naudojamos pavieniui ar derinyje. Azoto šaltiniais galėtų būti peptonas, salyklo ekstraktas, mielių ekstraktas, kukurūzų mirkymo skystis, glitimas, karbamidas, amonio druskos, nitratai, NZ-aminai, amonio sulfatas ir t.t., naudojami pavieniui ar derinyje. Neorganinės druskos, kurios gali būti naudojamos kaip kultūrinės terpės komponentai, yra fosfatai (pavyzdžiui, kalio fosfatas), sulfatai (pavyzdžiui, natrio sulfatas), chloridai (pavyzdžiui, magnio chloridas) ir t.t., o geležis, magnis, kalcis, manganas, kobaltas ir t.t. gali būti naudojami kaip jonai. Kultivavimo sąlygos, tokios, kaip inkubacijos temperatūra, kultūrinės terpės pH, aeracija, inkubacijos laikas ir t.t. gali būti pasirinktos ir priderintos prie naudojamų kamienų. Tačiau, kalbant apskritai, fermentacija vykdoma nuo 4 iki 14 dienų anaerobinėmis sąlygomis, esant temperatūrai tarp 20°C ir 30°C, o pH tarp 5 ir 9.
[0035] Apibendrinant, galima pasakyti, kad šis išradimas apima: (I) DNR fragmentus, kurie turi P. chrysogenum gdh, hex ir act genų ir A chrysogenum act geno promotorius, (II) plazmides, turinčias savo sudėtyje aukščiau minėtus promotorius kartu su jų transliacijos inicijavimo vieta, (III) plazmides, kuriose yra jklonuotas homologinis ar heterologinis struktūrinis genas ar antisensinis DNR fragmentas, reguliuojamas šiais promotoriais, (IV) P. chrysogenum ar A chrysogenum kamienai, turintys šias plazmides, (V) transformantų kamienus, galinčius ekspresuoti plazmidėje esantj struktūrinj geną ar antisensinę DNR, reguliuojamą promotoriumi, ir (VI) transformantų kamienus, galinčius išskirti homologinius ar heterologinius ekstraląstelinius baltymus, reguliuojamus P hex.
[0036] Sekantys pavyzdžiai aprašo išradimą išsamiau, neapribojant jo apimties.
[0037] Siekiant klonuoti P. chrysogenum grybo gdh geną, fago vektoriuje XGEM12, naudojant nustatytas procedūras, buvo sukurta DNR sekų biblioteka (Sambrook, J. et ai (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Visa grybo
[0038] būdu) buvo dalinai surestriktuota Sau3A\, ir maždaug 20 kb fragmentai buvo išgryninti sacharozės gradiente (10-40%). Šie fragmentai buvo suliguoti su vektoriumi, kuris buvo prieš tai suskaidytas su BamH\ ir išgrynintas, ir tuomet ligavimo mišinys buvo supokuota's in vitro pagal gamintojo instrukcijas, naudojant Gigapack II Gold (Stratagene) sistemą. Supokavimo reakcijos mišinys iš naujo suspenduotas 500 |il SM, buvo naudojamas infekuoti E. coli LE392,
[0039] siekiant titruoti esančių fagų skaičių, ir E. coli NM539 , siekiant nustatyti rekombinantinių fagų procentinį kiekj. E. coli NM539 yra fago P2 lizogeninis štamas ir sukelia tik lizę, kuomet fagas, kuris infekuoja jį, neturi neesminės centrinės srities. Nustatyta, kad fago titras yra E. coli LE392 yra 132 ų
[0040] (iš viso - 56000 ;r.gT. - dsislių). Tai reiškė, kad maždaug 85% fagų nešė egzogeninį DNR įtarpą. Būtinų sudaryti užbaigtą DNR sekų biblioteką rekombinantinių fagų skaičius buvo apskaičiuotas pagal lygtj: N=ln(1-p)/ln(1-f), kur "p" yra pageidaujama tikimybė, "f" - atrenkamo organizmo, esančio rekombinante, genomo proporcija ir "N" yra reikalingų rekombinanų skaičius. Jvertinant tai, kad P. chrysogenum genomas yra maždaug 30000 kb (Fierro et al.
[0041] (1993), Mol. Gen. Genet. 241: 573-578) ir kad supokuotų jtarpų vidurkis yra 18 kb (nepaisant to fakto, kad buvo parinkti maždaug 20 kb dydžiai), buvo gauta P. chrysogenum DNR sekų biblioteka su 99,999% tikimybe gauti rekombinantinius fagus. Po to buvo atlikta eilė teorinių patikrinimų, E. coli NM539 buvo infekuotos, ir visa DNR sekų biblioteka buvo išsėta ant penkių 150 mm skersmens Petri lėkštelių (maždaug 11300 faginių dalelių/Petri lėkštelėje),-surinkta j 50 ml SM, plius 2,5 ml chloroformo ir laikoma 4°C temperatūroje. Tokiu būdu buvo gautas pakankamas ir tipinis paruoštų išsėti bet kuriuo metu rekombinantinių fagų tūris (5300 faginių dalelių/Įil).
[0042] Apie 60000 faginių dalelių buvo paskleista ant trijų 150 mm skersmens Petri lėkštelių ir tuomet perkelta ant nitroceliuliozės filtrų (BA85, 0.45 n.m, Schleicher & Schuell). Šie filtrai buvo hibridizuoti, naudojant standartines metodikas (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA), su sintetiniais oligonukleotidais, atitinkančiais N. crassa gdh geną. Antrojo ir trečiojo hibridizavimo ciklų metu buvo išvalyta iš viso 10 teigiamų klonų, ir jų DNR buvo veikiama eile restriktazių ir analizuota Southern blot būdu. Šiuo būdu buvo identifikuotas gdh genas 7,2 kb FcoRI fragmente ir atitinkamai dviejuose 2,9 ir 1,5 kb BamHI fragmentuose. Po to, kai buvo atliktas atitinkamas subklonavimas pBluescript I KS(+) (Stratagene) ir pUC13 plazmidėse, buvo sukurtos plazmidės pALP784 ir pALP785, kurios turi abi 2,9 kb Sau3M- Xba\ fragmento su gdh genu skirtingas orientacijas. DNR srities, turinčios šj geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.1.
[0043] Siekiant nustatyti gdh geno nukleotidų seką, iš plazmidžių pALP784 ir pALP785 "Erase a base" būdu (Promega) buvo sukonstruota serija klonų ir sekvenuoti didezoksinukleotidų metodu, naudojant "Sequenase" bandymų
[0044] rinkinj (USB); abiem atvejais tai buvo atlikta pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 2816 nukleotidų seka (SEQ ID No:1) buvo analizuota pagal Geneplot programą
[0045] (DNRSTAR), patvirtinant ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 922 pozicijoje, ir TAA beprasmis kodonas - 2522 pozicijoje. Taip pat buvo aptikti du 159 bp ir 56 bp intronai atitinkamai pozicijose tarp 971-1130 ir 1262-1318. Šis ORF koduoja 49837 Da baltymą, turintj izoelektrinj tašką 6,18,
[0046] kurio 461 aminorūgšties seka (SEQ ID No:5) turi 72,4% identiškumą su N. crassa fermento NADP priklausančios glutamato dehidrogenazės aminorūgščių seka.
[0047] nors esančioji tarp 766-796 pozicijų yra labiausiai ekstensyvi. Šios zonos aptinkamos labai ekspresuotuose genuose ir yra išdėstytos betarpiškai prieš transkripcijos inicijavimo vietą. Be to, čia yra dvi numanomos TATA sekos (konservatyvi seka grybuose yra TATAAA) pozicijose tarp 752 (TATATAAAT) ir 852 (TATAATTT). Šios TATA sekos aptinkamos grybuose nuo 30 iki 50 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą, todėl labai tikėtina, kad autentiška TATA seka yra išdėstytoji 752 pozicijoje, t.y. 42 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą. Maždaug 30% žinomų eukariotinių genų promotoriaus srityje turi CCAAT seką, išdėstytą tarp 50 ir 200 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą. CCAAT seka yra gdh geno promotoriaus srities 691 pozicijoje, t.y. apie 105 bp prieš tikėtiną transkripcijos inicijavimo vietą.
[0048] 1.2. P. chrysogenum ir A. chrysogenum kontrolinių genų ekspresija gdh promotoriumi.
[0049] P. chrysogenum ir A. chrysogenum transformacijos ir transformantų selekcijos procesas buvo atliktas, kaip aprašyta žemiau, priklausomai nuo jų atsparumo antibiotikui fleomicinui. Šiam tikslui buvo būtina sukonstruoti plazmidę pALfleo7, kurios dydis 5,4 kb ir kuri turi S. hindustanus bleR geną, ekspresuojamą nuo P gdh, kuris yra kaip žymė grybams, chloramfenikolo atsparumo geną kaip žymę E. coli ir plazmidės pBC KS (+) polilinkerį
[0050] Nežymiai modifikuota protoplastų gamybos ir P. chrysogenum transformacijos procedūra aprašyta Cantoral et al. 1987 m. (Biotechnology 5: 494-497) ir Diez et al. 1987 m. (Curr. Genet. 12: 277-282). Pirmiausia, P. chrysogenum buvo užaugintas PM apibrėžtoje terpėje (Anne, J., (1997), Agricultura 25), pridėjus 10% mielių ekstrakto ir inkubuojant 18-21 vai. 25°C temperatūroje, ir micelis buvo regeneruotas, perfiltruojant per neilono filtrą ir perplaunant 3-5 tūriais 0,9% NaCI. Išdžiovinus tarp popieriaus filtro, jis buvo iš naujo suspenduotas (100mg/ml) protoplastų buferyje. Kuomet micelio suspensija tapo homogeninė, j protoplastų buferį buvo pridėta Caylasa tirpalo (Cayla) (tūrinis santykis - 4 mg/ml) ir inkubuota 3 vai. 25°C temperatūroje, maišant 100 aps/min greičiu. Protoplastų pasirodymas buvo stebimas mikroskopu. Kuomet daugelis iš jų išsilaisvino, jie buvo atskirti nuo micelio, perfiltruojant per neilono filtrą, kurio porų dydis 30 nm. Protoplastų suspensija buvo perplauta tris kartus 0,7 M KCI tirpalu, centrifuguojant 400xg tris minutes tarp perplovimų. Nusėdę protoplastai buvo iš naujo suspenduoti 10 ml KCM tirpalo ir, jvertinus jų koncentraciją Thoma kameroje, buvo praskiesta KMC iki 1-5x108 protoplastų/ml. Po to 100 nl šio tirpalo buvo kruopščiai sumaišyta su 1-10 ng DNR plius 10 (J PCM, ir mišinys buvo inkubuotas atšaldytoje vandens vonioje 20 min. Vėliau buvo pridėta 500 ml PCM, ir mišinys buvo inkubuojamas kambario temperatūroje 20 min, po to buvo pridėta 600 jj. I KCM. Transformantai buvo atrinkti pagal gebą augti terpėje su 30.ng/ml fleomicino, suteiktą fleomicino atsparumo geno, esančio pALfleo7, pALP480 ir pALPfleol plazmidėse. Šiuo tikslu 200 įiI transformacijos reakcijos mišinio buvo sumaišyta su 5 ml Czapek terpės, pridedant sorbitolio (1 M) ir fleomicino (30 ng/ml), ir tuomet tai buvo išsėta ant Petri lėkštelių su 5 ml tos pačios terpės. Lėkštelės buvo inkubuotos 25°C temperatūroje iki pasirodant transformantams (4-8 dienas).
[0051] Protoplastų gamybos ir A chrysogenum transformacijos procedūra aprašyta Gutierrez et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 56-64. Pirmiausia, A chrysogenum kamienas buvo auginamas MMC apibrėžtoje terpėje 20-24 vai. 28°C temperatūroje, ir micelis buvo regeneruotas, perfiltruojant per neilono filtrą ir perplaunant 3-5 tūriais 0,9% NaCI. Išdžiovinus jj tarp filtro popieriaus, jis buvo iš naujo suspenduotas (50 mg/ml) protoplastų buferyje. Kuomet micelio suspensija tapo homogeninė, į ją buvo pridėta DTT iki 10 mM galutinės koncentracijos ir inkubuota 1 vai. 28°C temperatūroje, maišant 150 aps/min greičiu. Po to ji buvo centrifuguota 12000xg 15 min. ir nuosėdos buvo iš naujo suspenduotos 30 ml protoplastų buferio. Vėliau j protoplastų buferį buvo pridėta Caylasa tirpalo (Cayla) (tūrinis santykis - 4 mg/ml) ir jis buvo inkubuotas 3 vai. 25°C temperatūroje, maišant 100 aps/min greičiu. Protoplastų pasirodymas buvo stebimas mikroskopu. Kuomet daugelis iš jų išlaisvino, jie buvo atskirti nuo micelio, perfiltruojant per neilono filtrą, kurio porų dydis 25 Įim. Protoplastų suspensija buvo perplauta tris kartus 0,7 M KCI tirpalu, centrifuguojant 1000xg tris minutes tarp perplovimų. Nusėdę protoplastai buvo iš naujo suspenduoti 10 ml NCM buferio ir jvertinus jų koncentraciją Thoma kameroje, buvo praskiesta KMC iki 1-5x108 protoplastų/ml. Po to 100 \i\ šio tirpalo buvo kruopščiai sumaišyta su 1-10 ng DNR ir mišinys buvo laikomas atšaldytoje vandens vonioje 20 min. Vėliau buvo pridėta 1 ml CCM, ir mišinys buvo inkubuotas kambario temperatūroje 20 min. Mišinys buvo centrifuguotas 1,000xg 5 minutes, ir nuosėdos buvo iš naujo suspenduotos 800 ?! NCM buferio. Transformantai buvo atrinkti pagal gebą augti terpėje su 10 ng/ml fleomicino, suteiktą fleomicino atsparumo geno, esančio pALfleo7 ir pALCfleol plazmidėse. Šiuo tikslu 200 ui transformacijos reakcijos mišinio buvo sumaišyta su 5 ml TSA terpės, pridedant sacharozės (0,3 M) ir fleomicino (10 ng/ml), ir tuomet tai buvo išsėta ant Petri lėkštelių su 5 ml tos pačios terpės. Lėkštelės buvo inkubuotos 28°C temperatūroje iki pasirodant transformantams (5-8 dienas),
[0052] Gauti transformantai buvo analizuoti, siekiant nustatyti (I) DNR, atitinkančios transformacijoje naudotą plazmidę, buvimą, (II) transkripto, atitinkančio kontrolinį geną, egzistavimą ir (III) fermentinį aktyvumą, gautą ekspresuojant geną. Visa DNR buvo gauta pagal sąlygas, aprašytas Barredo et al. 1994 m. (Ispanijos patentas P9400931), ir tuomet ji buvo analizuota Southern blot būdu, aprašytu Sambrook et al. 1989 m. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Visa totalinė RNR buvo išgryninta aprašytuoju Ausubel et al. 1987 m. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA) būdu. Gautoji RNR buvo laikoma išsodinta etanolyje -20°C temperatūroje. Norint ją panaudoti, ji buvo regeneruota, centrifuguojant 10000xg 4°C temperatūroje 20 min. RNR molekulių atskyrimas pagal jų molekulių dydj buvo atliktas agarozės-formaldehido elektroforeze. Po to DNR buvo perkelta ant nitroceliuliozės filtro ir hibridizuota su pageidaujamu mėginiu, visa tai atliekant Sambrook et al. 1989 m.
[0053] (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) aprašytuoju būdu. Hibridizavimo juostų atsiradimas parodė transkriptų egzistavimą ir, tuo būdu, gebą ekspresuoti bakterinį geną grybe-šeimininke: P. chrysogenum ar A. chrysogenum. Fermentinis p-galaktozidazės aktyvumas transformantuose buvo įvertintas Sambrook et al. 1989 m. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) aprašytuoju būdu. Fleomicino atsparumo geno ekspresija buvo įvertinta pagal atsparumo lygį, suteiktą P. chrysogenum ar A. chrysogenum Czapek kietojoje terpėje po 7 dienų inkubavimo 25°C temperatūroje.
[0054] 1.2.1. E. coli lacZ geno ekspresija P. chrysogenum ir E. coli, reguliuojant Pgdh.
[0055] E. coli lacZ genas buvo sulietas transliaciškai su Pgdh, siekiant ekspresuoti jį P. chrysogenum. Tuo tikslu lacZ genas buvo subklonuotas į pML1 plazmidės (Carramolino etai. 1989, Gene 77: 31-38) EcoRI irSa/l kirpimo vietas sukuriant, plazmidę pMLac. Po to Pgdh buvo įklonuotas tarp pMLac EcoRI ir Smal kirpimo vietų, sukuriant plazmidę pSKG (fig.5). Galiausiai, sulfonamido atsparumo genas (Carramolino et al. 1989, Gene 77: 31-38) buvo įklonuotas j plazmidės ties pSKG EcoRI kirpimo vieta, sukuriant plazmidę pSKGSu (fig.5). P. chrysogenum transformantuose su plazmidę pSKGSu, atrinktuose pagal jų sulfonamidinį atsparumą, buvo atliktos analizės plazmidės buvimui nustatyti Southern blot būdu ir transkripto, atitinkančio lacZ geną, egzistavimui nustatyti - Northern blot būdu. Tuomet buvo išmatuotas fermentinis p-galaktozidazės aktyvumas transformantuose, kurie buvo pozityvūs dviejose ankstesnėse analizėse. Transformantai efektyviai ekspresavo E. coli lacZ geną, ir buvo pastebėta, kad (3-galaktozidazės aktyvumo lygiai buvo aukštesni tuose transformantuose, kurie turėjo plazmidės, integruotos į jų genomą, kopiją, nei pavieniuose transformantuose, kurie ekspresavo lacZ geną, reguliuojamą triptofano C geno promotoriumi ( trpC).
[0056] Plazmidė pSKG buvo įterpta į E. coli DH5a (A lacZ), siekiant išsiaiškinti ar P. chrysogenum grybo P gdh taip pat galėjo reguliuoti lacZ geno ekspresiją E. coli. Gautieji transformantai pasižymėjo geba generuoti mėlynąsias kolonijas po dešimties dienų inkubavimo 25°C temperatūroje LB terpėje, j kurią buvo pridėta izopropil-p-galaktozidazės (IPTG) ir 5-brom-4-chlor-3-indolil-p-D-galaktozidazės (X-gal). Šis rezultatas patvirtino, kad P gdh- lacZ darinys ekspresuoja fS-galaktozidazės fermentinį aktyvumą E. coli, nors ne taip efektyviai kaip endogeninis E. coli lacZ genas.
[0057] 1.2.2. S. hindustanus bleR geno ekspresija P. chrisogenum ir A chrisogenum, reguliuojant P gdh.
[0058] BlęR genas be jo promotoriaus srities buvo gautas iš plazmidės pUT737 (Millaney et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) kaip 1100 bp Nco\- Apa\ fragmentas. Po to šis fragmentas buvo subklonuotas į plazmidę pUT713 (prieš tai ją paveikus su Nco\- Apa\) gaunant plazmidę pALfleo5. P gdh buvo iškirptas iš pALP25 kaip 726 bp EcoRI-SamHI fragmentas, kuris po to buvo subklonuotas į plazmidę pALfleo5 (prieš tai ją paveikus su EcoRI-BamHI), siekiant sukurti pALfleo6. Šios pastarosios plazmidės dydis yra 4,2 kb, ji turi bleR geną, ekspresuojamą, reguliuojant P gdh, ir ampicilino atsparumo geną kaip žymę E. coli. Siekiant pakeisti pastarąją žymę chloramfenikolio atsparumo genu, 1900 bp EcoRI-Nofl fragmentas, turintis Pgdh, bleR ir trpC geno terminatorių (T trpC), buvo išskirtas iš pALfleo6 ir su plazmidė pBC KS (+) (Stratagene), paveikta su EcoH\- Not\. Taip buvo sukurta plazmidė pALfleo7 (fig.5), kurios dydis yra 5,4 kb ir kuri turi S. hindustanus bleR geną, reguliuojamą Pgdh, kaip grybų selekcijos žymę, chloramfenikolo atsparumo geną kaip E. coli selekcijos žymę ir plazmidės pBC KS (+) polilinkerį. Nukleotidų sekos nustatymas suliejimo srityje tarp P gdh ir bleR patvirtino pastarojo geno išsidėstymą teisingame skaitymo rėmelyje.
[0059] P. chrysogenum ir A. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmidė pALfleo7, transformantai buvo atrinkti pagal jų atsparumą atitinkamai 30 M.g/ml ir 10 |ig/ml koncentracijos fleomicinui. Po to maksimalus transformantų fleomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje. Kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti didesnėje nei 100 |ig/ml fleomicino aplinkoje. Transformantai, parinkti pagal jų atsparumą fleomicinui, buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir transcripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą - Nothern blot būdu; abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino galimybę ekspresuoti heterologinius genus P. chrysogenum ir A. chrysogenum grybuose, reguliuojant P gdh.
[0060] Plazmidė pALfleo7 buvo Įterpta į E. coli, siekiant sužinoti ar P. chrysogenum grybo Pgdh taip pat gali reguliuoti bleR geno ekspresiją E. coli. Gautieji transformantai pasižymėjo geba augti LB, turinčioje 0,2 fig/ml fleomicino, tuo tarpu kai maksimali fleomicino slopinimo koncentracijai E. coli yra mažiau kaip 0,025 Įig/ml. Šis rezultatas patvirtino, kad P gdh buvo ekspresuotas E. coli, nors ne taip efektyviai kaip P. chrysogenum. Transformantas E. coli DH5a su plazmide pALfleo7 buvo patalpintas j Spanish Collection of Type Cultures (CECT) su registracijos numeriu CECT4849. Kitos plazmidės, tokios, kaip pALP784 ir pALP785, gali būti gautos iš deponuotos plazmidės paprasčiausiai pasirenkant 2,9 kb Sau3AI-Xbal fragmentą, hibridizuojant su gdh geno promotoriumi, esančiu pALfleo7 sudėtyje, ir subklonuojant jj atitinkamai pBluescript I KS (+) ar pUC13.
[0061] 1.3. Antisensinė ekspresija P. chrysogenum ir A. chrysogenum reguliuojama gdh promotoriumi.
[0062] Genų ekspresijos inaktyvinimas pramoniniuose kamienuose kartais yra reikalingas, siekiant eliminuoti nepageidaujamus fermentų poveikius. Kadangi dėl daugelio pramoninių kamienų chromosomų pasikartojimo laipsnio ploidiškumo lygio labai dažnai yra sunku blokuoti ekspresiją tiesioginiu genų suskaldymu ir tenka naudoti sistemas ekspresijos inaktyvinimui, kurios yra nepriklausomos nuo chromosomų pasikartojimo laipsnio lygio. Sukūrus antisensines konstrukcijas, ekspresuotas reguliuojant stipriems promotoriams, tapo jmanoma nutraukti genų ekspresiją.
[0063] Žemiau aprašytas Pgdh panaudojimo inaktyvuoti ekspresiją geno, kuris koduoja P. chrysogenum fenilacetato-2-hidroksilazės ( pahA), ekspresiją
[0064] pavyzdys. Pirmiausia, buvo sukurta plazmidė pALP, turinti P gdh ir T trpC, sulietus per vieną BamH\ kirpimo vietą. Plazmidė pALP873 buvo paveikta su BamHI, jos galai buvo užpildyti DNR polimerazės I Klenovv fragmentu, ir ji buvo suliguota su 1053 bp pahA geno cDNR fragmentu, gautu iš plazmidės pALP555 veikiant ją EcoRV. Gautoji plazmidė, pavadinta pALP874, buvo atrinkta, nes ji turėjo antisensinj pahA geno fragmentą, giminingą Pgdh. Iš ,šios plazmidės buvo išskirtas 2,5 kb EcoRI-X£>al fragmentas, turintis antisensinę kasetę, užpildytą veikiant Klenovv fragmentu ir subklonuotą į plazmidės pALfleo7 fcoRV kirpimo vietą, sukuriant plazmidę pALP888. Pastaroji plazmidė pasižymi tuo, kad jos dydis yra 7,9 kb ir ji turi (I) pahA geno, reguliuojamo P gdhl, antisensinę kasetę, (II) bleR geną kaip selekcijos žymę grybuose, (III) chloramfenikolo atsparumo geną kaip žymę E. coli, ir (IV) plazmidės pBC KS (+) polilinkerj.
[0065] Buvo vykdoma P. chrysogenum transformacija plazmidė pALP888, ir transformantai atrenkami pagal jų atsparumą 30 i^g/ml koncentracijos fleomicinui. Maždaug 20% atrinktų transformantų pasižymėjo mažesne fenilacto rūgšties oksidavimo geba, kai kurie iš jų neturėjo šio aktyvumo aptinkamų lygių. Šie transformantai buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir antisensinio transkripto, atitinkančio pahA geną, egzistavimą - Nothern blot būdu, naudojant oligonukleoditą, atitinkantį koduojančią grandinę, kaip mėginj. Abiem atvejais gauti teigiami rezultatai, patvirtinantys galimybę visiškai ar dalinai blokuoti nepageidaujamą fermentų aktyvumą P. chrysogenum, naudojant antisensines konstrukcijas. Šie rezultatai gali būti ekstrapoliuoti pritaikyti giminingiems filamentiniams grybams ir bet kokiam fermentų aktyvumui, naudojant bet kurj promotorių, aprašytą šiame išradime (P gdh, P hex, P actPc ir P actAc), ar bet kurj kitą turimą promotorių.
[0066] P. chrysogenum - e, gautame pramoninės fermentacijos metu gaminant peniciliną G, buvo aptiktas pagrindinis baltymas, kuris po išgryninimo ir apibūdinimo pasirodė esąs fermentas 3-N-acetilheksozaminidazė. Išgryninto baltymo amino galo aminorūgščių seka buvo nustatyta Edman skaidymo būdu, ir gautos dvi skirtingos sekos:
[0067] Pagal šias sekas ir jvertinant kodono naudojimo kryptį, kuri egzistuoja keliuose P. chrysogenum genuose, buvo suprojektuotos sekančios sintetinių oligonukleotidų kombinacijos:
[0068] P. chrysogenum grybo hex genas buvo klonuotas, naudojant DNR sekų biblioteką ir būdus, aprašytus 1 pavyzdyje. Buvo išgryninta iš viso 11 teigiamų klonų, jų DNR buvo paveikta keliomis restriktazėmis ir analizuota Southern blot būdu. Šiuo būdu hex genas buvo identifikuotas 3,2 kb Sacl ir 2,1 kb Sa/I fragmentuose. Sa/I fragmento subklonavimas pBC KS (+) plazmidėje abiejomis orientacijomis davė plazmides pALP295 ir pALP303. DNR srities, turinčios hex geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.2.
[0069] Siekiant nustatyti hex geno nukleotidų seką, buvo panaudotos aukščiau minėtos plazmidės pALP295 ir pALP303, o taip pat pALP319 ir pALP461 (abi 2,8 kb BamHl fragmento orientacijos), pALP388 ir pALP389 (abi 2,4 kb Sa/I fragmento orientacijos) bei pALP377 ir pALP378 (abi 1,2 kb Pst\ fragmento orientacijos) (fig.2). Iš šių plazmidžių "Erase a base" (Promega) būdu buvo sukonstruoti keli klonai ir sekvenuoti didezoksinukleotidų būdu, naudojant "Sequenase" bandymų rinkinį (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 5240 nukleotidų seka (SEQ ID No:2) buvo analizuota Geneplot programa (DNRSTAR), patvirtinant dviejų ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. Hex geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 1324 pozicijoje, o TGA beprasmis kodonas - 3112 pozicijoje. Šis ORF neturi intronų ir koduoja 66545 Da baltymą, turintį izoelektrinį tašką 5,34) kurio 596 aminorūgščių seka (SEQ ID No:6) turi 49,0% identiškumą su Candida albicans fermento p-N-acetilheksozaminidazės aminorūgščių seka. Be to, 19-40 ir 99-120 pozicijose nustatyta aminorūgščių
[0070] seka turi aminorūgščių sekas, nustatytas chemiškai iš išgryninto fermento. Proteazės atpažinimo vieta (Lys-Arg) atsiranda pozicijose, esančiose betarpiškai
[0071] Promotoriaus srityje tarp 1106-1128 ir 1182-1200 pozicijų aptinkamos dvi pirimidinu praturtintos zonos, numanoma TATA seka - 1258 (ATAAATA) pozicijoje ir CAAT seka - 1163 pozicijoje. 2. 2. S. hindustanus bleR geno ekspresija P. chrysogenum, reguliuojama P hex. (I) P. chrysogenum transformacijos ir transformantų atrinkimo, (II) DNR analizės, (III) RNR analizės ir (IV) fermentų matavimų procesai buvo atlikti, kaip aprašyta 1 pavyzdžio 1.2 skyriuje.
[0072] Siekiant ekspresuoti bleR geną, reguliuojamą Phex, pirmiausia buvo sukonstruota Nco\ kirpimo vieta prieš ATG kodoną, kuris koduoja hex geno inicijatorių metioniną. Tai buvo atlikta PRC dėka, naudojant sekančius oligonukleotidus kaip pradmenis:
[0073] PRC dėka gautasis DNR fragmentas buvo subklonuotas abiejose
[0074] orientacijose plazmidės pBC KS (+) (Stratagene) Sma\ kirpimo vietoje, sukuriant pALP427 ir pALP428. Abiejų plazmidžių intarpai buvo sekvenuoti, naudojant bandymų rinkinius "Erase a base" (Promega) ir "Sequenase" (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Tokiu būdu buvo parodyta, kad gautasis Phex neturėjo mutacijų ir turėjo Nčo\ kirpimo vietą prieš ATG, kuris koduoja baltymo iniciatorių metioniną.
[0075] Plazmidė pALP427 buvo pasirinkta bleR geno subklonavimui atlikti. bleR genas be promotoriaus srities buvo gautas iš plazmidės pUT737 (Mullaney et ai
[0076] (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) kaip 1100 bp Nco\- Apa\ fragmentas. Po to šis fragmentas buvo subklonuotas plazmidėje pALP427 (turinčioje Phex), prieš tai sukarpytoje su Nco\- Apa\, gaunant plazmidę pALP480 (fig.6). Šios pastarosios plazmidės dydis yra 5,4 kb, ji turėjo bleR geną, ekspresuojamą, reguliuojant Phex, trpC geno terminatorių už bleR geno, chloramfenikolio atsparumo geną kaip žymę E. coli ir plazmidės pBC KS (+) polilinkerį. Nukleotidų sekos nustatymas suliejimo srityje tarp P hex ir bleR patvirtino pastarojo geno išsidėstymą teisingame skaitymo rėmelyje. P. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmide pALP480, atrenkant transformantus pagal jų atsparumą 30 ng/ml koncentracijos fleomicinui. Po to maksimalus transformantų fleomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje, kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti, esant didesnei nei 100 ng/ml fleomicino koncentracijai. Transformantai, atrinkti pagal jų fleomicino atsparumą, buvo analizuoti Southern blot būdu, siekiant nustatyti plazmidės buvimą, ir Nothern blot būdu - siekiant nustatyti transkripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą; abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino heterologinių genų ekspresavimo P. chrysogenum galimybę, reguliuojant Phex. Transformantas E. coli DH5a su plazmide pALP480 buvo deponuotas Spanish Collection of Type Cultures (CECT) su registracijos numeriu CECT4852. Plazmidės pALP295, pALP319, pALP377 ir pALP388 gali būti gautos iš deponuotos plazmidės tiesiog parenkant atitinkamai 2,1 kb SalI, 2,8 kb BamH\, 1,2 kb Pst\ ir 2,4 kb Sa/I DNR fragmentus, hibridizuojant su hex geno, esančio plazmidėje pALP480, promotoriumi ir po to subklonuojant juos pBluescript I KS (+). 2. 3. P. chrysogenum ekstraląstelinė baltymų gamyba, naudojant hex geną. Fermentas (B-N-acetilheksozaminidazė yra baltymas, gausiai sekretuojamas P. chrysogenum j kultūrinę terpę pramoniniuose fermentatoriuose penicilino G gamybos metu. Šio fermento geba būti sekretuotam leidžia panaudoti hex geną homologinių ar heterologinių baltymų ekspresijai ir sekrecijai P. chrysogenum ar gimininguose filamentiniuose grybuose. Fermentas turi sekrecijos signalo seką, sudarytą iš sekančių aminorūgščių: Met-Lys-Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu-Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ser-Ala (SEQ ID No:6 aminorūgštys nuo 1 iki 18). Paprastai, signaliniai peptidai turi tris konservatyvius struktūrinius domenus (Takizavva, N. et al. (1994)
[0077] and Imanaka, T. (eds), Marcei Dekker, Inc. New York): (I) teigiamai jkrautą
[0078] amino galo sritį, vadinamą "n", kuri paprastai turi nuo 1 iki 5 liekanų ir yra reikalinga efektyviam baltymo pernešimui per membraną (Met-Lys), (II) hidrofobinę sritj, vadinamą "h", sudarytą iš 7-15 liekanų (Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu) ir (III) polinę sritj karboksilo gale, vadinamą "c", sudarytą iš 3-7
[0079] liekanų (Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala). Ląstelės viduje susintetintas prebaltymas subręsta, atskylant dviems bazinėms liekanoms (Lys-Arg, SEQ ID
[0080] hex geną: (I) promotoriaus srities, turinčios sekrecijos signalo seką, suliejimas su ekspresuojamo geno kodavimo sritimi skaitymo rėmelyje, ir (II) pilno hex geno suliejimas su ekspresuojamo geno kodavimo sritimi skaitymo rėmelyje. Naudojant standartinius molekulinės biologijos metodus (Sambrook, J. et al.
[0081] (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Colg Spring Harbor, New York, USA; Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John VViley & Sons, New York, USA), bet kurisšios srities specialistas sugebėtų panaudoti promotorių, turintį hex geno ar kito užbaigto geno sekrecijos seką, baltymų ekspresijai ir sekrecijai P. chrysogenus ar gimininguose filamentiniuose grybuose.
[0082] P. chrysogenum act genas buvo klonuotas, naudojant DNR sekų biblioteką ir metodus, aprašytus 1 pavyzdyje. Šiuo atveju hibridizacija buvo atlikta su 888 bp Nco\- Cla\ fragmentu, kurio kilmės šaltinis yra A nidulans grybo act genas (Fidel et al. (1988), Gene 70: 283-293). Iš viso buvo išgryninta 10 teigiamų klonų, jų DNR po to buvo suskaidyta keliomis restriktazėmis ir analizuota Southern blot būdu. Tokiu būdu 5,2 kb BamH\, 4,9 kb EcoRI ir 5,9 kb Hind\\\ fragmentuose buvo identifikuotas act genas. Hind\\\ fragmentas buvo subklonuotas abiejose orientacijose plazmidėje pBluescript I KS (+)
[0083] (Stratagene), sukuriant plazmides pALP298 ir pALP299. fcoRI fragmento
[0084] subklonavimas abiejose orientacijose plazmidėje pBluescript I KS (+)
[0085] (Stratagene) sukuria plazmides pALP315 ir pALP316. DNR srities, turinčios act geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.3.
[0086] Siekiant nustatyti act geno nukleotidų seką, buvo panaudotos aukščiau minėtos plazmidės pALP315 ir pALP316. Iš šių plazmidžių buvo sukonstruoti keli klonai "Erase a base" (Promega) būdu ir tuomet sekvenuoti dideoksinukleotidų būdu, naudojant "Sequenase" bandymų rinkinį (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 2994 nukleotidų seka (SEQ ID No:3) buvo analizuota pagal Geneplot programą (DNRSTAR), patvirtinant ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono panaudojimo pavyzdžiu egzistavimą. Act geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 494 pozicijoje, o TAA beprasmis kodonas - 2250 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus 501-616, 649-845, 905-1046, 1078-1180 ir 1953-2021 pozicijose ir koduoja 41760 Da baltymą, turintj izoelektrinį tašką 5,51, kurio 375 aminorūgščių seka (SEQ ID No:7) turi 98,1% identiškumą su A. nidulans y-aktino baltymo aminorūgščių seka. Promotoriaus srityje tarp 356-404 ir 418-469 pozicijų aptiktos dvi ekstensyvios pirimidinu praturtintos zonos, 259 pozicijoje (TATAAAAAT) numanoma TATA seka ir keturios CAAT sekos 174, 217, 230 ir 337 pozicijose.
[0087] Siekiant ekspresuoti bleR geną, reguliuojamą PactPC, pirmiausia, prieš ATG kodono, kuris koduoja hex geno inicijatorių metioniną, buvo sukonstruota Nco\ kirpimo vieta. Tai buvo atlikta PCR pagalba, naudojant sekančius oligonukleotidus kaip pradmenis:
[0088] PRC pagalba gautasis DNR fragmentas buvo subklonuotas plazmidės pBC KS (+) (Stratagene) Smal kirpimo vietoje abiejose orientacijose, sukuriant pALPacfl ir pALPacč2. Abiejų plazmidžių intarpai buvo sekvenuoti, naudojant bandymų rinkinius "Erase a base" (Promega) ir "Sequenase" (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Šiuo būdu buvo parodyta, kad gautoji PactPc neturėjo mutacijų ir turėjo Nco\ kirpimo vietą prieš ATG, kuris koduoja baltymo inicijatorių metioniną.
[0089] al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) kaip 1100 bp Nco\- Apa\ fragmentas. Tuomet šis fragmentas buvo subklonuotas plazmidėje pALPactt (nešančioje PactPc), prieš tai suskaidytoje su Nco\- Apa\, gaunant plazmidę pALfleol (fig.6).
[0090] coli ir plazmidės pBC KS (+) polijungtuvą. Suliejimo srities tarp PactPc ir bleR sekvenavimas patvirtino pastarojo geno įstatymą teisingame skaitymo rėmelyje.
[0091] P. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmidė pALPfleol, atrenkant transformantus pagal jų atsparumą 30^g/ml koncentracijos fleomocinui. Po to maksimalus transformantų fleomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje; kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti didesnėje nei 100 ng/ml fleomicino aplinkoje. Transformantai, parinkti pagal jų fleomicino atsparumą, buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir transcripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą - Nothern blot būdu;
[0092] abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino galimybę ekspresuoti heterologinius genus P. chrysogenum, reguliuojant PactPc. Transformantas E. coli DH5a su plazmidė pALP315 buvo deponuotas Spanish Collection of Type Cultures (CECT) su registracijos numeriu CECT4851. Plazmidė pALP316 gali būti gauta iš deponuotos plazmidės pALP315, paprasčiausiai subklonuojant pALP315 intarpą pBluescript I KS (+) EcoR\ kirpimo vietoje priešingoje orientacijoje.
[0093] Siekiant klonuoti A chrysogenum gdh geną, buvo sukurta DNR sekų biblioteka fago XGEM12 vektoriuje, kaip aprašyta 1 pavyzdžio 1.1 skyriuje. Gautasis fago titras buvo 50 faginių dalelių/jai (iš viso 20000 faginių dalelių) E.
[0094] reiškė, kad maždaug 82% fagų nešė egzogeninj DNR fragmentą ir kad A. chrysogenum DNR sekų biblioteka gauta su 99,999% tikimybe. Po šių teorinių patikrinimų E. coli NM539 buvo infekuotos, ir visa DNR biblioteka buvo išsėta ant trijų 150 mm skersmens Petri lėkštelių (maždaug 7000 faginių dalelių/Petri lėkštelėje), surinkta j 50 ml SM plius 2,5 ml chloroformo ir laikoma 4°C temperatūroje. Šiuo būdu buvo gautas pakankamas ir reprezentatyvus rekombinantinių fagų tūris (2100 faginių dalelių/^il), paruoštas išsėti bet kuriuo metu.
[0095] Maždaug 20000 faginių dalelių buvo paskirstyta ant dviejų 150 mm skersmens Petri lėkštelių ir po to perkelta ant nitroceliuliozės filtrų (BA85, 0,45 nm, Schleicher & Schuell). Šie filtrai buvo hibridizuoti, naudojant standartines metodikas (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA), su 888 bp Nco\- Cla\ fragmentu, atitinkančiu A. nidulans act geną. Iš viso buvo išgryninti 5 teigiami klonai, ir tuomet jų DNR buvo suskaidyta keliomis restriktazėmis ir analizuota Southern blot būdu. Tokiu būdu 8,7 kb Hind\\\ fragmente buvo identifikuotas act genas. Šis fragmentas buvo subklonuotas abiejose orientacijose plazmidėje pBluescript I KS (+) (Stratagene), sukuriant plazmides pALC52 ir pALC53. DNR srities, turinčios act geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.4.
[0096] Aukščiau minėtosios plazmidės pALC52 ir pALC53 buvo panaudotos nustatyti act geno nukleotidų sekai, Iš šių plazmidžių "Erase a base" (Promega) būdu buvo sukonstruoti keli klonai ir sekvenuoti didezoksinukleotidų būdu, naudojant "Sequenase" bandymų rinkinj (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 3240 nukleotidų seka (SEQ ID No:4) buvo analizuota pagal Geneplot programą (DNRSTAR), patvirtinant ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. Act geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 787 pozicijoje, o TAA beprasmis kodonas - 2478 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus 794-920, 952-1123, 1180-1289, 1321-1410 ir 2183-2249 pozicijose ir koduoja 41612 Da baltymą, turintį izoelektrinį tašką 5,51, kurio 375 aminorūgščių seka (SEQ ID No:8) turi 98,4% ir 98,1 % identiškumą su attinkamai A. nidulans ir P. chrysogenum y-aktino baltymų aminorūgščių sekomis. Promotoriaus srityje tarp 607-654 pozicijų aptikta pirimidinu praturtinta zona, numanoma TATA seka 747 pozicijoje (TTATAAAA) ir CAAT seka 338 pozicijoje.
[0097] Siekiant ekspresuoti bleR geną, reguliuojant P actAc, buvo sukonstruota plazmidė pALCfleol (fig.6), turinti bleR geną, ekspresuojamą, reguliuojant P actAc, trpC geno terminatorių už bleR geno, chloramfenikolio atsparumo geną kaip žymę E. coli ir plazmidės pBC KS (+) polilinkerj.
[0098] Iš plazmidės pUT737 buvo gautas bleR genas be jo promotoriaus srities (Mullaney et ai. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) kaip 1100 bp Ncol- Apal fragmentas. Tuomet šis fragmentas buvo sulietas skaitymo rėmelyje su PactPc,
[0099] ir pasinaudota tuo, kad act genas turi Nco\ kirpimo vietą prieš ATG, kuris koduoja baltymo inicijatorių metioniną. Tuo tikslu plazmidėje pALCactl (turinčioje PactAc) buvo jklonuotas bleR genas, prieš tai suskaidytas su Nco\-Apa\, gaunant plazmidę pALCfleol (fig.6). Suliejimo srities tarp PactAc ir bleR geno sekvenavimas patvirtino pastarojo geno išsidėstymą teisingame skaitymo rėmelyje.
[0100] P. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmide pALCfleol, atrenkant transformantus pagal jų atsparumą 10fxg/ml koncentracijos fleomocinui. Po to maksimalus transformantų fleomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje; kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti didesnėje nei 30 ng/ml fleomicino aplinkoje. Transformantai, atrinkti pagal jų atsparumą fleomicinui, buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir transcripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą - Nothern blot būdu; abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino galimybę ekspresuoti heterologinius genus A. chrysogenum, reguliuojant PactAc. E. coli DH5a transformantas su plazmide pALC52, turinčia act geną, buvo deponuotas Spanish Collection of Type Cultures (CECT), registracijos numeris - CECT4850. Plazmidė pALC53 gali būti gauta iš deponuotas plazmidės pALC52, paprasčiausiai subklonuojant pALC52 intarpą pBluescript I KS (+) Hind\II kirpimo vietoje priešingoje orientacijoje.
[0101] Intarpų, esančių deponuotose plazmidėse, naudojant E. coli kaip šeimininką, įterpimas j aktinomicetus Penicillium, Aspergillus, Acremonium ar Saccharomyces, yra tik technikos ir tinkamiausių vektorių, būtinų šios generacijos ar šeimų transformacijai, pasirinkimo reikalas.
[0102] Fig. 1 - P. chrysogenum gdh geno, koduojančio NADP priklausančios glutamato dehidrogenazės fermento aktyvumą (EC.1.4.1.4), restrikcijos diagrama. Fig.2 - P. chrysogenum hex geno, koduojančio p-N-acetilheksozaminidazės fermento aktyvumą (EC.3.2.1.52), restrikcijos diagrama. Fig.3 - P. chrysogenum act geno, koduojančio y-aktiną, restrikcijos diagrama. Fig.4 - A. chrysogenum act geno, koduojančio y-aktiną, restrikcijos diagrama. Fig.5 - E. coli lacZ geno, S. hindustanus bleR geno ir P. chrysogenum pahA geno ekspresijos P. chrysogenum ir/arba A. chrysogenum, reguliuojant promotoriui Pgdh, vektoriai. Fig.6 - S. hindustanus bleR geno ekspresijos P. chrysogenum ir/arba A.chrysogenum, reguliuojant promotoriams Phex, PacfPc, PactAc, vektoriai.
1. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Penicillium chrysogenum gdh geno promotoriumi.
2. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Penicillium chrysogenum hex geno promotoriumi.
3. Baltymų ekstraląstelinės ekspresijos mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtuose mikroorganizmuose ekspresuojamą geną sulieja su Penicillium chrysogenum hex genu.
4. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Penicillium chrysogenum act genu.
5. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Acremonium chrysogenum act genu.
6. Būdas pagal 1-5 punktą, besiskiriantis tuo, kad transformuotas mikroorganizmas yra eukariotas, išskyrus žmogų, geriausia Penicillium, Aspergillus arba Acremomonium.
7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad geriausias naudojamas mikroorganizmas yra Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans arba Acremomonium chrysogenum.
8. 2811 bp DNR darinys, išskirtas iš P. chrysogenum, apribotas Sau3AI ir Xbal restriktazių kirpimo vietomis, turintis gdh geno promotorių.
9. 7737 bp DNR darinys, išskirtas iš P. chrysogenum, apribotas BamHI ir Sacl restriktazių kirpimo vietomis, turintis hex geno promotorių.
10. 4947 bp DNR darinys, išskirtas iš P. chrysogenum, apribotas Bglll ir EcoRI restriktazių kirpimo vietomis, turintis act geno promotorių.
11. 8650 bp DNR darinys, išskirtas iš A. chrysogenum, apribotas dviem Hindlll restriktazių kirpimo vietomis, turintis act geno promotorių.
12. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:1, turinti P. chrysogenum gdh geną.
13. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:2, turinti P. chrysogenum hex geną.
14. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:3, turinti P. chrysogenum act geną.
15. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:4, turinti A chrysogenum act geną.
16. Nukleotidų sekos, besiskiriančios tuo, kad restrikcijos sąlygomis jos gali būti hibridizuojamos su DNR dariniais pagal 8-15 punktą.
17. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:5, atitinkanti P.chrysogenum fermentą glutamatdehidrogenazę.
18. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:6, atitinkanti P.chrysogenum fermentą p-N-acetilheksozaminidazę.
19. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:7, atitinkanti P.chrysogenum baltymą y-aktiną.
20. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:8, atitinkanti A.chrysogenum baltymą y-aktiną.
21. Vektoriai, turintys DNR darinius pagal 8-16 punktus arba jų fragmentus.
22. Vektoriai pagal 21 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaro plazmidė.
23. Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALP784, pALP785 ir pALfleo7.
24 Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALP295, pALP319, pALP377, pALP388 ir pALP480.
25. Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALP315 ir pALP316.
26. Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALC52 ir pALC53.
27. Transformuotų organizmų, išskyrus žmogų, su padidinta homologinių arba heterologinių genų ekspresija gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad j jį jeina tokios operacijos:a) vektorių, kurie turi pilnas arba dalines SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 arba SEQ ID No:4 arba jų rekombinantinius DNR darinius, konstravimas;b) vektorių įvedimas j šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus, kurie ekspresuoja homologinius arba heterologinius genus;c) transformuotų organizmų, pasižyminčių padidinta homologinių arba heterologinių genų ekspresija, lyginant su netransformuotais kontroliniais organizmais, atrinkimas.
a) vektorių, kurie turi pilnas arba dalines SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 arba SEQ ID No:4 arba jų rekombinantinius DNR darinius, konstravimas;b) vektorių įvedimas j šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus, kurie ekspresuoja homologinius arba heterologinius genus;c) transformuotų organizmų, pasižyminčių padidinta homologinių arba heterologinių genų ekspresija, lyginant su netransformuotais kontroliniais organizmais, atrinkimas.28. Transformuotų organizmų, išskyrus žmogų, sugebančių gaminti ekstraląstelinius baltymus, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad j jj jeina tokios operacijos:a) vektorių, turinčių pilną arba dalinę SEQ ID No:2 arba jos rekombinantinius DNR darinius, konstravimas;b) vektorių jvedimas j šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus, kurie ekspresuoja ir sekretuoja bent vieną baltymą;c) transformuotų organizmų, galinčių sekretuoti bent vieną baltymą aukštesniu lygiu nei netransformuoti kontroliniai organizmai, atrinkimas.
a) vektorių, turinčių pilną arba dalinę SEQ ID No:2 arba jos rekombinantinius DNR darinius, konstravimas;b) vektorių jvedimas j šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus, kurie ekspresuoja ir sekretuoja bent vieną baltymą;c) transformuotų organizmų, galinčių sekretuoti bent vieną baltymą aukštesniu lygiu nei netransformuoti kontroliniai organizmai, atrinkimas.29. Transformuotų organizmų, išskyrus žmogų, su antisensine genų ekspresija, pilnai arba dalinai blokuojant jų aktyvumą, gavimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad į jį įeina tokios operacijos:a) vektorių, turinčių pilnas arba dalines SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 arba SEQ ID No:4 arba jų rekombinantinius DNR darinius, konstravimas;b) vektorių įvedimas į šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus su antisensine genų ekspresija;c) transformuotų organizmų, pasižyminčių visiškai arba dalinai blokuota genų ekspresija, lyginant su netransformuotais kontroliniais organizmais, atrinkimas.
a) vektorių, turinčių pilnas arba dalines SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 arba SEQ ID No:4 arba jų rekombinantinius DNR darinius, konstravimas;b) vektorių įvedimas į šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus su antisensine genų ekspresija;c) transformuotų organizmų, pasižyminčių visiškai arba dalinai blokuota genų ekspresija, lyginant su netransformuotais kontroliniais organizmais, atrinkimas.30. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 27 ir 29 punktus, besiskiriantis tuo, kad jame naudoja vektorius pagal 21-26 punktus arba iš jų gautus vektorius.
31. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 28 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad jame naudoja vektorius pagal 24 punktą arba iš jų gautus vektorius.
32. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 27-31 punktus, besi skiriantis tuo, kad jame šeimininko organizmas yra eukariotas, išskyrus žmogų, geriausia PeniciUium, Aspergillus arba Acremomonium.
33. Būdas pagal 32 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame geriausias mikroorganizmas yra PeniciUium chrysogenum, Aspergillus nidulans arba Acremomonium chrysogenum.
34. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 27-31 punktus, bes i s k i r i a n t i s tuo, kad jame šeimininko organizmas yra prokariotas, geriausia Escherichia coli arba aktinomicetas.
35. Transformuoti organizmai, išskyrus žmogų, besiskiriantys tuo, kad j juos yra įvestos DNR sekos pagal 8-16 punktus, dalinai arba pilnai jeinančios j vektorius pagal 21-26 punktus, gaunami 27-34 punktuose aprašytais būdais.
36. Transformuotas organizmas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra prokariotas, geriausia Escherichia coli arba aktinomicetas.
37. Transformuotas organizmas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra eukariotas, geriausia PeniciUium, Aspergillus arba Acremomonium.
38. Transformuotas organizmas pagal 36 punktą, besiskiriantis tuo, kad geriausiu atveju jis yra PeniciUium chrysogenum, Aspergillus nidulans, Acremomonium chrysogenum arba Saccharomyces cerevisiae.
39. Organizmas pagal 36 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra grynas kamienas, būtent CECT4849, CECT4852, CECT4851 arba jų mutantai ir jų transformuoti dariniai.
40. Transformuotų organizmų pagal 35-39 punktus panaudojimas antibiotikų gamybai.
41. Transformuotų organizmų pagal 35-39 punktus panaudojimas penicilino gamybai.
42. Transformuotų organizmų pagal 35-39 punktus panaudojimas cefalosporinų gamybai.