[LT] Pareiškėjai atrado naujus chimerinius ir humanizuotus anti-žmogaus CD40 antikūnus, kurie blokuoja sąveiką tarp gp39 ir CD40. Šio išradimo anti-CD40 antikūnai veiksmingai moduliuoja humoralinius imuninius atsakus prieš T ląstelėms priklausančius antigenus, kolageno sukeltą artritą ir odos transplantaciją ir taip pat yra naudingi dėl jų priešuždegiminių savybių.
[EN] The applicants have discovered novel chimeric and humanized anti-human CD40 antibodies which block the interaction beteen gp39 and CD40. The anti-CD40 antibodies of the present invention are effective in modulating humoral immune responses against T cell-dependent antigens, collagen induced arthritis, and skin transplantation, and are also useful for their anti-inflammatory properties.
[0001] Išradimo kilmė
[0002] Imuniniuose/uždegiminiuose atsakuose tarpininkauja sudėtinga sąveikų eilė. Viena iš receptorių/ligandų porų, kuri buvo parodyta kaip esanti svarbi šiuose procesuose, yra CD40/gp39. Ši gp39/CD40 sąveika tarpininkauja eilėje svarbių signalinių procesų tarp aktyvuotų T ląstelių ir kitų imuninės sistemos ląstelių-efektorių ir sustiprina imuninį/uždegiminį atsaką. Atsakai į signalo perdavimą per CD40 apima T ląstelių pagalbą B ląstelėms humoralinio imuninio atsako atveju, monocitų sukeltą citokinų indukciją ir endotelinių ląstelių sukeltą adhezinių molekulių ekspresiją
[0003] CD40 yra I tipo ląstelių paviršiaus receptorius ir auglio nekrozės faktoriaus receptoriaus (TNFR) supergeninės šeimos narys. Nors iš pradžių
[0004] jis buvo identifikuotas kaip B ląstelių antigenas, dabar yra laikoma, kad CD40 ekspresuoja visos antigeną pateikiančios ląstelės (APC), įskaitant dendritines ląsteles, keratinocitus ir monocitus. CD40 taip pat ekspresuoja tipai ląstelių, kurios gali veikti kaip APC tam tikromis sąlygomis, kaip antai vaskuliarinės endotelinės ląstelės, arba ląstelės, dalyvaujančios tiesioginėse sąveikose su T ląstelėmis arba T ląstelių prekursoriais, tokiais kaip timinės epitelinės ląstelės. Neseniai taip pat buvo paskelbta, kad CD40 gali ekspresuoti fibroblastai, eozinofilai ir aktyvuotos T ląstelės. CD40 ekspresija taip pat buvo pastebėta ir vėžinėse ląstelėse. Šio fakto įrodymas pirmiausia gautas identifikavus kai kurias iš karcinomos ir melanomos išvestas ląstelių linijas, kurios yra CD40+ T ląstelės. (Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci.
[0005] (1986) 83:4494-98; Schriever et al., J. Eksp. Med. (1989) 169:2043-58; Caux
[0006] et al., J. Exp. Med. (1994) 180:1263-72; Alderson et al., J. Exp. Med. (1993) 178:669-74; Young et al., Int. J. Cancer (1989) 43:786-94; Paulie et al., Cancer Immunol. Immunother. (1985) 20:23-28; Denfeld et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26:2329-34; Gaspari et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26:1371-
[0007] 77; Peguet-Navarro et al., J. Immunol. (1997) 158:144-52; Hollenbaugh et al.,
[0008] J. Exp. Med. (1995) 182:33-40; Galy and Spits, J. Immunol. (1992) 149:775-82). Gp39 taip pat yra žinomas kaip CD40L, TRAP, T-BAM, o dabar turi oficialų CD pavadinimą nuo Leucocyte VVorkshop CD154. In vitro bandymuose gp39 pasirodo ant T ląstelių praėjus maždaug 2-4 valandoms po T ląstelių aktyvavimo ir pasiekia maksimumą po 6-8 valandų. Po to baltymo kiekis labai greitai mažėja ir pasidaro nebenustatomas praėjus 24 valandoms po stimuliavimo. Gp39 ekspresija taip pat buvo nustatyta ant eozinofilų ir mastinių ląstelių. (Noelle et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:6550-54; Hollenbaugh et ai., EMBO J. (1992) 11:4313-21; Spriggs et al., J. Exp. Med.
[0009] (1992) 176:1543-50; Graf et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22:3191-94; Covey et al., Mol. Immunol. (1994) 31:471-84; Castle et al., J. Immunol. (1993) 151:1777-88; Roy et al., J. Immunol. (1993) 151:2497-2510; Gauchat et al., Nature (1993) 365:340-43; Gauchat et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25:863-65; Koshy et al., J. Clin. Invest. (1996) 98:826-37; Desai-Mehta et al., J. Clin. Invest. (1996) 97:2063-73).
[0010] CD40 yra stiprus signalinis receptorius, kuris suteikia galimybę aktyvuotoms T-ląstelėms reguliuoti platų imuninių ir uždegiminių atsakų intervalą. In vitro ir in vivo tyrimai su gp39 ligando rekombinantinėmis formomis ir su anti-CD40 mAb parodė, kad signalo perdavimas per šį receptorių duoda ląstelini atsaką visose žinomose CD40+ ląstelėse, ir kad to išdava ne tik keičiasi priklausomai nuo ląstelės tipo, bet taip pat yra moduliuojama konkuruojančių signalinių procesų per kitus receptorius. Pavyzdžiui, B ląstelėse CD40 signalo perdavimas, kartu su IL-4 receptoriaus signalo perdavimu, sukelia B ląstelių proliferaciją ir IgE izotipo antikūnų gaminimąsi, o CD40 signalo perdavimas kartu su signalais iš IL-4 receptoriaus sukelia B ląstelių proliferaciją ir IgG izotipo antikūnų gaminimąsi (Gordon et al., Eur. J. Immunol. (1987) 17:1535-38; Rousset et al., J. Exp. Med. (1991) 173:705-710; Jabara et al., J. Exp. Med. (1990) 172:1861-64; Gascan et al., J. Immunol. (1991) 147:8-13). Gp39 tarpininkaujamas CD40 signalo perdavimas gali vaidinti vaidmenį ląstelės imuniniškume per CD80 ir CD86 - svarbių T ląstelių kostimuliatorinių molekulių, kurios suriša CD28 ir CTLA4- indukciją (Goldstein et al., Mol. Immunol. (1996) 33:541-52).
[0011] CD40/gp39 receptoriaus/ligando sistema yra viena iš daugelio sistemų, kurios dalyvauja produktyvioje sąveikoje tarp aktyvuotų T ląstelių ir kitų imuninės sistemos ląstelių. Tačiau daugelis duomenų duoda suprasti, kad ši sąveika yra unikali ir pagrindinė žmogaus humoralinio atsako reguliavime. Konkrečiau kalbant, buvo parodyta, kad gp39 ekspresijos arba struktūros defektai yra žmogaus imunodeficito, žinomo kaip X-ryšio hiper-lgM (X-HIM) sindromas, priežastis. Šiam imunodeficitu! yra būdingas jo paveiktų individų nesugebėjimas gaminti kitokius nei IgM izotipo antikūnus, kas rodo, kad efektyviam humoraliniam imuniniam atsakui yra reikalinga produktyvi sąveika tarp gp39 ir CD40 (Allen et al., Science (1993) 259:990-93; Aruffo et al., CeįĮ (1993) 72:291-300; Di Santo et al., Nature (1993) 361:541-43; Fuleihan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90(6):2170-73; Korthauer et al., Nature (1993) 361:539-541; Notarangelo et al., Immunodef. Rev. (1992) 3:101-22. Panašiu būdu, neseni duomenys rodo, kad žmogaus ne-X-ryšio HIM sindromą sukelia defektai CD40 molekulėje. Naudojant genų nokauto technologiją buvo išvestos pelės, neturinčios CD40 arba gp39. Šios pelės atitinka fenotipą kuris turi tas pačias charakteristikas kaip ir HIM sindromas, o tai leidžia manyti, kad pelės gali būti tinkamas modelis, kuris gali būti naudojamas nustatyti gydymo arba anti-CD40, arba anti-gp39 mAb'ais, kurie blokuoja sąveiką tarp CD40 ir gp39, efektams in vivo (Kawabe et al., Immunitv
[0012] (1994) 1:167-78; Xu et al., Immunitv (1994) 1:423-431; Renshaw et al., 1 Exp. Med. (1994) 180:1889-1900; Castigli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
[0013] (1994) 91:12135-39).
[0014] CD40/gp39 sąveikos inhibavimo efektai in vivo buvo plačiai tirti bandymuose su normaliomis pelėmis ir su ligos pelių modeliais, naudojant žiurkėno anti-pelės gp39 mAb (MR1). Šio antikūno imunosupresijos geba atsispindi jo sugebėjime pilnai inhibuoti humoralinį imuninį atsaką į T-ląstelėms priklausančius antigenus (Foy, et al., J. Exp. Med. (1993) 178:1567-75). Tai pat buvo parodyta, kad keletas imuninių ligų pelių modelių yra inhibuojami gydant šiuo antikūnu, įskaitant tuos, kuriuose tarpininkauja ląstelių imuniniai atsakai. Ligų modeliai, kurie buvo parodyti, kad jie yra inhibuojami gydant anti-gp39, yra kolageno sukeltas artritas, eksperimentinis alerginis encefalomielitas, su vilklige susijęs nefritas, persodinto organo atmetimas ir implantatas prieš šeimininką liga (Durie et al., Science (1993) 261:1328-30; Berry et al., neatspausdinta; Gerritse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 93:2499-504; Mohan et al., J. Immunol. (1995) 154:1470-1480; Larsen et al., Transplantation (1996) 61:4-9; Hancock et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:13967-72; Parker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
[0015] (1995) 92:9560-64; Durie et al., J. Clin. Invest. (1994) 94:1333-38; Wallace, et al., neatspausdinta). CD40/gp39 vaidmuo ląstelinio atsako sustiprinimui gali būti tiesioginis - per aktyvuotų T ląstelių, kurios gali ekspresuoti CD40, subpopuliacijos stimuliavimą arba netiesioginis - per citokinų indukciją ir svarbių kostimuliatorinių ląstelių paviršiaus molekulių, tokių kaip CD80 ir CD86, kurios prisijungia prie T ląstelių receptorių CD28 ir CTLA-4, ekspresiją. Šio inhibitoriaus priešuždegiminiai efektai buvo pademonstruoti naudojant tyrimams deguonies sukelto plaučių pažeidimo pelės modelį. Poveikis į uždegimą in vivo buvo paremtas rezultatais in vitro, rodančiais CD40 stimuliavimą ant vaskuliarinių endotelinių ląstelių ir monocitų kurie duoda ląstelių adhezijos molekulių ekspresiją azoto oksidą (NO), matricines metaloproteazes ir prouždegiminius citokinus (Kiener et al., J. Immunol.
[0016] (1995) 155:4917-25; Malik et al., J. Immunol. (1995) 156:3952-60; Hollenbaugh et al.r J. Exp . Med. (1995) 182:33-40).
[0017] Tyrimai su anti-žmogaus gp39 mAb bandyme su beždžionėmis parodė, kad bioagentai, kurie inhibuoja sąveiką tarp gp39 ir CD40 in vivo, yra efektyvūs imunosupresiniai agentai primatams. Buvo parodyta, kad anti-gp39 mAb efektyviai inhibuoja antikūnų atsaką į T ląstelėms priklausančius antigenus, ir apsaugo alotransplantatus nuo atmetimo (rezultatai analogiški rezultatams, gautiems bandyme su graužikais).
[0018] Bendrai paėmus, aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad agentai, kurie suardo sąveiką tarp gp39 ir CD40, turėtų būti stiprūs imunosupresiniai ir priešuždegiminiai agentai. Todėl, norint gauti imunosupresinį arba priešuždegimini efektą yra reikalinga surasti efektyvų būdą CD40/gp39 sąveikai blokuoti. Šio išradimo tikslas yra pateikti antikūną kuris blokuotų sąveiką tarp gp39 ir CD40.
[0019] Kitas šio išradimo tikslas yra pateikti chimerinį antikūną kuris efektyviai blokuotų sąveiką tarp CD40 ir gp39.
[0020] Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti numanizuotą arunuju^ r\uno efektyviai blokuotų sąveiką tarp CD40 ir gp39.
[0021] Dar vienas šio išradimo tikslas yra imuninio atsako moduliavimo būdas, įvedant šio išradimo antikūną chimerinį antikūną arba humanizuotą antikūną. Šis būdas gali būti naudingas gydant bet kokias autoimunines ligas, bei odos arba kitų organų transplantacijoje.
[0022] Šis išradimas apima naują antikūną tiksliau chimerizuotą anti-žmogaus CD40 monokloninį antikūną (mAb), kuris blokuoja sąveiką tarp gp39 ir CD40. Viename šio išradimo realizavimo variante ypatingai tinkamas chimerizuotas anti-žmogaus CD40 mAb yra žymimas uchi220". Chi220 yra chimerinis antikūnas, apimantis pelės kintamąją ir žmogaus kapa ir gama 1 pastoviąsias sritis. Chi220, kaip ir jo pradininkas pelės mAb, prisijungia prie CD40 ir dėl to efektyviai blokuoja humoralinius imuninius atsakus į T ląstelėms priklausančius antigenus nuo dozės priklausančiu būdu.
[0023] Taip pat į šio išradimo apimtį patenka humanizuoti anti-CD40 antikūnai, kurie blokuoja sąveiką tarp gp39 ir CD40. Viename šio išradimo įgyvendinimo variante humanizuotas antikūnas yra pažymėtas F4; kitame įgyvendinimo variante humanizuotas antikūnas yra pažymėtas L3.17. Tinkamiausi humanizuoti šio išradimo antikūnai apima žmogaus kintamąją sunkiąją ir lengvąją sritis su į jas įterptais pelės CDR.
[0024] Šio išradimo anti-CD40 antikūnai, geriau chimeriniai ir humanizuoti čia aprašyti antikūnai, veiksmingai moduliuoja humoralinius imuninius atsakus prieš T ląstelėms priklausančius antigenus, kolageno sukeltą artitą ir transplantanto atmetimą. Šio išradimo anti-CD40 antikūnai, geriau chimeriniai ir humanizuoti čia aprašyti antikūnai, taip pat yra naudingi dėl jų priešuždegiminių savybių (kurios yra panašios į anti-gp39 savybes).
[0025] Šio išradimo antikūnai, ypatingai anti-CD40 chimerinis antikūnas chi220 ir anti-CD40 humanizuoti antikūnai F4 ir L3.17, turi platų terapinį pritaikymą įskaitant autoimunines ligas, uždegimines ligas ir transplantaciją
[0026] Kadangi CD40 ekspresija stebima ant kai kurių histologinių tipų piktybinių ląstelių, anti-CD40 antikūnų, ypatingai šio išradimo chimerinių ir humanizubtų antikūnų, pritaikymo galimybė onkologijoje yra akivaizdi.
[0027] Šioje paraiškoje yra naudojami tokie specialistams žinomi sutrumpinimai: APC (antigeną pateikianti ląstelė); CDR (komplementarumą apsprendžianti sritis); CHO (kiniškojo žiurkėno kiaušidė); CIA (kolageno sukeltas artritas); Cmax (maksimali koncentracija serume); COS (Afrikos žaliosios beždžionės fibroblastų ląstelių linija); DMARD (ligą modifikuojantys priešreumatiniai vaistai); ELISA (fermento, prijungto prie imunosorbento, testas); EPT (galinio taško titrai); EU (endotoksino vienetai); Fab (antigeną jungiantis fragmentas); FITC (fluorizotiocianatas); Hu (humanizuotas); h106-2 (humanizuotas anti-gp39 mAb); HAMA (žmogaus-anti-pelės antikūnai); im (intraraumeninis); KLH (sraigės limfos hemociani.nas); mAb (monokloninis antikūnas); MTX (metotreksatas); OVA (ovalbuminas); PBS (fosfatinis buferis su NaCI); PCR (polimerazinė grandinės sintezė); PE (fikoeriterinas); sc (poodinis); SDS-PAGE (natrio dodecilsulfato poliakrilamidinio gelio elektroforezė); SEC (molekulinių sietų chromatografija); SRBC (avies eritrocitai); STR (maišomo bako tipo reaktorius); TNF (auglio nekrozės faktorius); VL (antikūno lengvosios grandinės kintamoji sritis); VH (antikūno sunkiosios grandinės kintamoji sritis).
[0028] Nukleorūgštis, koduojanti tinkamiausią lengvąją šio išradimo chimerinio antikūno (chimerinis antikūnas 2.220) grandinę, buvo deponuota Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje su depozito numeriu ATCC 203630. Nukleorūgštis, koduojanti tinkamiausią sunkiąją šio išradimo chimerinio antikūno (2.220) grandinę, buvo deponuota Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje su depozito numeriu ATCC 203629.
[0029] Nukleorūgštis, koduojanti tinkamiausią lengvąją šio išradimo humanizuoto antikūno (humanizuotas antikūnas F4) grandinę, buvo deponuota Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje su depozito numeriu ATCC 203628. Nukleorūgštis, koduojanti papildomą tinkamiausią lengvąją šio išradimo humanizuoto antikūno (humanizuotas antikūnas L3.17) grandinę, buvo deponuota Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje su depozito numeriu ATCC 203774. Nukleorūgštis, koduojanti tinkamiausią sunkiąją šio išradimo humanizuoto antikūno (F4 ir L3.17) grandinę, buvo deponuota Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje su depozito numeriu ATCC 203631.
[0030] Čia nurodyti depozitai bus laikomi pagal Budapešto sutarties dėl Tarptautinio mikroorganizmų depozitų palaikymo patentiniams tikslams terminus. Šie depozitai yra pateikiami vien tiktai specialistų patogumui ir nelaikoma, kad indėliui taikomas 35 U.S.C. § 112. Deponuotų medžiagų polinukleotidų sekos bei jų koduojamos aminorūgščių sekos čia yra pridedamos kaip nuorodos ir yra kontrolinės tuo atveju, jei iškyla nesutapimas su duotu sekos aprašymu. Deponuotų medžiagų gaminimui, panaudojimui arba pardavimui turi būti reikalaujama licenzijos, ir tokios licenzijos čia neduodama.
[0031] Visi šioje paraiškoje cituojami literatūros šaltiniai, ar tai yra supra ar infra, čia yra pridedami pilnumoje.
[0032] Fig. 1 rodo sgp39 prisijungimo prie Raji ląstelių inhibavimą anti-žmogaus CD40 mAb. Fig.2 yra scematiniai primatų tyrimo metodikos metmenys. Gydymo dienos pavaizduotos rombais. Imunizavimas SRBC ir KLH pažymėtas atitinkamai stačiakampiais ir trikampiais. Gyvuliukai, paveikti 2.36, po I fazės tirti nebuvo, o gyvuliukai, paveikti 1.106 nebuvo tirti po II fazės. Fig.3 rodo anti-SRBC antikūno atsaką primatuose. Fig.3a rodo IgM anti-SRBC antikūnų analizės rezultatus. Fig.3b rodo IgG anti-SRBC antikūnų analizės rezultatus. Fig.4a rodo chi220 lengvosios grandinės kintamosios srities seką paryškintomis raidėmis (SEQ ID NO:1), o Fig.4b rodo chi220 sunkiosios grandinės kintamosios srities seką paryškintomis raidėmis (SEQ ID NO:2). Fig.4a ir 4b pabrauktos sekos yra žmogaus antikūno įterptos signalinės sekos su artimiausia homologija, kurios buvo naudojamos kaip humanizavimo matrica. Fig.5 rodo in vitro bandymų rezultatus, tiriant šio išradimo chimerinį ir humanizuotą antikūną. Fig.5a rodo chi220 ir h220v3 prisijungimą prie hCD40-mG2b ELISA testu paremtame bandyme. Fig.5b rodo sgp39 tarpininkaujamo žmogaus B ląstelių kostimuliavimo inhibavimąanti-žmogaus CD40 mAb. Fig.6 rodo IgM anti-SRBC antikūno atsaką. Fig.6a rodo rezultatus su beždžionėmis, kurios gavo 10, 40 arba 100 mg/kg chi220. Fig.6b rodo rezultatus su beždžionėmis, kurios gavo 0,1 arba 1 mg/kg chi220. Fig.7 rodo IgG anti-SRBC antikūno atsaką. Fig.7a rodo rezultatus su beždžionėmis, kurios gavo 10, 40 arba 100 mg/kg chi220. Fig.7b rodo rezultatus su beždžionėmis, kurios gavo 0,1 arba 1 mg/kg chi220. Fig.8 rodo anti-OVA antikūno atsaką primatuose. Fig.8a rodo IgM anti-OVA antikūnų analizės rezultatus. Fig.8b rodo IgG anti-OVA antikūnų analizės rezultatus. Fig.9 rodo anti-KLH antikūno atsaką primatuose. Fig.9a rodo IgM anti-KLH antikūnų analizės rezultatus. Fig.9b rodo IgG anti-KLH antikūnų analizės rezultatus. Fig.10 rodo 7E1-G1 ir 7E1-G2b antikūnų gebos slopinti IgG atsaką į SRBC palyginimą. Fig.11 rodo antikūno atsako į SRBC inhibavimo 7E1-G2b priklausomybę nuo dozės. Fig. 12 rodo šio išradimo chimerinio antikūno sunkiosios grandinės srities ir lengvosios grandinės srities ekspresijos vektorių žemėlapius. Fig. 13 pateikiama ekspresijos vektoriaus, galinčio ekspresuoti šio išradimo chimerinio antikūno sunkiąją grandinę, nukleorūgščių seka (SEQ ID No:5). Startinis ATG (1000-1002 nukleotidai), koduojantis žmogaus antikūno įterptos signalinės sekos startinį Met, yra paryškintas. Pabraukti nukleotidai 1057-1422 (SEQ ID NO: 13) rodo tinkamiausią nukleorūgščių seką koduojančią šio išradimo antikūno kintamą sunkiąją grandinę. Fig. 14 pateikiama ekspresijos vektoriaus, galinčio ekspresuoti šio išradimo chimerinio antikūno lengvąją grandinę, nukleorūgščių seka (SEQ ID No:6). Startinis ATG (1005-1007 nukleotidai), koduojantis žmogaus antikūno įterptos signalinės sekos startinį Met, yra paryškintas. Pabraukti nukleotidai
[0033] 1065-1388 (SEQ ID NO: 14) rodo tinkamiausią nukleorūgščių seką koduojančią šio išradimo antikūno kintamą lengvąją grandinę.
[0034] Fig.15 rodo pelės anti-CD40 kintamųjų sričių ir žmogaus matricos sekų sugretinimą Pelės anti-CD40 H ir L grandinių kintamosios sritys buvo panaudotos homologinėms žmogaus embrioninės linijos sekoms identifikuoti. Liekanų numeracija ir CDR'ų (pabraukti) nustatymas buvo atliekamas remiantis Kabat et al. (Kabat, E.A., et al., (1991) Seąuencies of proteins of immunological interest (5th Ed). Washington DC: United States Department of Health and Human Services; Kabat, E.A., et al., (1977) J . Biol . Chem .
[0035] 252:6609-6616). Skirtumai tarp sekų nurodyti vertikaliomis linijomis, o karkaso padėtys, charakterizuotos sudėtinėje ekspresijos bibliotekoje,
[0036] Fig.16 rodo humanizuoto ariti-CD40 variantų titravimo rezultatus su imobilizuotu antigenu. Buvo charakterizuoti bakterijose ekspresuoto chimerinio anti-CD40 Fab ir parinkti variantai iš kiekvienos bibliotekos. Chimerinis (juodi skrituliukai), Hu I-19C11 (balti skrituliukai), Hu II-CVV43 (balti kvadratai), Hu III-2B8 ( juodi trikampiai) ir neturintys nieko bendro su šiais antikūnais Guodi kvadratai) Fab buvo išlaisvinti iš 15 ml bakterijų kultūrų periplazminės erdvės ir serijiniai skiedimai buvo inkubuojami su CD40-Ig antigenu, imobilizuotu ant mikrotitro plokštelių. Antikūno susijungimo kiekis buvo nustatytas žemiau aprašytu būdu. Fig. 17 rodo, kaip antikūno afiniškumas koreliuojasi su tirpaus-gp39 prisijungimo prie CD40-lg inhibavimu. CD receptoriaus ligandas - gp39 - buvo imobilizuotas ant mikrotitro plokštelės. Po to kintami kiekiai išgryninto chimerinio (juodi skrituliukai), Hu II-CVV43 (balti skrituliukai), Hu III-2B8 (juodi trikampiai), Hull/lll-2B12 (balti skrituliukai) ir neturintys nieko bendro su šiais antikūnais (juodi kvadratai) Fab buvo koinkubuoti su 2 |ig/ml CD40-lg ant mikrotitro plokštelės. CD40-lg prisijungimo prie gp39 kiekis buvo įvertintas žemiau aprašytu būdu. Fig. 18 rodo pelės karkaso liekanų aktyviuose variantuose kiekybinį įvertinimą. Buvo nustatytos aktyviausių anti-CD40 variantų iš karkaso optimizavimo bibliotekos Hu I (A) ir iš karkaso/HCDR3 optimizavimo bibliotekos Hu II (B) kintamųjų sričių sekos, norint nustatyti aminorūgštis karkaso bibliotekos padėtyse. Buvo nustatyta kievieno atskiro varianto kategorija remiantis bendru skaičiumi pelės liekanų, išlikusių 8 karkaso bibliotekos padėtyse. Buvo nustatytos 34 klonų iš Hu I bibliotekos ir 40 klonų iš Hu II bibliotekos sekos, ir tai leido identifikuoti atitinkamai 24 ir 10 atskirų variantų. Ištisinė linija rodo sekų, lauktų iš vienodo skaičiaus atsitiktinai pasirinktų variantų, pasiskirstymą.
[0037] Šiame išradime buvo sukurti chimeriniai ir humanizuoti anti-žmogaus CD40 antikūnai su imunosupresinėmis savybėmis. Tokie anti-žmogaus CD40 antikūnai turi akivaizdų pritaikymą kaip vaistai. Šiame išradime taip pat sukurtas labai panašus anti-pelės CD40 mAb (labai panašus į anti-žmogaus CD40 mAb), kuris tinka anti-CD40 mAb terapijos poveikiams tirti eilėje imuninių ir uždegiminių ligų pelių modelių. Anti-CD40 antikūnų sukūrimą komplikuoja tas faktas, kad CD40 yra stipri signalinė molekulė. Antikūnai, kurie jungiasi prie šio antigeno, gali būti paskirstomi į kategorijas, remiantis sugebėjimu stimuliuoti CD40 signalo perdavimą o taip pat ir sugebėjimu blokuoti CD40/gp39 sąveiką.
[0038] Pareiškėjų anti-žmogaus CD40 mAb, kurie blokuoja CD40/gp39 sąveiką buvo parinkti iš gausios anti-CD40 mAb grupės. Antikūnas, pažymėtas 2.220, buvo chimerizuotas ir humanizuotas. "Chimeriniai" antikūnai turi lengvąją grandinę ir sunkiąją grandinę: lengvoji grandinė turi lengvosios grandinės kintamąją sritį ir lengvosios grandinės pastoviąją sritį; sunkioji grandinė turi sunkiosios grandinės kintamąją sritį ir sunkiosios grandinės pastoviąją sritį. Chimeriniai antikūnai turi kintamąsias sritis iš vienų rūšių ir pastoviąsias sritis iš kitų rūšių (pavyzdžiui, pelės kintamosios sritys prijungtos prie žmogaus pastoviųjų sričių). (Žr. pvz., U.S. Patents 4,816,39 ir 4,816,567). Kiekviena iš lengvosios grandinės kintamųjų sričių (VL) ir sunkiosios grandinės kintamųjų sričių (VH) susideda iš "karkaso" sričių, pertrauktų trijų hiperkintamų sričių, vadinamų "komplementarumą apsprendžiančiomis sritimis" arba "CDR". "Humanizuoti" antikūnai apima antikūnus su žmogaus karkasinėmis sritimis, sujungtomis su CDR iš donorinės pelės arba žiurkės imunoglobulino. (Žr. pvz., U.S. Patent 5,530,101). [ šio išradimo apimtį patenka humanizuoti antikūnai, kurie turi CDR, išvestus iš čia parodytų pelės kintamųjų grandinių.
[0039] Labiausiai tiesioginę antikūno humanizavimo strategiją sudaro CDR iš donorinio mAb įjungimas į žmogaus karkasą (Jonės, P.T., et al., (1986) Nature 321:522-525). Tačiau tam tikros karkaso liekanos palaiko CDR struktūrą ir kontaktinės antigeninės implantuotos pelės CDR į žmogaus karkaso matricas gali sumažinti gauto humanizuoto mAb susirišimo aktyvumą
[0040] (Foote, J., et al., (1992) J. Mot. Biol. 224:487-499). Vertinant konkrečių karkaso liekanų potencialų įnašą į antikūno afiniškumą susiduriama su dviem problemomis. Pirma, konkrečiam mAb sunku numatyti, kuri karkaso liekana atlieka kritinį vaidmenį afiniškumo ir specifiškumo palaikyme. Antra, karkaso padėtims, kurios yra skirtingos pradiniame mAb ir žmogaus matricoje, yra sunku numatyti, ar atsiradusi iš pelės pradininko ar žmogaus matricos aminorūgštis duos aktyvesnį mAb. Taigi, antikūnų humanizavimo būdai, kurie remiasi vien tik struktūros nagrinėjimu, ne visada yra sėkmingi.
[0041] Ankstesniuose darbuose galima rasti bendros antikūnų gaminimo strategijos aprašymą kuriame akcentuojama, kad po humanizavimo yra sunku išlaikyti antikūninį surišimo aktyvumą (Rosok, M.J., et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618). Potencialiai svarbios karkaso liekanos, kurios yra skirtingos pradiniame mAb ir žmogaus matricoje, yra apibūdinamos vienoje stadijoje, sintezuojant ir ekspresuojant sudėtinę antikūnų biblioteką kurioje yra visi galimi pradinio ir žmogaus matricos aminorūgščių dariniai tiriamajame karkase. Variantai, kurie turi optimalią karkaso struktūrą nustatomi atrinkimo metu, o po to optimali karkaso struktūra(os) nustatoma nustatant DNR sekas. Paprastai daugelio aktyvių klonų sekų nustatymas atskleidžia kritines karkaso padėtis, kurios reikalauja konkrečios aminorūgšties ekspresijos. Atvirkščiai, pelės arba žmogaus aminorūgšties ekspresija bibliotekos karkaso padėtyje, esant ekvivalentiniam dažniui, aktyviuose klonuose sutampa su mažiau svarbia konkrečios karkaso padėties funkcija. Taigi, humanizuota antikūno versija, kuri išlaiko pradinio mAb surišimo aktyvumą yra greitai nustatoma remiantis funkciniu surišimu.
[0042] Antikūno humanizavimo ir afiniškumo subrandinimo procesai dažnai vykdomi atskirais etapais (Rostok (1996), supra\ Yelton, d. E., et al., (1995) J. Immunol. 155:1994-2004; Wu, H., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042; Baca, M.., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Marks, J.D., et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010). Naudojant žemiau aprašytą modifikuotą strategiją buvo sukurta daug humanizuotų pelės mAb 2.220 versijų, kurių afiniškumas buvo toks pat arba geresnis nei chimerinio Fab.
[0043] Pareiškėjų šio išradimo chimerinis antikūnas čia yra žymimas "chi220". Pareiškėjų labai artimas anti-pelės CD40 mAb čia yra žymimas "7E1". Pareiškėjų humanizuoti šio išradimo anti-CD40 antikūnai čia yra žymimi "F4" ir "L3.17".
[0044] Buvo sukurti du skirtingi 7E1 izotipo variantai. Šie du 7E1 variantai yra tinkami tiriant molekulės Fc dalies vaidmenį anti-CD40 mAb terapijoje priešklinikiniuose imuninių ir uždegiminių ligų modeliuose. Čia taip pat yra pateikiamas anti-pelės CD40 mAb sukūrimas, kriterijai, naudojami atrinkti antikūnui, kuris atitinka chi220 savybes, šio mAb izotipo variantų sukūrimas ir jų in vivo aktyvumas imuninių ligų pelių modeliuose. Tyrimai ir su chi220, ir su jo pradiniu pelės mAb 2.200 bandyme su beždžionėmis, o taip pat ir tyrimai su 7E1 bandyme su pelėmis parodė, kad šie anti-CD40 mAb yra stiprūs imunosupresiniai agentai, ir jie bus smulkiau aptarti toliau. Čia aprašyti tyrimai buvo atlikti naudojant specialistams žinomą standartinę technologiją
[0045] Taigi, buvo parodyta, kad pareiškėjų antikūnai slopina beždžionių humoralinį imuninį atsaką. Be to, du artimi anti-pelės CD40 mAb (7E1) izotipo variantai parodė imunosupresinį aktyvumą eilėje žmogaus ligų priešklinikinių modelių. Bendrai paėmus, šie duomenys rodo, kad chi220, F4 ir L3.17 yra tinkami klinikiniam vartojimui gydant autoimunines ligas ir transplantacijoje.
[0046] Toliau duodami pavyzdžiai yra skirti vien tik iliustracijos tikslams, ir jie neapriboja pareiškėjų išradimo, kurio ribas nustato tik išradimo apibrėžtis.
[0047] Panaudojant standartinę hibridomų technologiją su žmogaus CD40 sulietu baltymu kaip imunogenu buvo generuotas monokloninių antikūnų rinkinys. Buvo atrinkti antikūnai pagal susirišimą su CD40, panaudojant ir CD40+ ląstelių liniją ir sulietus baltymus. Klonuotiems antikūnams apibūdinti buvo naudojami gp39 susijungimo su CD40 testai ir stimuliavimo per CD40 funkciniai testai. Atrinkti antikūnai po to buvo charakterizuoti pagal krosreaktingumą su primatų ląstelėmis, norint nustatyti antikūnų tinkamumą naudojimui primatų priešklinikiniuose modeliuose.
[0048] Norint generuoti anti-žmogaus CD40 mAb gaminančias hibridomas, buvo atlikti du suliejimai. Imunizavimai imuninių limfocitų generavimui buvo atliekami imant 6-8 savaičių amžiaus BALB/c pelių pateles, imunogenu naudojant rekombinantinį sulietą baltymą susidedantį iš žmogaus CD40 ekstraląstelinės srities, prijungtos prie šarnyro - pelės lgG2b antikūno CH2 ir CH3 sričių (hCD40-mD2b).
[0049] Suliejimui 40-1 pelė iš pradžių buvo imunizuojama, suleidžiant po oda 3-4 vietose 30 jag hCD40-mG2b emulsiją pilname Froindo adjuvante (iš viso 200 nl). Gyvuliukas buvo panašiai paveiktas 21-ą dieną hCD40-mG2b nepilname Froindo adjuvante, po to 37-ą dieną gavo galutinę prieš suliejimą vykdomą imunizaciją suleidžiant į veną 30 jj.g hCD40-mG2p PBS. Imunizavimai suliejimui 40-2 buvo atliekami panašiai, išskyrus tai, kad Froindo adjuvantas buvo pakeistas Ribi adjuvantu (R-730). Pakartotinės imunizacijos buvo atliekamos 21-ą ir 42-ą dieną o galutinė prieš-suliejimo imunizacija - 58-ą dieną.
[0050] Praėjus 3 dienoms po paskutinės reimunizacijos injekcijos, buvo paimti leukocitai iš blužnies ir limfmazgių ir sulieti 3:1 santykiu su X63-Ad8.653 pelės mielomos ląstelėmis, naudojant standartinius metodus (Kearney et al., J. Immunol. (1979) 123:1548-50; Lane, J. Immunol. (1985) 81:223-28). Kiekvieno suliejimo ląstelių suspensijos buvo supilstytos į 96 duobučių ląstelių auginimo plokšteles, gaunant maždaug 170000 ląstelių (prieš-suliejimo) duobutei tankį.
[0051] Norint identifikuoti mAb, turinčius specifiškumą natyviam žmogaus CD40, buvo naudoti du bandymo tipai. Iš pradžių buvo atrinkti ląstelių kultūros nuopilai iš visų duobučių, nustatant jų sugebėjimą susirišti su CD40 teigiama, EBV transformuota žmogaus B ląstelių linija (IA2-2C) ELISA paremtame variante. Po to kiekvienas nuopilas buvo tirtas ELISA paremtame variante, nustatant jo sugebėjimą reaguoti su išgrynintu rekombinantiniu sulietu baltymu, susidedančiu iš žmogaus CD40 ekstraląstelinės dalies, sulietos su šarnyru (žmogaus lgG1 antikūno CH2 ir CH3 sritimis) - hCD40-lg - ir su panašiai sukonstruotu neturinčiu nieko bendro su žmogaus Ig sulietu baltymu - Leu8-hlg (Hollenbaugh, et al„ EMBO J. (1992) 11:4313-4321). Sugebėjimas reaguoti su pirmuoju, o ne su antruoju sulietu baltymu, pridėjus ląstelių surišimo duomenis, leido nustatyti specifinio natyviam CD40 antikūno buvimą maždaug 200 šeimininko duobučių.
[0052] Svarbiausia norimo anti-CD40 mAb savybė yra jo sugebėjimas visiškai blokuoti CD40 ir jo ligando (gp39) sąveiką. Taigi, kaip sekantis antikūno parinkimo žingsnis, buvo nustatomas visų CD40 specifinių šeimininko duobučių nuopilų sugebėjimas inhibuoti tirpaus rekombinantinio pelės CD8-žmogaus gp39 sulieto baltymo (sgp39) susijungimą su imobilizuotu hCD40-lg ELISA paremtame variante. Tie nuopilai, kurie pilnai inhibavo šią sąveiką buvo po to titruoti tame pačiame variante, nustatant kuri duobutė turi didžiausią antikūno inhibavimo titrą. Pagal šios analizės duomenis klonavimui buvo parinkta 10 stipriausiai inhibuojančių šeimininko duobučių.
[0053] Reikiamą antikūną sekretuojančių ląstelių klonavimas buvo vykdomas dviem stadijomis. Ląstelės iš kiekvienos šeimininko duobutės iš pradžių buvo "miniklonuotos", imant 10 ląstelių/duobutei pasėlio tankį, po to didžiausią titrą turinti CD40-specifinio "miniklono" duobutė buvo formaliai klonuota limituojančių skiedimų metodu.
[0054] Tolesniam antikūnų charakterizavimui buvo naudoti šeši bandymų tipai. Tai buvo sgp39 prisijungimo prie žmogaus B ląstelių inhibavimas, B ląstelių proliferacijos, sukeltos spg39 plius anti-lgM, inhibavimas, aktyvuotomis T ląstelėmis indukuotų B ląstelių sukeltos antikūnų sintezės inhibavimas in vitro, tiesioginė B ląstelių kostimuliacija anti-lgM, B ląstelių kostimuliacija anti-lgM, esant kryžmiškai sujungiančiam anti-kapa lengvosios grandinės antikūnui, ir B ląstelių kostimuliacija anti-lgM, esant antrajam anti-CD40 mAb - G28-5. Žinoma, kad šis mAb pasižymi stipriu kostimuliaciniu aktyvumu ir jis nepilnai blokuoja CD40/gp39 sąveiką. Jis buvo panaudotas daugelyje šių bandymų palyginimo tikslams.
[0055] Ši analizė leido atrinkti keturis mAb: 1.66 (lgG2b), 2.36 (lgG2a), 2.174 (lgG1) ir 2.220 (lgG2a). Buvo atlikti bandymai mAb charakterizuoti. Viename eksperimente ląstelės iš žmogaus B ląstelių Raji linijos buvo inkubuotos su 2 arba 20 ng/ml įvairių anti-CD40 mAb, o po to atliktas antras inkubavimas neskiestame COS ląstelių nuopile, turinčiame mCD8-gp39 sulieto baltymo (sgp39). Surištas sgp39 buvo nustatytas toliau inkubuojant ląsteles su FITC žymėtu anti-mCD8 mAb ir analizuojant ląsteles FACScan. Procentinė inhibicija buvo apskaičiuota padalinant inkubuotų su antikūnu mėginių vidutinę fluorescenciją iš pirmojo inkubavimo mėginių be antikūno vidutinės fluorescencijos (fig. 1).
[0056] Kaip parodyta fig.1, kiekvienas iš šių keturių mAb galėjo pilnai inhibuoti sgp39 sulieto baltymo prisijungimą prie žmogaus B ląstelių linijos, ekspresuojančios didelius kiekius CD40, nors 2.174 atveju pilnai blokadai reikia daug antikūno. Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant žmogaus tonzilines B ląsteles. Šie duomenys buvo lygiagretūs pagal du funkcinius testus. Pirmiausia, buvo parodyta, kad kiekvienas mAb galėjo pilnai blokuoti sgp39 tarpininkaujamą žmogaus tonzilinių B ląstelių kostimuliavimą. Antra, kiekvienas iš jų aiškiai inhibavo IgG ir IgM produkciją nuo T ląstelių priklausomą B ląstelių antikūnų irt vitro sintezės teste.
[0057] Trys iš šių keturių antikūnų parodė ribotą sugebėjimą kostimuliuoti B ląstelių proliferaciją esant anti-lgM. Mab 2.220 turėjo labiausiai išreikštą sugebėjimą indukuoti silpną kostimuliacinį aktyvumą. Pridėjus anti-kapa lengvosios grandinės antikūno, naudojamo kryžmiškai sujungti šiuos anti-CD40 mAb, 2.36 įgavo žymų kostimuliacinį aktyvumą tuo tarpu kai kitų trijų antikūnų aktyvumas buvo nepaveiktas. Buvo parodyta, kad G28-5 kostimuliacinė geba, kai jis suporuojamas derinyje su kiekvienu iš šių keturių naujųjų antikūnų yra moduliuojama skirtingai. Mab 1.66 ir ypatingai 2.174 stiprina G28-5 kostimuliaciją tuo tarpu kai 2.220 ir 2.36 - ją silpnina.
[0058] Atlikus atranką paremtą žmogaus sistemų įvertinimu in vitro, šių keturių anti-CD40 mAb tinkamumas buvo toliau tiriamas in vivo, įvertinant juos tyrimuose su primatais (ne žmonėmis). Du pagrindiniai analizės klausimai buvo: kiekvieno iš jų prisijungimo prie primatų B ląstelių santykinis stiprumas ir nuo T ląstelių priklausomos B ląstelių antikūnų sintezės slopinimas in vitro. Buvo rasta, kad visi keturi mAb kryžmiškai susijungė su šunbeždžionės makakos ( Macaca fascicularis) B ląstelėmis. 2.36 ir 2.220 jungėsi smarkiau nei 2.174 ir 1.66. Žemesnis stebimas 2.174 ir 1.66 mAb susijungimas buvo ne dėl jų skirtingų izotipų kadangi kitą izotipą atitinkantys anti-CD40 mAb rodė surišimo lygius, artimus 2.36 ir 2.220 (pvz. G28-5 ir 2.118). Šie rezultatai prieštaravo rezultatams, gautiems su žmogaus B ląstelėmis, kur kiekvienas iš šių mAb parodė panašų surišimą. Buvo rasta, kad šių keturių mAb beždžionių B ląstelių vykdomos antikūnų sintezės slopinimo geba yra lygiagreti susijungimo gebai.
[0059] Norint įvertinti anti-CD40 kaip imunosupresinio agento tinkamumą ir parinkti atitinkamą antikūną tolesniems tyrimams, buvo atlikti du bandymai su primatais (ne žmonėmis), naudojant pelės anti-žmogaus CD40 mAb. Pirmiausia buvo palygintas šių keturių atrinktų anti-CD40 mAb in vivo klirensas ir ūmus toksiškumas. Šie rezultatai buvo panaudoti dviem antikūnams - 2.36 ir 2.220 - atrinkti, kurie po to buvo tirti antrajame bandyme, skirtame antikūno atsako į T-priklausantį antigeną inhibicijos efektyvumo ir ūmaus toksiškumo įvertinimui.
[0060] Remiantis ankstesniais duomenimis, buvo nustatytas 2.36 ir 2.220 mAb sugebėjimas slopinti T-priklausomą antikūninį atsaką po intraveninio [vedimo šunbeždžionėms. Šis tyrimas buvo padalintas į tris fazes (fig.2). I fazėje keturios grupės, susidedančios iš 1 arba 2 šunbeždžionių patinų ir 2 patelių, buvo imunizuojamos 1-ą dieną kiekvienai beždžionei suleidžiant į veną avies eritrocitų (SRBC), po to 1-ą 3-ą ir 5-ą dieną veikiama 20 mg/kg mAb 2.36, 2.220, 1.106 (lgG1 pelės anti-žmogaus gp39, teigiama kontrolė) arba L6 (lgG2a pelės anti-žmogaus auglio antigenas, neigiama kontrolė). Buvo nustatoma IgM ir IgG titrai SRBC imunogenui, tiriamųjų ir kontrolinių agentų kiekiai serume, anti-testinių ir kontrolinių agentų antikūnų buvimas, imunoglobulinų kiekiai serume, periferinio kraujo leukocitų skaičius ir periferinio kraujo limfocitų įvairių subpopuliacijų dažnis. II fazėje, kai kontroliniai ir tiriamieji agentai pasišalino iš organizmo, gyvūnai buvo imunizuoti SRBC ir antruoju antigenu - sraigės limfos hemocianinu (KLH) - imunologinės tolerancijos indukcijos ir stebėtos imunosupresijos įvertinimui. III fazėje parinkti gyvūnai buvo vėl imunizuoti, norint nustatyti, ar iš pradžių nuslopintas anti-SRBC antikūno atsakas vėl atsirado po papildomo iššaukimo SRBC, ir norint įvertinti antrinį antikūno atsaką į KLH.
[0061] Buvo atliktas bandymas, norint parodyti, kad mAb 2.220 žymiai slopina pirminį antikūno atsaką į SRBC (fig.3). Beždžionės buvo veikiamos 20 mg/kg vieno iš 1.106, L6, 2.36 arba 2.220 mAb l-je fazėje 1-ą 3-ą ir 5-ą dieną. Beždžionės buvo imunizuojamos SRBC 1-ą I, II ir III fazės dieną. Fig.3a parodyti serumo mėginių rezultatai, kuriuose buvo nustatomi IgM anti-SRBC antikūnai; fig. 3b parodyti serumo mėginių rezultatai, kuriuose buvo nustatomi IgG anti-SRBC antikūnai. Duomenys buvo išreikšti anti-SRBC titro geometriniu vidurkiu kiekvienai grupei (n=3 arba 4).
[0062] Maksimalus pirminis atsakas buvo inhibuotas 85 % ir 98 % atitinkamai IgM ir IgG. Po mAb 2.220 pasišalinimo iš serumo žemiau nustatomų kiekių, maksimalus antrinis atsakas į SRBC dar buvo inhibuotas 79 % ir 56 % atitinkamai IgM ir IgG, lyginant su neigiamos kontrolės atsaku I fazėje. Priešingai, teigiamos kontrolės (mAb 1.106) atveju buvo stebėtas stiprus antrinis antikūno atsakas į SRBC. Tretinis atsakas į SRBC nebuvo inhibuojamas, kas rodo, kad mAb 2.220 indukuoja ilgai trunkančią imunosupresiją bet ne imunologinę toleranciją. Visi KLH imunizuoti gyvūnai davė pirminį ir antrinį anti-KLH atsaką kas duoda pagrindo teigti, kad ši imunosupresiją yra grįžtama. Gyvūnai, paveikti 2.36, nebuvo tiriami ll-je fazėje, kadangi žymios inhibicijos nebuvo stebėta l-je tyrimo stadijoje.
[0063] Vidutinės didžiausios koncentracijos serume, atsirandančios tuoj pat po paskutinės dozės, buvo 744 ir 405 jag/ml atitinkamai 2.220 ir 2.36 mAb. Mab 2.36 iš serumo pasišalino iki mažesnių nei nustatomi lygių 15-ą dieną tuo tarpu kai mAb 2.220 tik 29-ą dieną. Abu mAb (2.36 ir 2.220) buvo imunogeniniai.
[0064] Su vaistais susijusių klinikinių pastebėjimų kūno masės arba maisto sunaudojimo pokyčių arba hematologijos bei Ig kiekio serume pokyčių nepastebėta nei vienam gyvūnui. Vienintelis su vaistais susijęs pastebėtas duomuo buvo trumpalaikiai 70 % ir 43 % periferinių B ląstelių procentinio kiekio sumažėjimai atitinkamai 2.36 ir 2.220 mAb. B ląstelės atsistatė iki normalaus lygio per 2-3 savaites po gydymo.
[0065] Reziumuojant galima pasakyti, kad mAb 2.200 žymiai slopino antikūninį atsaką į SRBC, o 2.36 - neslopino. Nors mAb 2.200 sukėlė ilgalaikę antigenui specifinę imunosupresiją ji buvo grįžtama. Remiantis šiais duomenimis, mAb 2.200 buvo pasirinktas tolesniam tyrimui.
[0066] Norint nukreipti pelės anti-žmogaus mAb 2.220 imunogeniškumą buvo generuotos rekombinantinės formos, kuriose kintamosios sritys buvo prijungtos prie žmogaus pastoviųjų sričių, ir palygintas jų veiksmingumas in vitro. Dvi naudotos strategijos buvo: chimerinio antikūno, turinčio nepakeistas pelės kintamąsias sritis, gavimas ir humanizuotos formos, kuriose pelės hiperkintamosios sritys (CDR) yra įjungtos į žmogaus karkasines sekas su kintamomis sritimis. Chimeriniai antikūnai išlaiko pradinio antikūno antigenines prisijungimo savybes, bet gali turėti didesnę tikimybę būti imunogeniniais. Humanizuoti antikūnai turi mažesnę tikimybę būti imunogeniniais, bet humanizacijoje gautos mutacijos gali veikti antigeno prijungimą.
[0067] A. Chimeriniu ir humanizuotu antikūnu konstravimas ir charakterizavimas in vitro
[0068] PCR būdu buvo gautos VL ir VH sritys iš anti-CD40 mAb 2.220. kDNR buvo gauta iš RNR, išskirtos iš hibridomos, ekspresuojant 2.220 mAb, naudojant lgG1 -specifinį arba Cjc-specifinį antiprasminį pradmenį atitinkamai VH ir VL sritims gauti. Prie šių viengrandžių kDNR buvo pridėta poli-G uodega. Po to kintamosios sritys buvo amplifikuotos PCR būdu, prasminiu pradmeniu naudojant oligonukleotidą turintį poli-C seką komplementarią poli-G uodegai, ir įstatytą rinkinį antiprasminių pradmenų. Po to gautas PCR produktas buvo įterptas į bakterinį vektorių, naudojant į pradmenis įjungtas restrikcijos vietas. Po to buvo nustatytos įvairiarūšių klonų sekos, panaudojant dideoksinukleotidinį sekvenavimą. Buvo atlikti du nepriklausomi bandymai, pradedant nuo RNR stadijos, ir gautos sekos buvo tokios pačios.
[0069] Norint gauti chimerinę antikūno formą kintamosios sritys buvo amplifikuotos PCR būdu naudojant pradmenis, kurie įvedė seką koduojančią žmogaus antikūno signalinę seką artimiausiai atitinkančią 2.220 seką kaip parodyta 4 fig. Pabrauktos lengvosios grandinės kintamosios sekos (fig.4a) ir sunkiosios grandinės kintamosios sekos (fig.4b) dalys reiškia žmogaus antikūno su artimiausia homologija pelės 2.220 įterptas signalines sekas. Šie PRC produktai buvo įterpti į vektorių, turintį sekas, koduojančias pastoviąsias žmogaus kapa arba žmogaus y1 sritis, norint generuoti atitinkamai pilną lengvąją arba sunkiąją grandines. Vektoriuose taip pat buvo atitinkami atsparumo vaistui genai stabilių baltymą ekspresuojančių linijų generavimui ir amplifikavimui. Baltymas pradiniam charakterizavimui buvo pagamintas pereinamosios ekspresijos iš COS ląstelių būdu, po to baltymas A buvo gryninamas.
[0070] Kaip pavyzdys, chimerinį antikūną produkuojančių ląstelių linija buvo generuota kotransfekuojant CHO DG44 ląsteles atskirais ekspresijos vektoriais sunkiajai ir lengvajai chimerinio antikūno grandinei, o kointegracijos skatinimui buvo naudotas didelio kopijų skaičiaus elektroporacijos metodas.
[0071] (Žr. U.S. Patent 4,956,288). Chi220 sunkioji ir lengvoji grandinės buvo įklonuotos į atitinkamai pD17 ir pD16 ekspresijos vektorius. Abu vektoriai buvo pagaminti iš In Vitrogen plazmidės pcDNA3 ir turėjo tokias ypatybes (fig.12): (1) atsparumo neomicinui genas pcDNA3 buvo pakeistas pelės dihidrofolato reduktazės (DHFR) genu kontroliuojant nestiprinančiu SV40 promotoriumi (kuris dar vadinamas "susilpnintas DHFR"; atkreipkite dėmesį, kad tik promotorius yra susilpnintas, o ne DHFR fermentas - nestiprinantis promotorius dar turi SV40 replikacijos pradžią taigi šie vektoriai gali būti naudojami pereinamose COS transfekcijose); (2) dominantis genas yra ekspresuojamas iš CMV promotoriaus, o poliadenilinimo signalas yra iš jaučio augimo hormono geno; (3) dominančio geno ekspresijos kasetė yra flankuota transkripcijos baigmės sekomis (t.y. 5' prie promotoriaus ir 3' prie poli A vietos); (4) vektoriai turi dvi atskiras restrikcijos vietos polijunges - vieną 3' nuo promotoriaus dominančio geno klonavimui ir vieną 5' nuo promotoriaus vektoriaus ištiesinimui prieš transfekciją ir (5) atsparumo ampicilinui genas ir ColE1 kilmės plazmidei dauginti E. coli.
[0072] Naudoti sunkiosios ir lengvosios grandinės genai buvo genominės konstrukcijos, turinčios tokias modifikacijas: (1) sunkiosios grandinės signalinį peptidą koduojančios sekos, kintamoji sritis ir CH1 sritis buvo gretimos (t.y. nebuvo intronų); ir (2) lengvosios grandinės signalinį peptidą ir kintamąją sritį koduojančios sekos buvo gretimos.
[0073] Šiame išradime nagrinėjami ir kiti specialistams žinomi vektoriai, galintys ekspresuoti šio išradimo chimerinį antikūną. Nukleorūgšties seka, tinkanti ekspresijos vektoriui, galinčiam ekspresuoti šio išradimo chimerinio antikūno sunkiąją grandinę, yra parodyta fig. 13; nukleorūgšties seka, tinkanti ekspresijos vektoriui, galinčiam ekspresuoti šio išradimo chimerinio antikūno lengvąją grandinę, yra parodyta fig. 14.
[0074] Pilna šio chimerinio antikūno ("chi220") sunkiosios ir lengvosios grandinių, įskaitant kintamąją ir pastoviąją sritis, aminorūgščių seka yra tokia (paryškintos aminorūgštys rodo kintamąją sunkiąją ir kintamąją lengvąją grandines):
[0075] Buvo generuota keletas humanizuotų 220 formų. Šis procesas apima pelės ir žmogaus embrioninių sekų su artimiausia homologija VH ir VL sritims identifikavimu. Pelės embrioninės sekos buvo naudotos somatinių mutacijų kurios atsirado afininio brandinimo proceso metu, panašių padėčių identifikavimui. Po to kaip matrica buvo naudotos žmogaus sekos, ir sekos sritys, kurios yra žinomos arba įtariamos kaip esančios svarbios surišimo specifiškumui, yra pakeičiamos žmogaus sekose ir VH, ir VL. Po to šių sekų struktūros buvo modeliuojamos naudojant matrica artimiausios homologijos baltymą kurio kristalo struktūra buvo nustatyta. Humanizuotas formas koduojančios plazmidės buvo generuojamos, naudojant PCR kryptingą mutagenezę, ir naudojamos generuoti antikūnui pereinamos ekspresijos iš COS ląstelių būdu. In vitro testai buvo atliekami su šio išradimo chimeriniais ir humanizuotais antikūnais, ir rezultatai yra pavaizduoti fig.5. Fig.5a rodo surišimo bandymo rezultatus, tiriant chi220 ir h220v3 surišimą su hCD40-mG2b ELISA paremtame teste, lmmulon-2 plokštelių duobutės buvo padengtos hCD40-mG2b, imant 10 ng/ml koncentraciją PBS ir laikant 2 vai. Duobutės buvo blokuotos Specimen Diluent'u (Genetic Systems) ir pridedama nurodytų koncentracijų antikūnų. Po 1 vai. inkubavimo duobutės buvo perplautos ir antikūno buvimas nustatytas naudojant peroksidazės - ožkos anti-žmogaus IgG antikūno konjugatą. H220v3 yra humanizuota mAb 2.220 forma. Reikšmės yra dviejų duobučių reikšmių vidurkiai, o paklaidų atžymos atitinka standartinį nukrypimą.
[0076] Fig.5b parodyti sgp39-tarpininkaujamos žmogaus B ląstelių kostimuliacijos anti-žmogaus CD40 mAb inhibavimo tyrimo bandymo rezultatai. Ramybės būsenoje esančios žmogaus tonzilinės B ląstelės (50000 ląstelių/duobutei) buvo inkubuojamos su sgp39 sulietu baltymu, 20 pig/ml triušio anti-žmogaus IgM padengtų imunogranulių ir su nurodytų koncentracijų anti-CD40 mAb arba tik terpe kontrolei 96 duobučių plokštelėse. Praėjus 72 valandoms po auginimo pradžios, visos duobutės buvo apspinduliuotos 1 įj.Ci/duobutei [3H]timidino ir ląstelės auginamos dar 18 vai. Po to ląstelės surenkamos, o įsiterpęs [3H]timidinas išmatuojamas scintiliacijos skaičiuoklių.
[0077] Remiantis šiais in vitro tyrimais (fig.5a ir 5b, kuriose parodyta, kad ir chimerinis, ir humanizuotas antikūnas efektyviai rišasi su CD40 ir inhibuoja B ląstelių stimuliavimą), tolimesniems tyrimams buvo pasirinktas chimerinis antikūnas.
[0078] 3 pavyzdys
[0079] A. Chimerinis mAb 2. 220: vienkartinės dozės efektyvumo tyrimas bandyme su primatais ( ne žmonėmis)
[0080] Buvo įvertintas chi220 sugebėjimas slopinti pirminį ir antrinį humoralinį imuninį atsaką į T ląstelėms priklausančius antigenus bandyme su šunbeždžionėmis. Viename bandyme keturių beždžionių grupė buvo imunizuota avies eritrocitais (SRBC) ir gavo antrinę imunizaciją ovalbuminu (OVA) prieš pat gaunant intraveninę vienkartinę arba chi220 10, 40 arba 100 mg/kg dozę, arba kaip kontrolę sterilaus fosfatinio buferio su NaCI (PBS) dozę. Visos trys dozės davė žymų pirminio humoralinio imuninio atsako į SRBC slopinimą rodantį chi220 veiksmingumą primatuose. Visose chi220 paveiktose beždžionėse buvo stebėta nuo dozės priklausanti periferinio kraujo B ląstelių kiekio sumažėjimas, o jų atsistatymo laikas taip pat priklausė nuo dozės. Esant dviems aukščiausioms dozėms, buvo stebėtas trumpalaikis nedidelis periferinio kraujo T ląstelių vidutinio absoliutinio skaičiaus sumažėjimas grupėje. Buvo stebėti trumpalaikiai minimalūs IgM kiekio serume sumažėjimai, o susijusių su vaistu IgG arba IgA kiekių pokyčių serume pastebėta nebuvo.
[0081] Norint įvertinti imunologinės tolerancijos indukciją ir imunosupresinio aktyvumo grįžtamumą visos beždžionės buvo imunizuojamos OVA, SRBC ir neoantigenu - sraigės limfos hemocianinu (KLH) - 149-ą dieną kai chi220 kiekis 100 mg/kg grupėje buvo žemiau kiekio, kuris yra laikomas imunosupresiniu (~ 10 Įig/ml), o periferinio kraujo B ląstelių skaičius sugrįžo į prieš vaisto įvedimą buvusį lygį. Anti-SRBC atsakas, esant mažiausiai dozei, buvo paprastai panašus į pirminį anti-SRBC antikūno atsaką kontrolinėse beždžionėse. Tačiau antikūno atsakas į SRBC buvo dar dalinai arba gana nemažai nuslopintas beždžionėse, gavusiose dvi aukštesnes dozes.
[0082] Norint daugiau ištirti imunosupresijos ir B ląstelių kiekio sumažėjimo priklausomybę nuo dozės, buvo atliktas antras bandymas, kuriame kitos beždžionės (keturios beždžionės grupėje) buvo imunizuotos SRBC, po to gavo vienkartinę 0,1 arba 1,0 mg/kg chi220 dozę, arba PBS. Abiems dozėms buvo stebėta antikūninio atsako į SRBC suboptimali imunosupresija. Beždžionėse, gavusiose 1,0 mg/kg chi220, buvo stebėtas vidutinio lygio periferinio kraujo B ląstelių skaičiaus sumažėjimas, kuris atsistatė 29-ą dieną. Imant 0,1 mg/kg dozę, buvo stebėtas periferinio kraujo B ląstelių skaičiaus ir procentinio kiekio sumažėjimas, tačiau reikšmės neišėjo iš normalių istorinių B ląstelių procentinių ribų. Absoliutaus periferinio kraujo B ląstelių skaičiaus istorinės ribos nustatytos nebuvo. Trumpalaikis minimalus periferinio kraujo T ląstelių skaičiaus sumažėjimas ir nedidelis ex vivo T ląstelių proliferacijos sumažėjimas buvo stebėtas beždžionėms, kurios gavo 1 mg/kg chi220. Pagaliau, nebuvo nustatyta komplementinio aktyvavimo arba susijusių su vaistu IL-6 arba TNFa kiekio pokyčių serume. Ex vivo T ląstelių aktyvavimas, komplementinis aktyvavimas ir citokino kiekiai serume nebuvo tirti beždžionėse, gavusiose 10, 40 arba 100 mg/kg chi220.
[0083] Abiejuose bandymuose buvo tiriami serumo mėginiai po chi220 įvedimo, nustatant tiriamojo agento cirkuliuojančius kiekius ir tiriant antikūno prieš tiriamąjį agentą susidarymą. Farmakokinetinė analizė parodė, kad vidutinė didžiausia chi 220 koncentracija serume (Cmax) nedidėja proporcingu dozės inkrementui būdu, ir kad chi220 puslaikis pailgėja, kai padidinama įvesta dozė. Buvo rasta, kad chi220 yra imunogeninis, kai jo įvedama 0,1, 1 arba 10 mg/kg. Kai cirkuliuojančios koncentracijos yra didesnės nei 10p.g/ml, pasirodo, kad chi220 gali slopinti nukreiptą prieš jį antikūninį atsaką.
[0084] Aukščiau minėtame pradiniame tyrime šunbeždžionės buvo suskirstytos į keturias grupes, susidedančias iš dviejų patinėlių ir dviejų patelių kiekvienoje grupėje. Visos beždžionės buvo imunizuotos prieš 28 dienas nuo chi220 arba kontrolinio agento įvedimo OVA (5 mg/kg, im ir 10 mg/kg, sc). Pirmą dieną visos beždžionės buvo imunizuotos SRBC (10 % suspensijos 1,7 ml/kg, iv) ir gavo antrinę imunizaciją OVA (5 mg/kg, im ir *10 mg/kg, sc) prieš pat 10, 40 arba 100 mg/kg chi220 arba sterilaus PBS kaip kontrolės vienkartinės intraveninės dozės įvedimą. 149-ą dieną kai chi220 kiekis serume nukrito žemiau visuotinai priimtų imunosupresinių lygių (~10 ( ig/ml), o periferinio kraujo B ląstelių kiekiai sugrįžo į pradinį lygį visose grupėse, beždžionės buvo imunizuojamos OVA, SRBC ir KLH (10 mg/gyvūnui, im). KLH imunizavimo tikslas buvo parodyti, kad beždžionės gali duoti imuninį atsaką į neoantigeną po to, kai jos buvo paveiktos chi220.
[0085] Norint pademonstruoti geresnį dozės atsaką imunosupresijos ir periferinio kraujo B ląstelių kiekio sumažėjimo atžvilgiu, antrajame tyrime kitos beždžionės (po dvi vienos lyties grupėje) buvo imunizuotos SRBC, o po to 1 - ą dieną gavo vienkartinę arba 0,1, arba 1,0 mg/kg chi220 dozę, arba PBS kaip kontrolę. Pasirinktuose laiko taškuose abiejų eksperimentų metu buvo kontroliuojami hematologiniai parametrai ir periferinio kraujo limfocitų subpopuliacijos. Serumo cheminiai parametrai buvo nustatinėjami beždžionėms, gavusioms 10, 40 arba 100 mg/kg chi220, ir nebuvo nustatinėjami esant 0,1 ir 1 mg/kg dozėms, nes didesnių dozių atveju nebuvo stebėta su vaistais susijusių pokyčių. Be to, buvo matuojami IgM, IgG, IgA ir chi220 kiekiai serume. Veiksmingumo nustatymui specifinių IgM ir IgG antikūnų susidarymas prieš SRBC ir OVA imunogenus buvo nustatytas atitinkamuose serumo mėginiuose, paimtuose prieš pat imunogeno įvedimą ir kas savaitę po to. Specifinių IgM ir IgG antikūnų susidarymas prieš tiriamuosius agentus beždžionėse, kurios gavo chi220, buvo nustatytas prieš tiriamojo agento įvedimą 1 -ą dieną ir kas savaitė po to. Antikūnų atsakų tarp ' grupių palyginimui buvo naudotas geometrinis titrų vidurkis. Be to, buvo matuotas bendras hemolitinis komplementinis aktyvumas (CH50) ir C4d fragmento kiekiai, o TNF-a ir IL-6 kiekiai buvo nustatyti beždžionėse, kurios gavo 0,1 arba 1 mg/kg chi220 pasirinktuose laiko taškuose po chi220 įvedimo. Taip pat buvo nustatomas periferinio kraujo T ląstelių aktyvavimas ex vivo po stimuliavimo konkavalinu A beždžionėse, gavusiose 0,1 ir 1 mg/ml chi220 17-ą ir 31-ą dieną norint įvertinti chi220 efektus į T ląstelių sugebėjimą atsakyti į mitogeną. Be to, visos beždžionės kasdien buvo stebimos, ar neatsirado klinikinių toksiškumo požymių, kas savaitę matuojamas kūno svoris, o maisto sunaudojimas nustatomas kasdien.
[0086] Prieš gaunant tirpiklį arba 10, 40 arba 100 mg/kg chi220 (fig.6a), arba 0.1 arba 1 mg/kg chi220 (fig.6b), beždžionės buvo imunizuojamos SRBC 1-ą dieną. Serumo mėginiai buvo analizuojami nustatnt IgM anti-SRBC antikūnus ELISA. Duomenys išreikšti anti-SRBC antikūno galinio taško titro (EPT) geometriniu vidurkiu kiekvienai grupei (n=2 [100 mg/kg grupė po "15-os dienos] arba 4), kur EPT yra ekvivalentiškas didžiausio serumo praskiedimo, turinčio didesnę sugerti nei dviguba vidutinė plokštelės foninė sugertis, atvirkštiniam dydžiui.
[0087] Chi220, įvestas beždžionėms 10, 40 arba 100 mg/kg dozėmis, efektyviai slopino pirminį antikūninį atsaką į SRBC. Pirminio IgM anti-SRBC antikūninio atsako kontrolės didžiausios reikšmės dieną (8 diena), vidutinis pirminis IgM anti-SRBC antikūninis atsakas buvo nuslopintas maždaug 92-94 % beždžionėse, paveiktose 10, 40 ir 100 mg/kg chi220, lyginant su kontrolėmis (fig.6a). Grupės vidutinis IgM anti-SRBC antikūninis atsakas netapo teigiamu iki 85-os dienos, esant 10, 40 arba 100 mg/kg dozėms. Pirminio IgG anti-SRBC antikūninio atsako kontrolės didžiausios reikšmės dieną (15 diena), vidutinis pirminis IgG anti-SRBC antikūninis atsakas buvo nuslopintas 98 %, 99 % ir 85 % beždžionėse, kurios gavo atitinkamai 10, 40 ir 100 mg/kg chi220, lyginant su kontrolėmis (fig.7a). Didesni bendri prieš dozės gavimą anti-SRBC antikūnų titrai 100 mg/kg grupėje gali paaiškinti stebimą imunosupresijos nepriklausomybę nuo dozės. Bendrai imant, beždžionės, paveiktos 10 arba 100 mg/kg chi220, nerodė pirminio IgG anti-SRBC antikūninio atsako 85-ą dieną. Tačiau dvi iš paveiktų 40 mg/kg chi220 beždžionių turėjo uždelstą pirminį IgG antikūninį atsaką į SRBC (jo dydis buvo panašus į kontrolinį), kuris pasidarė teigiamu 36-ą dieną ir pasiekė maksimumą 51-ą dieną.
[0088] 149-ą dieną kai chi220 kiekiai serume nukrito žemiau pripažintų imunosupresinių kiekių (-10 |ig/ml), o periferinio kraujo B ląstelių kiekiai grįžo į prieš dozės įvedimą buvusį lygį, beždžionės buvo imunizuotos antrą kartą SRBC. Kaip ir buvo laukta, kontrolinės beždžionės rodė stiprų antrinį IgG antikūninį atsaką į SRBC. Beždžionės, paveiktos 10 mg/kg chi220, rodė pirminį IgM ir IgG antikūninį atsakus į SRBC, kurie buvo iš esmės panašūs į pirminį antikūninį ataską kontrolinėse beždžionėse. Tačiau antikūninis atsakas į SRBC buvo dalinai nuslopintas esant 40 mg/kg dozei ir stipriai nuslopintas esant 100 mg/kg dozei. Nors dvi beždžionės, paveiktos 40 mg/kg chi220 doze, kurios anksčiau rodė silpnus pirminius antikūninius atsakus į SRBC, išvystė IgM ir IgG anti-SRBC antikūnų titrus, būdingus antriniam antikūniniam atsakui, anti-SRBC antikūniniai atsakai kitose dviejose šios grupės beždžionėse ir likusiose 100 mg/kg chi220 doze paveiktose beždžionėse dar buvo maždaug 90 % nuslopinti, lyginant su kontrolinių beždžionių vidutiniu pirminiu anti-SRBC antikūniniu atsaku.
[0089] Antikūninio atsako į SRBC suboptimali imunosupresija buvo stebėta po 0,1 arba 1,0 mg/kg chi220 įvedimo (fig. 6b ir 7b). Nors visos chi220 paveiktos beždžionės rodė teigiamą IgM antikūninį atsaką į SRBC antigeną bendras vidutinis maksimalus IgM anti-SRBC antikūninis atsakas buvo nuslopintas maždaug 56 % beždžionėse, paveiktose 1 mg/kg chi220, lyginant su vidutiniu maksimaliu kontroliniu atsaku. Beždžionėse, paveiktose 0,1 mg/kg chi220 doze, IgM anti-SRBC antikūninio atsako slopinimo nebuvo pastebėta. Vidutinis IgM anti-SRBC antikūninis atsakas pasiekė maksimumą 15-ą dieną kontrolinėse beždžionėse, ir 8-ą dieną beždžionėse, kurios gavo 0,1 ir 1,0 mg/kg chi220. Bendrai imant, vidutinis maksimalus IgG anti-SRBC antikūninis atsakas buvo nuslopintas 56 % ir 42 % atitinkamai 0,1 ir 1,0 mg/kg chi220 paveiktose beždžionėse. Vidutinis IgG anti-SRBC antikūninis atsakas pasiekė maksimumą 15-ą dieną kontrolinėse beždžionėse ir 1 mg/kg chi220 doze paveiktose beždžionėse, ir 8-ą dieną beždžionėse, kurios gavo 0,1 mg/kg chi220.
[0090] Beždžionėms buvo suleista intraveninė 10, 40 arba 100 mg/kg chi220 dozė 1-ą dieną. Be to, 28-ą 1-ą ir 149-ą dieną visos beždžionės buvo imunizuotos OVA. Buvo analizuojami serumo mėginiai, nustatant IgM (fig.8a) arba IgG (fig.8b) anti-OVA antikūnus. Duomenys išreikšti kaip anti-OVA galinio taško titro (ETP) geometrinis vidurkis kiekvienai grupei (n=2 [100 mg/kg grupei po 15-os dienos] arba 4), kur EPT yra ekvivalentiškas didžiausio serumo praskiedimo, turinčio didesnę sugertį nei dviguba vidutinė plokštelės foninė sugertis, atvirkštiniam dydžiui.
[0091] Specifinių IgM ir IgG antikūnų atsiradimas prieš OVA tyrimo metu buvo kontroliuojamas kas savaitę beždžionėse, kurios gavo 10, 40 arba 100 mg/kg chi220. Pirminis ir antrinis anti-OVA antikūniniai atsakai buvo labai kintami ir paprastai silpni visose beždžionėse (fig.8). Beždžionės, kurios gavo chi220 1 -ą dieną turėjo didesnius anti-OVA antikūnų titrus nei kontrolinės grupės beždžionės.
[0092] 149-ą dieną beždžionės gavo tretinę OVA imunizaciją. Visos beždžionės rodė teigiamus IgG antikūninius atsakus į OVA 7 dienų laikotarpyje po paveikimo. Kontrolinės beždžionės ir beždžionės, gavusios 10 mg/kg chi220 dozę, turėjo antikūnų titrus, būdingus tretiniam antikūniniam atsakui, o beždžionės, paveiktos 40 arba 100 mg/kg chi220, rodė antikūnų titrus, kurie buvo būdingesni antriniam antikūniniam atsakui.
[0093] Beždžionėms buvo suleista intraveninė 10, 40 arba 100 mg/kg chi220 dozė 1-ą dieną. Be to, 149-ą dieną visos beždžionės buvo imunizuotos KLH. Buvo analizuojami serumo mėginiai, nustatant IgM (fig.8a) arba IgG (fig.8b) anti-KLH antikūnus. Duomenys buvo išreikšti kaip anti-KLH galinio taško titro (ETP) geometrinis vidurkis kiekvienai grupei (n=2 [100 mg/kg grupei po 15-os dienos] arba 4), kur EPT yra ekvivalentiškas didžiausio serumo praskiedimo, turinčio didesnę sugertį nei dviguba vidutinė plokštelės foninė sugertis, atvirkštiniam dydžiui.
[0094] 149-ą dieną kai chi220 kiekiai serume nukrito žemiau pripažintų imunosupresinių kiekių (~10 |ig/ml), o periferinio kraujo B ląstelių kiekiai grįžo
[0095] į prieš dozės įvedimą buvusį lygį, beždžionės buvo imunizuotos KLH (10 mg/gyvūnui, im). Visos beždžionės rodė teigiamus IgM ir IgG antikūninius atsakus į KLH, kas rodo, kad sugebėjimas atsakyti į naują antigeną nebuvo pažeistas (fig.9).
[0096] d. Tiriamojo agento kiekiai serume ir anti-tiriamojo agento antikūno atsakas
[0097] Po chi220 įvedimo buvo tiriami serumo mėginiai, norint nustatyti tiriamojo agento cirkuliuojančius kiekius ir įvertinti antikūnų prieš tiriamąjį agentą susidarymą. Vidutinės maksimalios chi220 koncentracijos (Cmax) serume atsirado praėjus 3 minutėms po 10 arba 40 mg/kg dozių įvedimo ir praėjus 6 valandoms po 100 mg/kg dozės įvedimo. Chi220 Cmax reikšmės buvo 329, 2429 ir 2343 ng/ml beždžionėms, paveiktoms atitinkamai 10, 40 arba 100 mg/kg chi220. Tačiau buvo žymūs Cmax reikšmių skirtumai tarp atskirų beždžionių 40 ir 100 mg/kg grupėse. Buvo nustatyta, kad vidutinis chi220 puslaikis serume yra apytikriai 114, 173 ir 315 valandų beždžionėms, paveiktoms atitinkamai 10, 40 arba 100 mg/kg chi220.
[0098] Vidutinės Cmax reikšmės, atsiradusios praėjus trims minutėms po chi220 įvedimo, buvo 1,77 ir 33 Įig/ml atitinkamai 0,1 ir 1 mg/kg dozėms. Kiekvienos dozės atveju nebuvo pastebėta chi220 kiekio serume skirtumų priklausomai nuo lyties. Vidutinės AUCirtf reikšmės buvo 15,5 ir 847 ng.val/ml atitinkamai 0,1 ir 1 mg dozėms. Bendrai paėmus, šie tyrimai rodo, kad chi220 puslaikis pailgėja padidinus įvedamą dozę. Be to, chi220 Cmax didėja neproporcingu dozės inkrementui būdu.
[0099] Nors IgM anti-tiriamasis agentas atsakas buvo minimalus arba jo išvis nebuvo beždžionėse, gavusiose 10, 40 arba 100 mg/kg chi220, žymus IgG anti-tiriamasis agentas atsakas buvo stebimas beždžionėse, kurios gavo 10 mg/kg chi220. Vidutinis IgG anti-tiriamojo agento antikūninis atsakas beždžionėse, kurios gavo 10 mg/kg chi220, pasidarė teigiamas 29-ą dieną maždaug po 1 savaitės, kai vidutinė grupės chi220 koncentracija serume nukrito žemiau 10 ng/ml, ir pasiekė maksimumą 36-ą ir 43-ą dieną titro geometriniam vidurkiui esant 12627. IgG anti-tiriamojo agento antikūnų pasirodymas beždžionėse, kurios buvo paveiktos 10 mg/kg chi220, taip pat sutapo su pirmuoju aptinkamu B ląstelių skaičiaus padidėjimu po išsekimo. Paskutinę matavimo dieną (149-ą) beždžionėse, kurios gavo 40 arba 100 mg/kg chi, dar neatsirado teigiamo antikūninio atsako prieš chi220, nors grupė vidutiniai chi220 kiekiai serume buvo mažesni už 10 |ig/ml 57-ą dieną
[0100] Chi220 buvo imunogeninis, kai jo buvo įvedama 0,1 arba 1 mg/kg. Tyrimo eigoje 3 iš 4 beždžionių, gavusių arba 0,1, arba 1 mg/kg chi'220, turėjo silpnus teigiamus IgM anti-tiriamojo agento antikūninius atsakus 15-ą dieną. Trys iš 4 beždžionių, paveiktų 1 mg/kg chi220, turėjo žymų IgG anti-tiriamojo agento antikūninius atsakus 22-ą dieną galutinio taško titro geometriniam vidurkiui esant 16618. Bendrai imant, geometrinis vidutinis IgG anti-tiriamojo agento antikūninis atsakas nebuvo teigiamas beždžionėse, kurios gavo 0,1 mg/kg chi220, ir tik viena beždžionė, kuri gavo 0,1 mg/kg chi220, turėjo silpną teigiamą IgG anti-tiriamojo agento antikūninį atsaką galutinio taško titro maksimumui esant 2430 22-ą dieną. Susumavus šiuos rezultatus, galima matyti, kad chi220 gali slopinti antikūninį atsaką prieš save patį, kai jo kiekiai serume yra didesni nei maždaug 10 ng/ml.
[0101] Mab humanizuoti buvo naudojami įvairūs šioje srityje žinomi būdai. Buvo įrodyta, kad yra naudingos struktūra paremtos strategijos, bet sudėtingumas, kylantis iš didelio skaičiaus karkaso liekanų kurios gali dalyvauti surišime, sumažina sėkmės tikimybę. Vietoj to, kad modeliavimo būdu būtų numatytas optimalus karkasas, žemiau aprašyta antikūnų bibliotekos strategija leidžia identifikuoti aktyvias karkaso konformacijas, remiantis daugelio kombinacijų atrinkimu. Mutagenezės strategijos, sujungtos su selekcijos metodais, leidžia išanalizuoti daugelį variantų ir imituoja in vivo brendimo procesus (reziumuota Marks, J.D., et al., (1992) J. Biol. Chem.
[0102] 267:16007-16010). Mutagenezė kodonų pagrindu leidžia sukonstruoti bibliotekas, kurios charakterizuoja konkrečių liekanų įnašą ir todėl yra efektyvesnė nei atsitiktinės mutagenezės strategija. Pavyzdžiui, linkusi į klaidas PCR negali būti naudojama žemiau aprašytų suderinamų karkasų bibliotekų sintezei. Be to, atsitiktinė mutagenezė sukuria platesnes labai įvairias bibliotekas ir, deja, dauguma mutacijų nestiprina mAb surišimo aktyvumo. Taigi, norint identifikuoti aktyvius variantus, reikia atrinkti labai daug klonų.
[0103] Žmogaus mAb išskirti iš fagų ekspozicijos bibliotekos dvistadijiniu būdu buvo panaudota strategija, vadinama "valdoma selekcija", kurioje kaip matrica naudojami graužikų mAb (Jespers, L.S., et ai., (1994) Bio/ Technology 12:899-903). Neseniai buvo aprašytas valdomos selekcijos, naudojant fagų ekspozicijos technologijas, variantas, kuriame chimerinis Fd fragmentas buvo panaudotas L grandinei atrinkti iš bibliotekos, turinčios žmogaus L grandines su implantuotu pelės CDR3 (Rader, C., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915). Po to aktyviausia L grandinė buvo panaudota H grandinei atrinkti iš žmogaus H grandinių bibliotekos, turinčios pelės HCDR3. Pagal šias strategijas išskirti mAb yra pilnai žmogaus (Jespers, supra) arba daugiausia žmogaus (Rader, supra), bet kiekvienoje proceso stadijoje įvesta antikūnų įvairovė reikalauja panaudoti afiniškumo praturtinimo metodus.
[0104] Šio išradimo humanizuotiems anti-CD40 antikūnams F4 ir L3:17 generuoti buvo naudojamos tokios medžiagos ir metodai.
[0105] Remiantis anti-CD40 pelės mAb2.220 seka buvo susintetinti ir išgryninti persidengiantys oligonukleotidai, koduojantys VH ir VL (69-75 bazių ilgio). Kintamosios H ir L sritys buvo susintetintos atskirai, sumaišant 25 pmol kiekvieno iš persidengiančių oligonukleotidų su Pfu DNR polimeraze (Stratagene) 50 įiI PCR reakcijoje, susidedančioje iš 5 ciklų: denatūracijos 94 °C temperatūroje 20 sek., renatūracijos 50 °C temperatūroje 30 sek., temperatūros kėlimo iki 72 °C per 1 min. ir išlaikymo 72 °C temperatūroje 30 sek. Po to renatūracijos temperatūra buvo pakelta iki 55 °C 25 cikluose. Atbulinis pradmuo ir biotinilintas priešakinis pradmuo buvo naudoti tolimesnei 1įjJ sulieto produkto amplifikacijai 100 jai PCR reakcijoje, naudojant tą pačią programą. Produktai buvo išgryninti agarozės gelio elektroforeze, elektroeliuuoti ir fosforilinti T4 polinukleotidine kinaze (Boehringer Mannheim), o po to inkubuoti su streptavidino magnetinėmis granulėmis (Boehringer Mannheim) 5 mM Tris-CI, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1M NaCI ir 0,05 % Tween 20 15 min. 25 °C temperatūroje. Granulės buvo perplautos, ir nebiotinilinta minusinės grandinės DNR buvo išplauta inkubuojant su 0,15 M NaOH 25 °C temperatūroje 10 minučių. Chimerinis anti-CD40 Fab buvo susintetintas modifikuotame M131X104 vektoriuje (Kristensson, K., et al.,
[0106] (1995) Vaccines 95, pp. 39-43, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), pavadintame M13IX104CS, hibridizacinės mutagenezės būdu (Rosok, M.J., et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618; Kunkel, T.A.
[0107] (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492) naudojant VH ir VL oligonukleotidus uridinilinto vektoriaus matricos trigubame moliniame pertekliuje. M131X104 vektorius buvo modifikuojamas pakeičiant cisteino liekanas kapa gale, o y1 pastoviąsias sritis - serinu. Reakcijos produktai buvo elektroporuoti į DH10B kiuvetes ir titruoti panaudojant XL-1 mėlio plokštelę.
[0108] 1. Sudėtinio karkaso ir karkaso/ CDR3 bibliotekų sukūrimas
[0109] Sudėtinio karkaso biblioteka (Hu I) buvo susintetinta tuo pačiu metodu, kuris buvo naudojamas chimeriniam anti-CD40 sukurti, su modifikacijomis. Buvo susintetinti persidengiantys oligonukleotidai, koduojantys žmogaus matricos H ir L kintamųjų sričių karkaso sritis ir pelės anti-CD40 CDR, kaip aprašė Kabat et al. (Kabat, E.A., et al., (1991) Sequencies of proteins of immunological interest (5th Ed), VVashington DC: United States Department of Health and Human Services; Kabat, E.A., et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616). Buvo susintetinti išsigimę oligonukleotidai, koduojantys ir pelės, ir žmogaus aminorūgštis septintoje VH ir pirmoje VK karkaso padėtyje (fig. 15, žvaigždute pažymėtos liekanos).
[0110] Karkasas/HCDR3 (Hu II) ir karkasas/HCDR3/LCDR3 (Hu III) bibliotekos buvo susintetintos tokiu pačiu būdu, kaip ir sudėtinio karkaso biblioteka, su modifikacijomis. Mutagenezei parinktos CDR liekanos buvo: Ser^-Tyr102 HCDR3'e ir Gln^-Thr97 LCDR3'e (fig.15, pabraukta). Oligonukleotidai, koduojantys HCDR3 ir LCDR3, buvo sukurti tokie, kad duotų mutaciją vienoje CDR liekanoje, ir buvo susintetinti įvedant NN(G/T) kiekvienoje padėtyje, kaip yra aprašyta (Glaser, S.M., et ak, (1992) J. Immunol. 149:3903-3913). Persidengiantys nukleotidai, koduojantys karkaso bibliotekos ir ne bibliotekos pelės CDR, buvo sumaišyti su 25 pmol oligonukleotidų koduojančių mutacijas turintį HCDR3, arba su 25 pmol kiekvieno iš oligonukleotidų, koduojančių mutacijas turinčius HCDR3 ir LCDR3.
[0111] Hu II ir Hu III bibliotekos iš pradžių buvo atrenkamos pagal modifikuotą specialistams žinomą zonų perkėlimo strategiją vadinamą imobilizavimo liftu (VVatkins, J.D., et al., (1998) Anai. Biochem. 256:169-177). Trumpai tariant, nitroceliulioziniai filtrai (82 mm) buvo padengti ožkos anti-žmogaus kapa, blokuoti 1 % BSA ir uždėti ant agaro plokštelės, turinčios fagu infekuotų bakterijų zoną. Pradiniam atrinkimui plokštelė buvo padengta fagais, imant 105 fagų/100 mm plokštelei. Imobilizavus fagų ekspresuotus anti-CD40 varianto Fab, filtrai buvo inkubuoti 3 vai. 25 °C temperatūroje su 5 ng/ml CD40-lg PBS, turinčiame 1 % BSA. Filtrai buvo perplauti keturis kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tween 20, ir inkubuoti su ožkos anti-pelės lgG 2b-šarminės fosfatazės konjugatu (Southern Biotechnology), 3000 kartų praskiestu PBS, turinčiu 1 % BSA, 1 vai. 25 °C temperatūroje. Filtrai buvo perplauti keturis kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tween 20, ir išryškinti kaip aprašyta (VVatkins
[0112] (1998), supra). Atskirų klonų išskyrimui buvo išrinktos teigiamos zonos iš pradinio atrinkimo, padengtos imant mažesnį tankį (<103 fagų/100 mm plokštelei) ir atrinktos pagal tą pačią strategiją.
[0113] Hu I sudėtinė biblioteka buvo pirmiausia atrinkta ELISA metodu, kuris leidžia greitai įvertinti variantų santykinius afiniškumus (VVatkins, J.D., et al.,
[0114] (1997) Anai. Biochem. 253:37-45). Be to, ELISA buvo naudota charakterizuoti klonams, identifikuotiems imobilizavimo lifto atrinkimo būdu. Trumpai tariant, mikrotitro plokštelės buvo padengtos 5 ng/ml ožkos anti-žmogaus kapa (Southern Biotechnology) ir blokuotos 3 % BSA PBS. Po to plokštelė buvo inkubuojama su 50 įiI Fab iš Escherichia colli kultūros nuopilo arba iš ląstelių lizato 1 vai. 25 °C temperatūroje, plaunama tris kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tween 20, ir 0,1 |ig/ml CD40-Ig PBS, turinčiame 1 % BSA, 2 vai. 25 °C temperatūroje. Plokštelė buvo plaunama tris kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tvveen 20, pridedama ožkos anti-pelės lgG2b-šarminės fosfatazės konjugato, praskiesto 3000 kartų PBS, turinčiu 1 % BSA ir laikoma 1 vai. 25 °C temperatūroje. Plokštelė buvo perplauta tris kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tvveen 20, ir išryškinta kaip aprašyta (VVatkins (1997), supra).
[0115] Buvo išskirtos viengrandės DNR ir nustatytos šio išradimo humanizuotų antikūnų genų H ir L grandinių kintamosios sritys, panaudojant fluorescencinį dinukleotidinės baigmės metodą (Perkin-Elmer, Foster City,
[0116] CA).
[0117] Humanizuoto antikūno F4 kintamosios lengvosios grandinės nukleorūgšties (SEQ ID NO:7) ir aminorūgščių (SEQ ID NO:8) sekos yra tokios:
[0118] Kai kurie Fab buvo įklonuoti į ekspresijos vektorių kontroliuojant arabinozės reguliuojamam BAD promotoriui. Be to, -šešių histidinų tag buvo prijungtas prie H grandinės karboksi-galo, kad būtų galima gryninti naudojant nikelio chelatus sudarančias dervas. Išgryninto Fab kiekis buvo nustatytas kaip aprašyta (VVatkins (1997), supra).
[0119] Immulon II mikrotitro plokštelės buvo padengtos 0,1 |j.g/ml CD40-lg PBS, laikant 16 vai. 4 °C temperatūroje ir blokuotos 3 % BSA PBS. Šios plokštelės buvo perplautos tris kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tween 20, o iš periplazminės erdvės išsilaisvinęs Fab buvo praskiestas serijiniu būdu tris kartus PBS, turinčiu 1 % BSA, ir inkubuotas plokštelėje 2 vai. 25 °C temperatūroje. Po to plokštelė buvo plaunama keturis kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tween 20, ir antkūno prisijungimas buvo nustatytas inkubuojant su ožkos anti-žmogaus kapa-šarminės fosfatazės konjugatu, praskiestu 2000 kartų PBS, turinčiu 1 % BSA ir laikoma 1 vai. 25 °C temperatūroje. Plokštelė buvo plaunama keturis kartus PBS, turinčiu 0,1 % Tvveen 20, ir išryškinta kalorimetriškai (Watkins (1997), supra).
[0120] Norint nustatyti šių variantų ligando surišimo inhibavimą Immulon II mikrotitro plokštelės buvo padengtos 2 (ig/ml anti-pelės CD8 sgp39 surišti sulietam baltymui, kuris ekspresuoja CD8 sritį. Plokštelės buvo perplautos vieną kartą PBS, turinčiu 0,05 % Tvveen 20, ir blokuotos 3 % BSA tirpalu PBS. Plokštelė buvo vieną kartą perplauta PBS, turinčiu 0,05 % Tvveen 20, ir inkubuota su ląstelių auginimo terpe, prisotinta sgp39, 2 vai. 25 °C temperatūroje. Nesurištas sgp39 buvo nusiurbtas, o plokštelė perplauta du kartus PBS, turinčiu 0,05 % Tvveen 20. Po to buvo pridėta 25 (ai išgrynintų Fab variantų, praskiestų serijiniu būdu 3 kartus PBS, o po to 25 |il 4 pig/ml koncentracijos CD40-žmogaus Ig tirpalo PBS. Plokštelės buvo inkubuotos 2 vai. 25 °C temperatūroje ir plautos tris kartus PBS, turinčiu 0,05 % Tween 20. Surištas CD40-lg buvo nustatytas po 1 vai. inkubavimo 25 °C temperatūroje su ožkos F(ab') 2 anti-žmogaus IgG Fcy-specifiniu krienų peroksidazės konjugatu (Jackson), praskiestu 10000 kartų PBS. Plokštelė buvo perplauta keturis kartus PBS, turinčiu 0,05 % Tvveen 20, ir sujungimo kiekis nustatytas kolorimetriškai, inkubuojant su 1 mg/ml o-fenilendiamino dihidrochlorido ir 0,003 % vandenilio peroksidu 50 mM citrinos rūgštyje, 100 mM Na2HP04, pH 5. Reakcija buvo stabdoma pridedant H2S04 iki 0,36 M galutinės koncentracijos ir nustatomas optinis tankis esant 490 nm bangos ilgiui. 7. BlAcore analizė
[0121] Sąveikos tarp CD40 ir anti-CD40 variantų kinetinės konstantos buvo nustatytos paviršiaus plazmonų rezonanso būdu (BlAcore). CD40-lg sulietas baltymas buvo imobilizuotas ant 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimido hidrochloridu ir N-hidroksisukcinimidu aktyvuoto sensoriaus dalies CM5, [leidžiant 8 jj. I 10 Įig/ml koncentracijos CD40-lg 10 mM natrio acetate, pH 4. CD40-lg buvo imobilizuotas naudojant nedidelį tankį (-150 RU), kad būtų apsisaugoma nuo Fab grįžtamo susirišimo disociacijos fazės metu. Asociacijos greičio konstantoms (k™) gauti buvo nustatyti susirišimo greičiai, esant šešioms skirtingoms Fab koncentracijoms 25-600 nM intervale PBS tirpale, kai srauto greitis buvo 20 pil/min. Disociacijos greičio konstantos ( koff) buvo šešių matavimų vidurkis, gautas analizuojant disociacijos fazę. Sensogramos buvo analizuotos BIAevaluation 3.0 programa. Kd buvo išskaičiuota iš Kd = kodK*. Likęs Fab buvo pašalintas po kiekvieno matavimo, pasinaudojant ilgalaike disociacija.
[0122] Humanizuotų antikūnų F4 ir L3.17 kinetinės analizės rezultatų palyginimas su chimeriniu Fab parodytas toliau duodamoje 1 lentelėje.
[0123] Kaip aukščiau minėta, pelės anti-CD40 mAb kintamosios srties karkaso sekos buvo naudotos labiausiai homologiškų žmogaus embrioninių sekų identifikavimui. H grandinės karkaso liekanos buvo 74 % identiškos žmogaus embrioninės linijos VH7 (7-4.1) ir JH4 sekoms, o L grandinė buvo 75 % identiška atitinkamoms žmogaus embrioninės linijos VKIII (L6) ir JK4 sekoms. H ir L grandinių kintamųjų sekų sugretinimas parodytas fig.15. CDR liekanos, apibūdinos Kabat et al. (Kabat, E.A., et al., (1991) Sequencies of proteins of immunological interest (5th Ed), Washington DC: United States Department of Health and Human Services; Kabat, E.A., et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616), yra pabrauktos; jų homologinė analize nebuvo vykdoma. Karkaso liekanos, kuriose stebimi skirtumai tarp pelės mAb ir žmogaus matricų, buvo analizuojamos atskirai.
[0124] Remiantis struktūrine ir sekų analize CDR antikūnai, išskyrus HCDR3, rodo limituotą skaičių pagrindinės grandinės konformacijų, vadinamų kanoninėmis struktūromis (Chothia, C. et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia, C., et al.. (1989) Nature 342:877-883). Be to, buvo identifikuotos tam tikros liekanos, ypatingai svarbios pagrindinės grandinės CDR kilpų konformacijoms (Chothia (1987), supra; Chothia (1989), supra). Tokiu būdu buvo identifikuotos pelės anti-CD40 kanoninės karkaso liekanos ir buvo nustatyta, kad aminorūgštys visose ypatingos svarbos kanoninėse padėtyse žmogaus matricų H ir L grandinių karkasuose yra identiškos atitinkamoms pelės liekanoms.
[0125] Paviršiuje išdėstytos pelės aminorūgštys, paprastai nerandamos žmogaus antikūnuose, matyt, turi įnašą į humanizuoto mAb imunogeniškumą
[0126] (Padlan, E. A. (1991) Mol. Immunol. 28:489-498). Todėl buvo analizuotos karkaso liekanos, kurios yra skirtingos pelės anti-CD40 ir žmogaus matricose,
[0127] ir remiantis jų sąveika su tirpikliu buvo sprendžiama, ar jos yra paslėptos, ar jos yra ant antikūno paviršiaus (Padlan (1991), supra). Nelaukiama, kad į tirpiklį nukreiptos karkaso liekanos nutolusios nuo CDR, turės didelės įtakos į antigeno surišimą ir todėl, išskyrus dvi H grandinės liekanas, visos buvo keičiamos į atitinkamas žmogaus aminorūgštis norint sumažinti potencialų imunogeniškumą. Laikoma, kad nukreiptos į tirpiklį yra H grandinės 28 ir 46 liekanos. Tačiau, kaip nustatė Chothia et al., supra, H28 yra HCDR1 srities viduje ir gali sąveikauti su antigenu. Be to, lizinas H46 padėtyje pelės mAb yra šiek tiek neįprastas ir žymiai skiriasi nuo glutamo rūgšties žmogaus matricoje. Todėl pelės ir žmogaus liekanos H28 ir H46 buvo ekspresuotos sudėtinėje bibliotekoje (fig. 15, žvaigždutės).
[0128] Kitos besiskiriančios karkaso liekanos, kurios, kaip manoma, yra paslėptos antikūno viduje, buvo tiriamos įvertinant: (1) artimumą CDR; (2) galimybę kontaktuoti su priešinga sritimi VK-VL riboje; (3) besiskiriančių aminorūgščių giminingumą ir (4) numatomą svarbą moduliuojant CDR aktyvumą kaip nustatė Studnicka et al. (Studnicka, G. M., et al. (1994) Protein Eng. 7:805-814). Dauguma L grandinės karkaso paslėptų liekanų skirtumų buvo giminingos aminorūgštys padėtyse, kurios laikomos tiesiogiai nesusijusiomis su CDR konformacija. Tačiau L49 yra greta LCDR2, ji gali kontaktuoti su VH sritimi, yra negiminiriga žmogaus liekanai ir gali dalyvauti apsprendžiant LCDR2 konformaciją. Dėl šių priežasčių pelės ir žmogaus aminorūgštys L49 padėtyje buvo ekspresuotos sudėtinio karkaso bibliotekoje (fig.15, žvaigždutės).
[0129] Pelės H grandinės sekos ir žmogaus matricos analizė buvo sudėtingesnė. Pelės mAb H9 liekana yra prolinas, o žmogaus matricoje yra negimininga serino liekana. H9 padėtis taip pat gali vaidinti vaidmenį CDR konformacijos moduliavime ir todėl buvo pasirinkta kaip sudėtinės bibliotekos vieta (fig.15, žvaigždutės). Likusios paslėptos karkaso liekanos, kurios yra skirtingos pelės anti-CD40 ir H grandinės matricoje, buvo 38, 39, 48 ir 91 karkaso padėtyse. Pelės anti-CD40 mAb H38 ir H39 atitinkamai yra glutaminas ir glutamo rūgštis, o žmogaus matricoje - argininas ir glutaminas. H38 liekana yra greta HCDR1, glutamino -» arginino pakeitimas yra neišlaikytas ir glutamino ekspresija šioje vietoje pelės Ab yra šiek tiek neįprasta. Panašiai glutamo rūgštis -» glutaminas yra neišlaikomas skirtumas paslėptoms aminorūgštims, H39 yra potenciali VK kontakto liekana, o glutamo rūgštis yra šiek tiek neįprasta pelės mAb. H48 liekana yra labai arti prie HCDR2, o H91 yra laikoma didelės rizikos vieta (Studnicka (1994), supra; Harris, L. et al., (1995) Prot. Sci. 4:306-310), kuri gali kontaktuoti su VK sritimi. Taigi buvo ekspresuotos ir pelės, ir žmogaus liekanos H38, 39, 48 ir 91 padėtyse (fig.15, žvaigždutės).
[0130] Visumoje karkaso biblioteka susidėjo iš pelės CDR, implantuotų į žmogaus matricas. Be to, viena karkaso liekana L grandinėje ir septynios karkaso liekanos H grandinėje buvo laikomos potencialai svarbiomis mAb aktyvumui išlaikyti. Visos šios vietos buvo charakterizuotos sintezuojant sudėtinę biblioteką kuri ekspresuoja visas galimas pelės ir žmogaus aminorūgščių, rastų šiose liekanose, kombinacijas. Bendra šios bibliotekos, pavadintos Hu I, įvairovė buvo 28 arba 256 variantai (žemiau duodama 2 lentelė).
[0131] V-
[0132]
[0133] Hu I biblioteka buvo ekspresuota mažos apimties (<1 mi) bakterijos kultūrose, išlaisvintų iš periplazminės erdvės Fab vienodi kiekiai buvo imobilizuoti ant mikrotitro plokštelės ir antikūnų surišimo geba buvo palyginama tiesiogiai ELISA metodu (VVatkins (1997), supra). Nors buvo identifikuoti variantai, kurie suriša tikslinį antigeną panašiu arba geresniu už chimerinio Fab afiniškumu, dauguma atrinktų Hu I klonų buvo mažiau aktyvūs nei chimerinis anti-CD40 Fab. Apytikriai 6 % atsitiktinai parinktų Hu I variantų rodė surišimo aktyvumą panašų į chimerinio Fab aktyvumą (duomenys neparodyti). Identifikavimas daugybės Hu I variantų, turinčių panašų į chimerinio CD40 aktyvumą patvirtina interpretaciją kad [ sudėtinę biblioteką pateko pačios svarbiausios karkaso liekanos.
[0134] Aktyvūs klonai toliau buvo charakterizuoti titruojant imobilizuotu antigenu, norint patvirtinti daugelio variantų turinčių padidintą afiniškumą identifikavimą. Pavyzdžiui, 19C11 klonas jungiasi su CD40 receptoriumi didesniu afiniškumu nei chimerinis Fab, ką rodo titravimo kreivės poslinkis (fig. 16, balti skrituliukai palyginus su juodais skrituliukais). Trisdešimt keturių aktyviausių klonų DNR sekų nustatymas leido identifikuoti 24 atskiras karkaso kombinacijas, ir kiekvienoje iš jų buvo 2-6 pelės karkaso liekanos (duomenys neparodyti).
[0135] LCDR3 ir HCDR3 kontaktuoja tiesiogiai su antigenu, sąveikauja su kitais CDR ir dažnai žymiai veikia antikūnų afiniškumą ir specifiškumą
[0136] (VVilson, I.A., et al., (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:113-118; Padlan, E.A.
[0137] (1994) Mot. Immunol. 31:169-213). Be to, LCDR3 ir HCDR3 konformacijas dalinai apsprendžia tam tikros karkaso liekanos. Norint identifikuoti aktyviausią antikūną oligonukleotidams sintezuoti buvo panaudota mutagenezė kodonų pagrindu (Glaser, S.M., et al., (1992) J. Immunol. 149:3903-3913), kuri įveda mutacijas kiekvienoje HCDR3 padėtyje (iš karto vieną) ir gaunama visų 20 aminorūgščių ekspresija kiekvienoje CDR liekanoje. Kiekvienas oligonukleotidas koduoja ne daugiau nei vienos aminorūgšties pakeitimą Karkaso/HCDR3 bibliotekai sukurti oligonuleotidų, koduojančių HCDR3 biblioteką mišinys buvo sumaišytas su persidengiančiais oligonukleotidais, koduojančiais sudėtinį karkasą ir kitais CDR. Šios bibliotekos, pavadintos Hu II, įvairovė buvo 1,1 x 105 (aukščiau duota 2 lentelė). Biblioteka LCDR3 buvo sintezuota panašiui būdu. Karkaso/HCDR3/LCDR3 bibliotekos, pavadintos Hu III, sukūrimui buvo panaudoti oligonukleotidai, koduojantys LCDR3, HCDR3 ir sudėtinį karkasą Bibliotekoje, kurios sudėtingumas buvo 3,1 x 107 (aukščiau duota 2 lentelė), buvo gauta labai daug karkaso/CDR3 kombinacijų.
[0138] Derinant mutacijas LCDR3 ir/arba HCDR3 su karkaso biblioteka, humanizuotų anti-CD40 variantų potenciali įvairovė padidėjo nuo 256 iki daugiau nei 107. Norint efektyviau atlikti šių bibliotekų atrinkimą buvo panaudotas modifikuotas zonų perkėlimo bandymas, vadinamas imobilizavimo liftu (VVatkins (1998), supra). Trumpai tariant, fagais infekuotos bakterijos buvo paskleistos ant kietų agaro plokštelių ir po to jos buvo padengtos nitroceliulioziniais filtrais, kurie buvo padengti Fab-specifiniu reagentu. Kai buvo sulaikyta beveik vienodi kiekiai fago ekspresuotų Fab, filtrai buvo veikiami 5 ng/ml CD40-lg sulieto baltymo. Kadangi filtrai buvo veikiami antigenu, kurio koncentracija buvo daug mažesnė nei Fab Ko, buvo detektuojami tik tie variantai, kurie turėjo padidintą afiniškumą Atlikus >106 variantų iš Hu II ir >105 variantų iš Hu III bibliotekos atrinkimą naudojant 82 mm filtrus, turinčius «105 variantų/filtre, buvo identifikuota daug klonų, turinčių didesnius afiniškumus (2 lentelė).
[0139] Dėl didelio fagų tankio ant filtrų buvo išrinktos teigiamos zonos, perdengta imant mažesnį tankį ir vėl atliktas atrinkimas. Po to variantai, kurie davė intensyviausią kolorimetrinį signalą imobilizavimo lifto bandyme buvo toliau charakterizuoti ELISA metodu. Kaip ir buvo galima tikėtis, dauguma imobilizavimo lifto atrinkimo teste identifikuotų klonų prijungė CD40 geriau nei chimerinis Fab. Šių variantų titravimas imobilizuotu CD40-lg parodė daug klonų, turinčių didesnius nei chimerinio ir humanizuoto Fab afiniškumus
[0140] (fig. 16, palyginkite baltus kvadratus ir juodus trikampius su skrituliukais).
[0141] Karkaso/CDR mutacijos, kurios rodė padidintą afiniškumą, buvo identifikuotos DNR sekų nustatymo būdu. Buvo identifikuotos unikalios kintamosios srities sekos 10/13 Hu II variantų ir 3/4 Hu III variantų. Ir Hu II, ir
[0142] Hu III variantai turėjo 1-5 pelės karkaso liekanas ir 0-2 CDR3 mutacijas, kaip parodyta toliau duodamoje 3 lentelėje.
[0143] Bakterijose ekspresuotų chimerinių Fab ir parinktų variantų iš kiekvienos bibliotekos afiniškumai buvo kruopščiau charakterizuoti naudojant paviršiaus plazmonų rezonanso matavimus, norint nustatyti išgrynintų Fab asociacijos ir disociacijos su imobilizuotu CD40-lg greičius. Chimerinis anti-CD40 turėjo disociacijos konstantą Kd = 3,14 nM, o pagal atrinkimo rezultatus dauguma variantų turėjo didesnius afiniškumus. Du iš geriausių klonų - F4 ir L3.17 - turėjo Kd atitinkamai 0,24 nM ir 0,10 nM (1 lentelė). Pagerinti anti-CD40 variantų afiniškumai daugiausia buvo dėl lėtesnės disociacijos, nes visų variantų asociacijos greičiai buvo labai panašūs (jų reikšmės yra 0,9-3,2 x 106 M"1 s"1 ribose).
[0144] Pagaliau padidintą afiniškumą rodantys variantai buvo tyrinėjami, norint įvertinti jų sugebėjimą blokuoti gp39 ligando susirišimą su CD40 receptoriumi. Visi šie variantai inhibavo tirpaus CD40-lg sulieto baltymo susirišimą su imobilizuotu gp39 antigenu nuo dozės priklausančiu būdu, kuris koreliavosi su Fab afiniškumu (fig.17). Pavyzdžiui, veiksmingiausias ligando susiršimo su CD40-lg sulietu baltymu inhibitorius buvo 2B8 variantas, kuris taip pat buvo didžiausio afiniškumo CD40 variantas (fig.17). 2B8 variantas rodė «17 kartų didesnį afiniškumą CD40 nei chimerinis Fab ir «7 kartus efektyviau inhibavo ligando prisijungimą.
[0145] Pareiškėjai taip pat sukūrė ir išbandė in vivo žiurkės anti-pelės CD40 mAb, pavadintą 7E1-G2b, ir jo predecesorių - 7E1-G1. Šis antikūnas buvo generuotas norint ištirti anti-CD40 terapijos galimybes autoimuninių, uždegiminių ir transplantavimo ligų pelės modeliuose. Pirminis pelės modelio sistemos tikslas buvo generuoti anti-pelės atitikmenį, kuris imituotų 2.220 pilną ir potencialią gp39/CD40 sąveikos blokadą pasižymėdamas silpnu kostimuliaciniu aktyvumu, ir išbandyti in vivo standartiniuose eksperimentiniuose ligų modeliuose.
[0146] A. Anti- pelės CD monokloniniu antikūnu 7E1- G1 ir 7E1- G2b išskyrimas ir charakterizavimas
[0147] Aštuonių savaičių amžiaus Lewis žiurkių patelėms imunizuoti, įskiepijant per letenėles, buvo naudojamas rekombinantinis pelės CD40 imunoglobulino sulietas baltymas, susidedantis iš ekstraląstelinės pelės CD40 srities, sulietos su šarnyru - pelės Ig2a antikūno CH2 ir CH3 sritimis
[0148] (mCD40-mlg). Praėjus trims dienoms po paskutinės imunizacijos, leukocitai iš drenuojamų limfmazgių buvo sulieti su X63-Ag8.653 pelės mielomos ląstelėmis, sukuriant žiurkės x pelės heterohibridomas. Buvo identifikuotos duobutės, turinčios antikūną specifinį natyviam pelės CD40, nustatant reaktingumą su originaliu mCD40-mlg imunogenu ELISA metodu ir reaktingumą su CD40 teigiamos pelės B ląstelių limfomos ląstelių linija (VVEHI-231, ATCC CLR-1702). Po to buvo tiriami nuopilai, nustatant jų sugebėjimą inhibuoti mCD40-mlg susijungimą su tirpiu rekombinantiniu mCD8-pelės gp39 sulietu baltymu (mgp39) - sgp39 pelės ekvivalentu. Maždaug 12 iš labiausiai veiksmingų inhibitoriaus šeimininko duobučių buvo klonuota panaudojant limituojančio skiedimo metodą.
[0149] Po klonavimo buvo atlikti funkciniai bandymai su kultūrų nuopilais ir buvo išgryninti antikūnai, norint tiksliau įvertinti anti-Cd40 mAb sugebėjimą inhibuoti pelės gp39 sąveiką su CD40 ir nustatyti jų, kaip stimuliatorių savybes. Inhibicinės savybės buvo matuojamos pagal jų sugebėjimą inhibuoti mgp39 susirišimą su VVEHI-231, naudojant žinomas standartines metodikas. Stimuliatorinės savybės buvo matuojamos pagal VVEHI-231 ląstelių tamprios homotipinės adhezijos indukciją ir blužnies B ląstelių proliferaciją esant šio antikūno ir anti-lgM, naudojant žinomas metodikas. Iš šių rezultatų buvo nustatyti trys mAb (5A3, 7E1-G1 ir 8E1), panašiausi į anti-žmogaus CD40 mAb 2.220 gp39/CD40 blokados ir kostimuliacinio aktyvumo lygio atžvilgiu.
[0150] In vivo tyrimai bandyme su pelėmis buvo skirti nustatyti, kuris iš blokuojančių/nestimuliacinių anti-CD40 mAb labiausiai slopina specifinius antikūno atsakus į T priklausantį antigeną. Buvo tirtas IgG antikūninio atsako į SRBC slopinimas pelėse anti-pelės CD40 mAb. Grupės po 5 BALB/c peles buvo imunizuojamos iv 1 x 108 SRBC ir tuo pačiu metu paveiktos ip būdu 1 mg anti-pelės CD40 mAb 5A3, 7E1-G1 arba 8E1. Kaip kontrolės, grupės panašiai imunizuotų pelių buvo veikiamos MR1 (žiurkėno anti-pelės gp39, teigiama kontrolė, 250ng), 6E9 (žiurkės anti-žmogaus gp39, neigiama kontrolė, 1 mg) arba PBS. Pelėms buvo nustatyti IgG anti-SRBC titrai ELISA metodu 7-ą 14-ą 21-ą ir 35-ą dieną. Rezultatai parodė, kad [vedant antikūną kaip vienkartinę dozę tuo pačiu metu kaip ir antigeno iššaukimas SRBC, mAb 7E1-G1 yra efektyvesnis IgG anti-SRBC atsako slopintojas lyginant su mAb 5A3 arba 8E1, ir todėl jis pasirinktas kaip pagrindinis anti-CD40 mAb pelių tyrimuose.
[0151] 7E1-G1 neturi efektorinės funkcijos charakteristikų artimų chimerinio 2.220 anti-žmogaus CD40 mAb (t.y. žiurkės lgG1 nėra toks veiksmingas kaip žmogaus lgG1 komplementiniam fiksavimui ir Fc receptoriaus sąveikai), ir 7E1 specifinio antikūno slopinimo vaizdas in vivo nėra toks pilnas kaip 2.220 mAb primatuose. Taigi buvo ieškoma antikūno, turinčio 7E1 specifiškumą bet daugiau su žiurkės izotipu, savo efektorinėmis galimybėmis panašaus į žmogaus lgG1. Šiam tikslui buvo generuotas 7E1 natūralus izotipo perkeitimo variantas (iš lgG1 į lgG2b), panaudojant subselekcijos metodiką (Hale et al., J. Immunol. Methods (1987) 103(1 ):59-67). Trumpai tariant, lgG2b izotipo anti-CD40 mAb buvo identifikuotas ELISA metodu tarp 96 plokštelių nuopilų, kurios buvo užsėtos pradine 7E1 hibridoma, imant 1000 ląstelių/duobutei. Paskesni padengimo ir lgG2b teigiamų duobučių identifikavimo ciklai, imant užsėjimo tankius 200, po to 20 ląstelių/duobutei, po to einantys du klonavimo limituojančio skiedimo būdu ciklai leido išskirti 7E1 kloninį lgG2b perkeitimo variantą-7E1-G2b.
[0152] 7E1-G2b yra leistinas lgG1 perkeitimo variantas, ką rodo trys duomenų serijos. Pirma, sunkiosios grandinės N-galo sekos nustatymas parodė, kad abi versijos turi vienodas 35 aminorūgščių liekanas. Antra, PCR analizė, naudojant specifinius 7E1-G1 kintamosios sunkiosios grandinės CDR pradmenis, davė atitinkamo dydžio juostą nuo kDNR, gautos arba iš 7E1-G1, arba 7E1-G2b, o ne dviejų kitų negiminingų antikūnų. Pagaliau, išgrynintų šių dviejų versijų partijų susijungimo su imobilizuotu mCD40-hlg aktyvumas ELISA teste, naudojant anti-kapa žymėtą reagentą davė iš esmės vienodas titravimo kreives.
[0153] 1. 7E1-G1 palyginimas su 7E1-G2b in vivo antikūno atsako
[0154] Buvo palygintas 7E1-G1 ir 7E1-G2b efektyvumas in vivo, naudojant SRBC kaip T ląstelėms priklausantį antigeną. Grupės iš 3-5 gyvuliukų buvo imunizuojamos iv SRBC ir tuo pačiu metu veikiamos ip 7E1-G1 arba 7E1-G2b antikūnu, imant 1, 0,25 arba 0,1 mg junginio 0-ę dieną kaip parodyta fig.10. Anti-pelės gp39 mAb MR1 tarnavo teigiama imunosupresinio poveikio kontrole. Mab 6E9 ir PBS tarnavo kaip atitinkamai ryšio neturinčio mAb ir mAb nenaudojimo kontrolės. ELISA metodu 7-ą 14-ą ir 21-ą dieną buvo nustatomi pelių anti-SRBC titrai. Titras atitinka apskaičiuotą serumo praskiedimą kuris duoda OD reikšmę = 0,3 ELISA teste. Kaip parodyta fig.10, 7E1-G2b slopino IgG atsaką į SRBC esant tokioms dozėms, kurios 7E1-G1 atveju neslopino.
[0155] 2. 7E-G2b dozės atsakas T-priklausančio antigeno pelės
[0156] 7E1-G2b buvo tirtas T ląstelėms priklausančiame pirminio imuninio atsako modelyje, antigenu naudojant SRBC. Buvo tirtos įvairios 7E1-G2b dozės norint nustatyti mažiausią efektyvią dozę. BALB/c pelėms buvo suleista iv 1 x 108 SRBC ir joms padaryta viena injekcija 7E1-G2b, imant nurodytą dozę, arba suleista MR1 (anti-pelės gp39) arba PBS tuo pačiu metu kaip ir antigenas 0-ę dieną Fig.11 parodyta IgG anti-SRBC atsakas 7-ą 16-ą ir 28-ą dieną. Parodytos reikšmės yra ELISA optinio tankio reikšmės esant serumo praskiedimui1/50. Paklaidų atžymos rodo standartinį nukrypimą
[0157] Kaip parodyta fig. 11, vienkartinis poveikis 7E1-G2b imant 25 {j.g/pelei (1,25 mg/kg) slopino IgG imuninį atsaką 87 % 16-ą dieną o visiškas nuslopinimas buvo gautas 50 arba 100 ^g dozėmis 16-ą dieną. 28-ą dieną 50 Įig/pelei dozė nuslopino IgG atsaką 89 %, o 100 jig/pelei dozė nuslopino visiškai. Atkreipkite dėmesį, kad MR1 buvo naudotas kaip teigiama imunosupresijos kontrolė imant suboptimalią 100 ^g/pelei dozę.
[0158] 3. 7E1-G2b prevenciniame kolageno sukelto artrito (CIA) pelės
[0159] Norint nustatyti 7E1-G2b poveikį artrito prevencijai, buvo naudotas standartinis eksperimentinis pelės reumatinio artrito modelis - kolageno sukeltas artrito modelis (CIA). DBA/1 J pelių patinėliams (6-8 savaičių amžiaus) 0-nę dieną į odą buvo suleista 200 jig II tipo viščiukų kolageno (Cll) pilname Froindo adjuvante. Gydymas 7E1-G2b, imant 250 fj.g dozę, buvo atliekamas ip būdu kas 4 dienos pradedant nuo 7-os dienos. Kontrolinė grupė buvo veikiama PBS pagal tą patį dozavimo grafiką. Visos pelės buvo veikiamos Cll nepilname Froindo adjuvante 21-ą dieną. Pelės buvo apžiūrimos kasdien, nustatant letenėlių patinimą ir subjektyviai nustatomi balai 0-3 balų skalėje, 3 balais vertinant maksimalų patinimą ir eritemą. Letenėlės taip pat buvo matuojamos išormačiu. Pateikti klinikiniai balai buvo išvesti susumavus kiekvienos letenėlės balus pelių sunaikinimo metu ir padalinant iš bendro gyvuliukų skaičiaus kiekvienoje grupėje. Paskelbtos reikšmės yra vidutinis grupių intervalas.
[0160] Artrito atsiradimą taigi ir pelių sąnario uždegimą visiškai inhibavo gydymas 7E1-G2b, kaip parodyta toliau duodamoje 4 lentelėje. 7E1-G2b gydytos pelės visiškai nesirgo per 90 dienų
[0161]
[0162] Kaip parodyta aukščiau, šio išradimo antikūnai yra veiksmingi imunomoduliatoriai, kurie gali būti naudojami įvairių ligų gydymui.
[0163] Šis išradimas apima aukščiau aprašytus chimerinį ir humanizuotą antikūnus, turinčius papildomus koservatyviųjų aminorūgščių pakeitimus, kurie iš esmės neturi poveikio į CD40 surišimą. Konservatyvieji pakeitimai paprastai yra vienos aminorūgšties pakeitimas kita aminorūgštimi, turinčia panašias charakteristikas, pvz., pakeitimai šiose grupėse: valinas, glicinas; glicinas, alaninas; valinas, izoleucinas, leucinas; asparto rūgštis, glutamo rūgštis; asparaginas, glutaminas; serinas, treoninas; lizinas, argininas; ir fenilalaninas, tirozinas.
[0164] Vienu aspektu šis išradimas yra skirtas aukščiau aprašytų chimerinio ir/arba humanizuoto antikūnų sukūrimui, ekspresuojant rekombinantinės DNR segmentais, koduojančiais pelės lengvąją kintamąją grandinę ir sunkiąją kintamąją grandinę (arba jos dalis), prijungtais prie DNR segmentų, koduojančių žmogaus pastoviasias sritis. Pavyzdinės DNR sekos, sukonstruotos pagal šį išradimą koduoja polipeptidines grandines, turinčias savyje visą lengvosios grandinės kintamąją sritį arba jos dalį, kaip parodyta SEQ ID NO:1 arba jos deponuotame ATCC klone, ir/arba visą sunkiosios grandinės kintamąją sritį arba jos dalį, kaip parodyta SEQ ID NO:2 arba jos deponuotame ATCC klone.
[0165] Šiame išrasdime taip pat yra apimamos parodytos sunkiosios ir lengvosios grandinės kintamosios sritys ir veiklios arba funkcinės jų dalys. Imunologiškai kompetentinė arba funkcinė baltymo forma arba jos dalis taip pat čia vadinama "lengvosios/sunkiosios grandinės kintamoji sritis arba biologiškai aktyvi jos dalis". Šiuo atveju biologiškai aktyvi jos dalis apima minėtos lengvosios arba sunkiosios grandinės dalį, kuri, kai ji įterpiama į antikūną dar leidžia antikūnui susirišti su žmogaus CD40.
[0166] Šiame išradime ypatingai apimamos nukleorūgščių sekos, koduojančios šio išradimo antikūno kintamąją sunkiąją grandinę ir kintamąją lengvąją grandinę. Pavyzdžiui, fig.13 nukleotidai 1057-1422 (SEQ ID NO:5) duoda tinkamiausią nukleorūgšties seką koduojančią šio išradimo antikūno kintamąją sunkiąją grandinę; fig. 14 nukleotidai 1065-1388 (SEQ ID NO:6) duoda tinkamiausią nukleorūgšties seką koduojančią šio išradimo antikūno kintamąją lengvąją grandinę. SEQ ID NO:7 ir SEQ ID NO:11 parodytos tinkamiausios nukleorūgščių sekos, koduojančios šio išradimo humanizuotų
[0167] antikūnų kintamąsias lengvąsias grandines; SEQ ID N0:9 parodyta tinkamiausia nukleorūgšties seka, koduojanti šio išradimo humanizuoto antikūno kintamąją sunkiąją grandinę. Plazmidės, turinčios savyje SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:9 ir SEQ ID NO: 11 parodytus nukleotidus, buvo deponuotos su ATCC.
[0168] Chimeriniai ir/arba humanizuoti antikūnai, kurie susiriša su žmogaus GD40, ir kurie yra iš esmės homologiniai, arba kurie turi iš esmės identišką seką čia parodytoms kintamosios lengvosios ir sunkiosios grandinės sekoms, taip pat patenka į šį išradimą. Pavyzdžiui, chimeriniai antikūnai, turintys lengvosios grandinės sritį, kuri rodo bent apie 85 % sekos identiškumą geriau bent apie 90 % sekos identiškumą dar geriau bent apie 95 % sekos identiškumą ir visų geriausia bent apie 98 % sekos identiškumą su lengvosios grandinės sritimi, kaip parodyta SEQ ID NO:4, patenka į šio išradimo sferą Konkrečiau, chimeriniai antikūnai, turintys kintamąją lengvosios grandinės sritį, kuri rodo bent apie 85 % sekos identiškumą geriau bent apie 90 % sekos identiškumą dar geriau bent apie 95 % sekos identiškumą ir visų geriausia bent apie 98 % sekos identiškumą su kintamaja lengvosios grandinės sritimi, kaip parodyta SEQ ID NO:1, taip pat patenka į šio išradimo sferą. Taip pat į šio išradimo sferą patenka humanizuoti antikūnai, turintys lengvosios grandinės sritį, kuri rodo bent apie 85 % sekos identiškumą geriau bent apie 90 % sekos identiškumą dar geriau bent apie 95 % sekos identiškumą ir visų geriausia bent apie 98 % sekos identiškumą su lengvosios grandinės sritimi, kaip parodyta SEQ ID NO:8 ir/arba SEQ ID NO:12.
[0169] Be to, chimeriniai antikūnai, turintys sunkiosios grandinės sritį, kuri rodo bent apie 85 % sekos identiškumą geriau bent apie 90 % sekos identiškumą dar geriau bent apie 95 % sekos identiškumą ir visų geriausia bent apie 98 % sekos identiškumą su sunkiosios grandinės sritimi, kaip parodyta SEQ ID NO:3, patenka į šio išradimo sferą. Konkrečiau, chimeriniai antikūnai, turintys kintamąją sunkiosios grandinės sritį, kuri rodo bent apie 85 % sekos identiškumą geriau bent apie 90 % sekos identiškumą dar geriau bent apie 95 % sekos identiškumą ir visų geriausia bent apie 98 % sekos identiškumą su kintamaja sunkiosios grandinės sritimi, kaip parodyta SEQ ID N0:2, taip pat patenka į šio išradimo sferą. Taip pat į šio išradimo sferą patenka humanizuoti antikūnai, turintys kintamąją sunkiosios grandinės sritį, kuri rodo bent apie 85 % sekos identiškumą geriau bent apie 90 % sekos identiškumą dar geriau bent apie 95 % sekos identiškumą ir visų geriausia bent apie 98 % sekos identiškumą su kintamaja sunkiosios grandinės sritimi, kaip parodyta SEQ ID NO: 10, taip pat patenka į šį išradimą
[0170] Paprastai DNR segmentai turi dar ir ekspresijos kontrolės DNR seką per operoną prijungtą prie chimerinio arba humanizuoto antikūno kodavimo sekų, ir natūraliai asocijuotas arba heterologines promotoriaus sritis. Pageidautina, kad ekspresijos kontrolės sritys būtų eukariotinio promotoriaus sistemos, galinčios transformuoti arba transfekuoti eukariotinių šeimininkų ląsteles, bet taip pat gali būti naudojamos ir prokariotinių šeimininkų kontrolinės sekos. Kai į atitinkamą šeimininką įvedamas vektorius, šeimininkas yra laikomas dideliam nukleotidinės sekos ekspresijos lygiui gauti tinkamose sąlygose ir, jeigu pageidaujama, po to kintamosios lengvosios grandinės, sunkiosios grandinės, lengvosios/sunkiosios grandinės dimerai arba nepaliestas antikūnas, surišimo fragmentai arba kitos imunoglobulino formos gali būti surenkamos ir išgryninamos. (Žr. Beychok, S., "Cells of Immunoglobulin Synthesis", Academic Press, N.Y. (1979)). Taip pat gali būti pagaminami vienos grandinės antikūnai, sujungiant nukleorūgščių sekas, koduojančias čia parodytas VL ir VH sritis, su DNR, koduojančia polipeptidinę jungę.
[0171] Šio išradimo antikūnui ekspresuoti gali būti naudojami prokariotiniai šeimininkai, tokie kaip E. coli, ir kiti mikrobai, tokie kaip mielės. Apart mikroorganizmų šio išradimo antikūnams ekspresuoti ir gaminti taip pat gali būti naudojamos žinduolių audinių ląstelių kultūros. Tinkamesnės yra eukariotinės ląstelės, kadangi šioje srityje sukurta daug tinkamų šeimininkų ląstelių linijų galinčių išskirti nepaliestus imunoglobulinus; tokiomis yra CHO ląstelių linijos, įvairios COS ląstelių linijos, HeLa ląstelės, mielomos ląstelių linijos ir hibridomos. Ekspresijos vektoriais šioms ląstelėms gali būti ekspresijos kontrolinės sekos, tokios kaip promotorius ir enhanceris, ir būtinos procesingo informacijos vietos, tokios kaip ribosominės surišimo
[0172] vietos, RNR sujungimo vietos, poliadenilinimo vietos ir transkripcijos baigmės sekos, kurios yra žinomos specialistams.
[0173] Vektoriai, turintys dominančius DNR segmentus (pvz. sunkiąją ir/arba lengvąją grandinę koduojančias sekas ir ekspresijos kontrolės sekas), gali būti perkelti į šeimininko ląstelę gerai žinomais būdais, kurie kinta priklausomai nuo ląstelės šeimininko tipo. Pavyzdžiui, prokariotinėms ląstelėms paprastai yra naudojama kalcio chlorido transfekcija, o kitiems ląstelių šeimininkams gali būti naudojamas apdorojimas kalcio fosfatu arba elektroporacija. (Žr., pvz., Maniatis, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press (1982)).
[0174] Po ekspresijos pilni antikūnai, jų dimerai, atskiros lengvosios ir sunkiosios grandinės arba kitos šio išradimo imunoglobulinų formos gali būti gryninamos pagal standartines šioje srityje naudojamas metodikas, įskaitant nusodinimą amonio sulfatu, afinines kolonėles, kolonėlių chromatografiją gelio elektroforezę ir panašias. Farmaciniams tikslams pageidautini iš esmės gryni imunoglobulinai, bent 90-95 % homogeniškumo, geriau 98-99 % arba didesnio homogeniškumo.
[0175] Šio išradimo antikūnai paprastai turėtų rasti pritaikymą gydant sutrikimus, kuriuose tarpininkauja antikūnas ir/arba T ląstelės. Tipiškos ligos būklės, kurios gali būti taip gydomos, yra implantanto prieš šeimininką liga ir persodinto organo atmetimas, bei autoimuninės ligos, kaip antai I tipo diabetas, psoriazė, išsėtinė sklerozė, reumatinis artritas, sisteminė eriteminė vilkligė ir sunkioji miestemija.
[0176] Šio išradimo antikūnai ir farmacinės kompozicijos yra ypatingai tinkamos parenteriniam vartojimui, t.y. suleidžiant po oda, Į raumenis arba į veną. Farmacinės kompozicijos parenteriniam vartojimui paprastai bus antikūno, ištirpinto tinkamame nešiklyje, geriausia vandeniniame nešiklyje, tirpalas. Gali būti naudojami įvairiausi gerai specialistams žinomi vandeniniai nešikliai, pvz., vanduo, vandeninis buferis, druskos tirpalas, glicinas ir panašūs. Šie tirpalai yra sterilūs ir paprastai neturi smulkių dalelyčių. Šios farmacinės kompozicijos gali būti sterilizuojamos panaudojant įprastas gerai žinomas sterilizavimo metodikas. Kompozicijose gali būti farmaciškai priimtinų pagalbinių medžiagų, kurių reikia priartėjimui prie fiziologinių sąlygų
[0177] tokių kaip pH sureguliavimo ir buferio agentų, toksiškumą sureguliuojančių agentų ir pan., pavyzdžiui, natrio acetato, natrio chlorido, kalio chlorido, kalcio chlorido, natrio laktato, žmogaus albumino ir t.t.
[0178] Kompozicijos, į kurias įeina šio išradimo antikūnai, gali būti vartojamos profilaktiniam ir/arba terapiniam gydymui. Taikant terapijoje, kompozicijos yra skiriamos jau ligos varginamam pacientui, duodant kiekį, kurio pakanka ligos ir jos komplikacijų išgydymui ar bent daliniam sustabdymui. Kiekis, kuris atitinka šių funkcijų atlikimą yra vadinamas "terapiškai efektyvia doze". Šiam panaudojimui efektyvūs kiekiai priklauso nuo ligos būsenos laipsnio ir paties paciento imuninės sistemos bendrosios būklės, ir jį gali nustatyti patyręs specialistas.
[0179] Taikant profilaktikoje, šio išradimo antikūnus turinčios kompozicijos yra skiriamos dar nesančiam ligos būklėje pacientui, norint sustiprinti paciento pasipriešinimą ligai (imuninio atsako slopinimui). Toks kiekis yra vadinamas "profilaktiškai efektyvia doze". Šiam panaudojimui tikslūs kiekiai taip pat priklauso nuo paciento sveikatos stovio ir bendro imuniškumo lygio. Tinkamiausias profilaktinis panaudojimas yra panaudojimas transplanto atmetimo prevencijai, pvz. persodinto inksto atmetimo prevencijai.
[0180] Nors šis išradimas yra aprašytas remiantis iliustracijomis ir pavyzdžiais, skirtais didesniam aiškumui ir supratimui, turėtų būti suprantama, kad toliau duodamos apibrėžties ribose yra galimi įvairūs jo pakeitimai ir modifikacijos.
[0181]
1. Lengvosios grandinės kintamoji sritis, apimanti visą aminorūgščių seką parodytą SEQ ID NO:1 (fig.4a), arba biologiškai aktyvią jos dalį.
2. Sunkiosios grandinės kintamoji sritis, apimanti visą aminorūgščių seką parodytą SEQ ID NO:2 (fig.4b), arba biologiškai aktyviąjos dalį.
3. Chimerinis antikūnas, kuris jungiasi su žmogaus CD40, b e s i s k i - r i a n t i s tuo, kad jis turi lengvąją grandinę ir sunkiąją grandinę, irši lengvoji grandinė turi lengvosios grandinės kintamąją sritį pagal 1 punktą.
4. Chimerinis antikūnas, kuris jungiasi su žmogaus CD40, b e s i s k 1 )r i a n t i s tuo, kad jis turi lengvąją grandinę ir sunkiąją grandinę, ir ši sunkioji grandinė turi sunkiosios grandinės kintamąją sritį pagal 2 punktą.
5. Chimerinis antikūnas pagal 3 punktą besiskiriantis tuo, kad minėta sunkioji grandinė turi sunkiosios grandinės kintamąją sritį pagal 2 punktą.
6. Chimerinis antikūnas, kuris jungiasi su žmogaus CD40, turintis lengvąją grandinę ir sunkiąją grandinę, besiskiriantis tuo, kad minėta lengvoji grandinė turi visą aminorūgščių seką parodytą SEQ ID NO:4, arba jos biologiškai aktyvią dalį, o minėta sunkioji grandinė turi visą aminorūgščių seką parodytą SEQ ID NO:3, arba jos biologiškai aktyvią dalį.
7. Nukleorūgšties molekulė, turinti nukleotidų seką koduojančią lengvosios grandinės kintamąją sritį pagal 1 punktą.
8. Nukleorūgšties molekulė, turinti nukleotidų seką koduojančią sunkiosios grandinės kintamąją sritį pagal 2 punktą.
9. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis turi nukleorūgšties seką pagal 7 punktą.
10. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis turinukleorūgšties seką pagal 8 punktą.■ v..
11. Humanizuotas antikūnas, besiskiriantis tuo, kad jis turi dalį lengvosios grandinės kintamosios srities pagal 1 punktą.
12. Humanizuotas antikūnas, besiskiriantis tuo, kad jis turi dalį sunkiosios grandinės kintamosios srities pagal 2 punktą.
13. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina chimerinis antikūnas pagal 5 punktą.
14. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina chimerinis antikūnas pagal 6 punktą.
15. Chimerinis antikūnas, kuris jungiasi su žmogaus CD40, turintis lengvosios grandinės kintamąją sritį ir sunkiosios grandinės kintamąją sritį, besiskiriantis tuo, kad minėta lengvosios grandinės kintamoji sritis apima aminorūgščių seką turinčią bent 90 % sekos identiškumą lengvosios grandinės kintamajai sričiai pagal 1 punktą.
16. Chimerinis antikūnas, kuris jungiasi su žmogaus CD40, turintis lengvosios grandinės kintamąją sritį ir sunkiosios grandinės kintamąją sritį, besiskiriantis tuo, kad minėta sunkiosios grandinės kintamoji sritis apima aminorūgščių seką turinčią bent 90 % sekos identiškumą sunkiosios grandinės kintamajai sričiai pagal 2 punktą.
17. Farmacinė kompozicija pagal 14 punktą skirta panaudoti paciento, varginamo T ląstelių tarpininkaujamo sutrikimo gydymui.
18. Nuleorūgšties molekulė pagal 7 punktą turinti nukleotidų seką parodytą SEQ ID NO:6.
19. Nuleorūgšties molekulė pagal 8 punktą turinti nukleotidų seką parodytą SEQ ID NO:5.
20. Chimerinis antikūnas pagal 6 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi lengvosios grandinės aminorūgščių seką parodytą SEQ ID NO:4 ir sunkiosios grandinės aminorūgščių seką parodytą SEQ ID NO:3.
21. Humanizuotas antikūnas pagal 11 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi lengvosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID NO:8.
22. Humanizuotas antikūnas pagal 11 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi sunkiosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID N0:10.
23. Humanizuotas antikūnas pagal 12 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi lengvosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID NO:8.
24. Humanizuotas antikūnas pagal 12 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi sunkiosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID NO: 10.
25. Humanizuotas antikūnas pagal 11 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi lengvosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID NO:8, ir sunkiosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID NO: 10.
26. Humanizuotas antikūnas pagal 11 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi lengvosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID NO: 12.
27. Humanizuotas antikūnas pagal 26 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi sunkiosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID N0:10.
28. Humanizuotas antikūnas pagal 11 punktą besiskiriantis tuo, kad jis turi lengvosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID NO:12, ir sunkiosios grandinės kintamąją sritį, parodytą SEQ ID N0:10.
29. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina humanizuotas antikūnas pagal 25 punktą.
30. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad į ją įeina humanizuotas antikūnas pagal 28 punktą