[LT] Šiame išradime aprašomi žmogaus paratiroidinio hormono analogai, kurie turi padidintą kaulų atstatymo aktyvumą ir padidintą bioprieinamumą. Aprašyti peptidai yra hPTH-(1-31) dariniai, kurie yra ciklinti, pavyzdžiui, sudarant laktamus arba tarp Glu22 ir Lys26, arba tarp Lys26 ir Asp30. Be to, gamtinis Lys27 gali būti pakeistas arba Leu, arba kitomis hidrofobinėmis liekanomis, kaip antai Ile, norleucinu, Met, Val, Ala, Trp arba Phe. Paprastai tokie analogai turi padidintą adenililciklazės stimuliavimo gebą žiurkių osteosarkomos ląstelėse ir turi padidintą kaulų atstatymo aktyvumą, naudojant žiurkių, kurioms pašalintos kiaušidės, modelį. Šie analogai turi padidintą aktyvumą ir bioprieinamumą, kuris matomas iš jų hipotenzinio poveikio žiurkėms. Taip pat aprašytas bandymas, kuriame koreliuojamas hipotenzinis aktyvumas su osteogeniniu aktyvumu.
[EN] This invention describes analogues of human parathyroid hormone which have increased activities in bone restoration, and increased bioavailabilities. the peptides are derivatives of hPTH-(1-31) which are cyclized for example, by formation of Lactams between either Glu22 and Lys26 or Lys26 and Asp30. In addition, the natural Lys27 may be substituted by either a Leu or other hydrophobic residues, such as Ile, norleucine, Met, Val, Ala, Trp, or Phe. Typically, these analogues have enhanced abilities to stimulate adenylyl cyclase in rat osteosarcoma cells, and show increased activities, as demonstrated by their hypotensive effects in the rat. An assay which correlates hypotensive activity with osteogenic activity is also described.
[0001] Šis išradimas yra susijęs su žmogaus paratiroidinio hormono analogais, kurie buvo rasti tinkamais osteoporozės gydymui.
[0002] Išradimo kilmė
[0003] Osteoporozė yra vyraujanti pagyvenusių žmonių, ypatingai pagyvenusių moterų, invalidumo priežastis, Neseniai buvo nustatyta, kad žmogaus paratiroidinis hormonas (hPTH) ir tam tikri jo analogai yra kaulų augimo stimuliatoriai, ir jie tinka osteoporozės gydymui. Osteoporozė yra progresuojanti liga, kuri pasireiškia bendros kaulų masės sumažėjimu ir padidintu kaulų trapumu. Tai dažniausiai sukelia spontaniškus atraminių kaulų lūžius ir fizini bei psichini pablogėjimą, būdingą pažeidimams, susijusiems su nejudrumu. Pomenopauzinę osteoporozę sukelia išnykimas estrogenų, kurie reguliuoja dešimtmečių trukmės kaulų akseleracijos kaitą, didėjant neatitikimui tarp seno kaulo rezorbcijos ir naujo kaulo susidarymo. Tai sukelia suplonėjimą, poringumo padidėjimą ir atraminių kaulų trabekulių sunykimą. Osteoporozė taip pat yra susijusi su hipertireoze, hiperparatiroidizmu, Kušingo sindromu ir tam tikrų steroidinių vaistų vartojimu. Istoriškai susiklostęs gydymas apima kalcio kiekio didinimą maiste, estrogeninę terapiją ir padidfntas vitamino D dozes, bet pagrindinai yra susijęs su agentais, tokiais-'kaip antirezorbciniai vaistai, kurie inhibuoja osteoklastų sukeliamą kaulo rezorbciją.
[0004] Paratiroidini hormoną (PTH) gamina priešskydinė liauka, ir jis yra pagrindinis kalcio kiekio kraujyje reguliatorius. PTH yra polipeptidas; galima pagaminti sintetinius peptidus metodais, kuriuos aprašė Erickson ir Merrifield, The Proteins, Neurath et a!., Eds., Academic Press, New York, 1976, p. 257, ir Hodges et al. (1988) Peptide Research 1,19 arba Atherton, E. and Sheppard, R.C. Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1989 modifikuotu metodu.
[0005] Kai kalcio kiekis serume yra sumažintas žemiau normalaus lygio, priešskydinė liauka išskiria PTH, ir kalcio kiekis yra padidinamas dėl kalcio rezorbcijos iš kaulų, dėl padidntos kalcio rezorbcijos iš žarnyno ir dėl padidintos inkstų kalcio reabsorbcijos iš susidariusio šlapimo inkstų kanalėliuose, Nors pastoviai leidžiami nedideli PTH kiekiai gali pašalinti kalci iš kaulų, tos pačios nedidelės dozės, kai jos leidžiamos protarpiais, gali faktiškai skatinti kaulų augimą.
[0006] Tregear US patente 4,086,196 aprašo žmogaus PTH analogus ir teigia, kad pirmosios 27-34 aminorūgštys yra efektyviausios adenililciklazės stimuliavimo požiūriu in vitro bandymuose su ląstelėmis. Rosenblatt US patente 4,771,124 aprašo hPTH analogų, kuriuose Trp23 yra pakeistas aminorūgštimis fenilalaninu, leucinu, norleucinu, valinu, tirozinu, (3-naftilalaninu arba a-naftilalaninu, savybę būti PTH antagonistais. Šie modifikuoti hPTH analogai taip pat turi pašalintas 2 ir 6 galines aminorūgštis, ir tai sukelia didelės dalies agonistinio aktyvumo praradimą, naudojant juos osteoporozės gydymui. Šie analogai buvo ketinami panaudoti kaip PTH ir giminingo PTH peptido inhibitoriai. Buvo teigiama, kad šie analogai gali būti naudingi hiperkalcemijos, susijusios su kai kuriais augliais, gydymui.
[0007] Pang et al, VV093/06845, publikuotame 1993 m. balandžio 15 d., aprašo hPTH analogus, kuriuose Arg25, Lys26, Lys27 pakeisti Įvairiausiomis aminorūgštimis, įskaitant alaniną, asparaginą, asparto rūgšti, cisteiną, glutaminą, g lutam o rūgštį, gliciną,, histidiną, izoleuciną, leuciną, metioniną. fenilalaniną, proliną, seriną, treoniną, triptofaną, tiroziną arba valiną. Teigiama, kad jie yra efektyvūs gydant osteoporozę, ir turi minimalų poveikį kraujo spaudimui ir lygiesiems raumenims, tačiau jokių patvirtinančių šį teiginį duomenų bandymuose su gyvūnais arba žmonėmis nepateikiama.
[0008] PTH veikia per dviejų antrinių mesendžerinių sistemų aktyvaciją - Gs-baltymo aktyvuotą adenililciklazę (AC) ir Gq-baltymo aktyvuotą fosfolipazę Cp. Pastaroji stimuliuoja surištos su membrana proteinkinazės Cs (PKC) aktyvumą. Buvo parodyta, kad šiam PKC aktyvumui reikia PTH 29-32 liekanų
[0009] (Jouishomme et al (1994) J. Bone Mineral Res. 9, (1179-1189)). Nustatyta, kad kaulų augimo padidėjimas, t.y. toks efektas, kuris yra naudingas gydant osteoporozę, yra susijęs su peptido sekos sugebėjimu padidinti AC aktyvumą. Buvo parodyta, kad natyvaus PTH seka pasižymi visais tokiais aktyvumais. hPTH-(1-34) seka paprastai vaizduojama kaip ( A) :
[0010] Gln Asp Vai His Asn Phe-OH A
[0011] Toliau duodamas linijinis analogas (hPTH-(1-31)-NH2), kurio duomenys įtraukti j žemiau duodamą 1 lentelę, pasižymi tik AC-stimuliuojančiu aktyvumu, ir buvo parodyta, kad jis yra labai aktyvus kaulų nykimo atstatymo požiūriu bandymuose su žiurkėmis, kurioms pašalintos kiaušidės (Rixon, R. H. et al (1994) J. Bone Miner. Res. 9, 1179-1189; VVhitfield et al. (1996), Calcified Tissue Int. 58, 81-87; VViIlick et al, US patentas No. 5,556,940, publikuotas 1996 m. rugsėjo 17 d.):
[0012] Gln Asp Val-NH2 B
[0013] Aukščiau pavaizduota molekulė ( B) gali turėti laisvą karboksilo galą vietoj parodyto amidinio galo.
[0014] Šio išradimo tikslas yra pagaminti naujus PTH analogus, kurie turėtų didesnj metabolinj stabilumą, padidintą kaulų atstatymo aktyvumą, padidintą AC aktyvumą ir minimalius pašalinius klinikinius efektus.
[0015] Pagal vieną šio išradimo aspektą pateikiamas žmogaus paratiroidinis hormonas hPTH, turintis tokią aminorūgščių seką: R-NH-R1-Val-Ser-Glu-lle-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Va!-R8--Trp-Leu-R9~R10»R1,-Leu-R12-Asp--Y,
[0016] R = vandenilis arba bet kokios linijinės arba šakotosios grandinės alkilas, acilas arba arilo grupė,
[0017] Y = X, Val-X, Val-His-X, Val-His-Asn-X, Val-His-Asn-Phe-X, Val-His-Asn-Phe-Val-X, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-X ir Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-X, ciklizuotas tarp vienos arba dviejų aminorūgščių porų 22 ir 26, 26 ir 30, 27 ir 30 ir 25 ir 29, kai R3 ir R6 yra Lys, Orn, Glu arba Asp, išskyrus ciklo(Lys26-Asp30) [Leu27]-hPTH-(1 -34)-NH2, ciklo(Lys27-Asp30)-hPTH-(1 -34)-NH2 ir ciklo(Lys26-Asp30)[Leu27]-hPTH-(1-34)-OH, ir jo farmaciškai tinkamos druskos.
[0018] Druskų pavyzdžiais yra neorganinių rūgščių druskos, organinių rūgščių, kaip antai skruzdžių rūgšties, acto rūgšties, vyno rūgšties ir citrinos rūgšties druskos, neorganinių bazių druskos, kaip antai natrio ir amonio druskos ir organinių bazių, kaip antai trietilamino, etilamino ir metilamino druskos.
[0019] Pagal kitą šio išradimo ypatybę, atlikta ciklizacija susidarant laktamams, kuriuose kopuliuotos pasirinktų aminorūgščių porų, tokių kaip gamtinių liekanų 22 ir 26 arba 26 ir 30, šoninės grandinės. Taip pat aptariami ir kitokie ciklizacijos tipai, kaip antai disulfido tiltelio sudarymas, pvz. tarp Cys turinčių analogų Cys22-Cys26 ir Cys26-Cys30.
[0020] Taip pat buvo rasta, kad yra efektyvūs kai kurie aminorūgščių pakeitimai. Lys27 gali būti pakeistas Leu arba Įvairiomis kitomis gamtinėmis hidrofobinėmis arba polinėmis liekanomis. Kitas faktorius yra liekanos atitikimas receptoriui. Ala nėra toks hidrofobinis kaip Leu. Lys irTyr paprastai yra laikomi poliniais, bet nei vienas iš jų neturi hidrofobinių sąveikų su receptoriumi. Pavyzdžiui, Lys gali sudaryti tokią konformaciją, kad hidrofobinės dalys sąveikautų su kitomis receptoriaus hidrofobinėmis liekanomis, o NH2 būtų prieinamas tirpikliui. Tokie pakeitimai apima omitiną, citruliną, a-aminosviesto rūgštį, alaniną, norleuciną, izoleuciną ir tiroziną arba bet kokią linijinę arba šakotą alifatinę a-aminorūgšti, turinčią 2-10 anglies atomų šoninėje grandinėje, bet kokj toki analogą, turinti polinę arba krūvi turinčią grupę alifatinės grandinės gale. Folinių ir krūvj turinčių grupių pavyzdžiais yra: amino-, karboksi-, acetamido-, guanidino- ir ureidogrupės. Nors atrodo, kad geriausias pakeitimas yra Leu27, pasirodo, kad daug kitų tokių 27-padėtyje pakeistų peptidų beveik.visiškai išlaiko aktyvumą ir taip pat gali turėti pageidautinas savybes, tokias kaip padidintas proteolitinis stabilumas arba tirpumas vandenyje; tikimasi, kad aktyviausi bus lle, norleucinas, Met ir ornitinas.
[0021] Šis pakeitimas stabilizuoja a-spiralę hormono surišimo srityje. Tai buvo patvirtinta tiriant laktaminių analogų apskritiminio dichroizmo (CD) spektrus, lyginant su linijinės molekulės - [Leu27]-hPTH-(1-31)-NH2 - apskritiminio dichroizmo spektrais. Apskritiminio dichroizmo spektrai yra labai jautrūs a-spiralinės antrinės struktūros buvimui, ir ši metodika buvo naudojama parodyti, kad hPTH fragmentuose yra a-spiralinė struktūra (Neugebauer et al
[0022] (1991) Biochemistry 31, 2056-2063). Be to, buvo parodyta a-spiralės stabilizacija sudarant aukščiau minėtus laktamus hPTH-(20-34)-NH2 molekulėje (Neugebauer et al (1994) Int. J. Peptide Res. 43, 555-562). Yra galimybė susidaryti amfifilinei a-spiralei tarp hPTH-(1-31)-NH2 21 ir 31 liekanų, ir buvo pateikti duomenys, kurie rodo, kad šios spiralės hidrofobinė pusė sąveikauja su PTH receptoriumi (Neugebauer, W. et al (1995) Biochemist/ y 34, 8835-8842; Gardella, T. J. et al (1993), Endocrinology 132, 2024-2030).
[0023] Buvo rasta, kad efektyviausia ciklizacija yra laktamo sudarymas, pavyzdžiui, arba tarp Glu22 ir Lys26, arba tarp Lys27 ir Asp30 liekanų. Galimos ir kitokios ciklizacijos, kaip antai tarp Lys27 ir Asp30, tačiau buvo rasta, kad toks laktamas turi tam tikrą destabilizuojanti poveikj a-spiralei.
[0024] Konkrečiau kalbant, PTH fragmentų receptoriaus surišimo tyrimai parodė pagrindinę surišimo sritj 14-34 liekanų srityje [1], Mes pasiūlėme, kad a-spiralės 17-29 liekanos rišasi su PTH receptoriumi, ir kad šios a-spiralės amfifilinė dalis rišasi su receptoriumi savo hidrofobinė puse [2]. Šis modelis atitinka receptoriaus surišimo srities analogų tyrimų rezultatus.
[0025] BMR tyrimai parodė, kad nors pagal CD duomenis modelinis peptidas yra labai spiralinis, taip pat yra daug ir nespiralinių konformacijų. Taigi, receptoriaus surišto peptidinio hormono, tokio kaip PTH, struktūra negali būti patikimai nustatyta iš jo laisvosios struktūros tirpale. Konformacinių būsenų, kurias gali sudaryti šis peptidas, skaičiui apriboti buvo panaudoti peptidinio hormono suvaržyti analogai [8], hPTH sekos tyrimas rodo, kad yra galimi 3 druskų tilteliai 17-29 liekanose, kurie gali arba stabilizuoti, arba destabilizuoti a-spiralę. Šie tilteliai yra tarp Glu22 ir Lys26 ir Lys26 ir Asp30 (laukiama, kad abu jie stabilizuos a-spiralę) ir tarp Lys27 ir Asp30 (laukiama, kad jis destabilizuos a-spiralę) [4], Laktamo sudarymas tarp šių liekanų porų apribos konformacijas, kurias gali sudaryti hPTH šioje spiralinėje srityje. Be to, du iš šių laktamų - Glu22-Lys26 ir Lys26-Asp30 - kurie, kaip manoma, stabilizuos a-spiralinę struktūrą, yra polinėje a-spiralės amfifilinės dalies pusėje. Laukiama, kad trečiasis laktamas - Lys27-Asp30 - bent jau dalinai destabilizuos a-spiralę, ir jame yra liekana (Lys27), kuri yra šios amfifilinės spiralės hidrofobinėje pusėje. Taip pat gali būti ciklizacija tarp 25 ir 29 padėties, jeigu Lys arba Orn pakeičia Arg 25 padėtyje ir jeigu Gln29 yra pakeistas Glu arba Asp.
[0026] Lys27 pakeitimas Leu duoda hidrofobiškesnę liekaną šios amfifilinės spiralės hidrofobinėje pusėje. Tai pasireiškia padidintu adenililcikazės stimuliavimo aktyvumu ROS ląstelių linijoje. Patyrę šios srities specialistai supras, kad tokie aukščiau aptarti pakeitimai taip pat turėtų duoti analogus, turinčius toki pati arba padidintą aktyvumą.
[0027] Laukiama, kad jungtinis pakeitimo ir taip pat laktamo sudarymo efektas stabilizuos a-spiralę ir padidins bioaktyvumą bei apsaugos šią molekulės dalį nuo proteolitinės degradacijos. Pageidautina, kad C-gale būtų amidas ta prasme, kad jis dar labiau turėtų apsaugoti peptidą nuo egzoproteolitinės degradacijos, nors kai kurios peptidazės ir gali juos hidrolizuoti (Leslie, F. M, and Goldstein, A. (1982) Neuropeptides 2, 185-196).
[0028] Taip pat buvo rasta, kad gali būti padaryti kiti naudingi aminorūgščių pakeitimai. Konkrečiau kalbant, mes pakeitėme oksidacijai jautrią M et liekaną 8, 18 padėtyse gamtine hidrofobine liekana (Nle), kaip ir Japonijos patento publikacijoje 61-24598. Taip pat galima tikėtis, kad bus naudingos kitos tokios hidrofobinės liekanos kaip, pavyzdžiui, Leu, lle, Vai, Phe ir Trp, kaip ir Nakagavva et al. USP 5,393,869.
[0029] Aptariami taip pat ir atvirkštiniai laktamai. Pavyzdžiui, mes parodėme Lys22-Glu26 sujungimo efektyvumą. Todėl galima laukti, kad gali būti padaryti panašūs naudingi sujungimai, pavyzdžiui, tarp 26-30 ir 27-30 laktamų.
[0030] Apart minėto Cys-Cys pakeitimo, buvo atliktas kitas pakeitimas pageidautino 22-26 laktamo vietoje, t.y. Asp22-Orn26, norint pailiustruoti, kad gali būti naudingos įvairios ciklizacijos ir žiedų dydžiai.
[0031] Nakagavva et al. USP 5,393,869 ir Fukuda et al. USP 5,434,246 buvo aprašyta, kad kai kurie pakeisti hPTH analogai turi žymų AC aktyvumą ir jie gali turėti padidintą stabilumą proteolitinei atakai, būtent
[0032] 1. Ser-1 pakeistas Aib (a-aminoizosviesto rūgštimi); 2. Lys-27 pakeistas Gln (skelbiama, kad turi 2,5 x AC aktyvumą); 3. 14, 15, 16, 17 liekanos pakeistos Lys pilnai arba dalinai (skelbiama, kad aktyvumas labai padidėja - iki 8 x. Tai gali būti dėl didesnio tirpumo vandenyje. Manoma, kad in vivo jie bus labilesni panašiems j tripsiną fermentams). Jie teigia, kad šiame tetrapeptide (14-17 liekanos imtinai) yra bent viena vandenyje tirpi aminorūgštis. Pavyzdžiui, His-14 arba Lys-14; Leu-15, Lys-15 arba Arg-15; Asn-16; Orn-16, Hci (homocitrulinas)-16, Asp-16, Arg-16, Lys-16, DLys-16, Ser-16 arba Gly-16; ir 17-Ser, 17-Lys, 17-Asp arba 17-Arg. Pavyzdžiui, taip pat gali būti Glu; 4. Arg-25 pakeistas His, norint sumažinto proteazės ataką. Kadangi mūsų laktamai, ypatingai su Leu arba kita hidrofobine aminorūgštimi 27-padėtyje, gali pasidaryti šiek tiek netirpūs ir juos bus sunku ištirpinti, galima tikėtis, kad tokie patys pakeitimai turėtų būti naudingi ir mūsų laktamams.
[0033] Patyrę specialistai taip pat supras, kad nors pirmenybė gali būti teikiama cikliniams 1-31 h-PTH, iš čia pateiktų duomenų galima laukti, kad cikliniai fragmentai nuo 1-30 iki 1-37 ribose taip pat bus efektyvūs. Literatūroje nėra duomenų, kad papildomos aminorūgšties iki 37 padėties buvimas veikia šio hormono biologines savybes; čia įtraukti konkretūs tai patvirtinantys duomenys apie 1-34.
[0034] Šio išradimo laktamai gali būti pagaminami pagal žinomas žemiau aprašytas metodikas ir gali būti naudojami kaulų augimo stimuliavimui, kaulų atstatymui ir kaulo gijimo skatinimui Įvairiose aplinkybėse, tokiose kaip osteoporozės ir normalių lūžių gydymas.
[0035] Fig. 1 parodyta žmogaus gamtinio PTH struktūra, 1-31 liekanos (SEQ ID NO: 1 ); Fig.2 parodyta [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPH-(1-31)-NH2 (SEQ ID NO:3); Fig.3 parodyta [Leu27]ciklo(Lys26-Asp30)-hPH-(1-31)-NH2 (SEQ ID NO:4); Fig.4 parodyta šio išradimo analogų ROS 17/2 ląstelių adenililciklazės stimuliavimo aktyvumai. Fig.5 duoti būdingi kaulų histologiniai pjūviai, paruošti praėjus 8 savaitėms po OVX, rodantys skirtingas hPTH-(1-31)NH2 ir jo laktaminių
[0036] darinių gebąs apsaugoti nuo kaulo nykimo ir sugebėjimą stimuliuoti kaulo augimą Sprague-Davvley žiurkėse, kurioms pašalintos kiaušidės (OVX).
[0037] Fig.6 parodyta kontrolinių žiurkių ir hPTH analogu gydytų žiurkių, kurioms iš pradžių buvo sukeltas žymus kaulo sunykimas, trabekulinio kaulo tūris. Gyvuliukai pradėti gydyti praėjus 9 savaitiems po OVX.
[0038] [Leu27]ciklo[Glu22-Lys25jhPTH-(1-31)-NH2 yra pats efektyviausias iš fragmentų, atstatantis kaulus iki kontrolinių žiurkių normalių reikšmių; ir
[0039] Fig. 7 parodyta normalių žiurkių, žiurkių, kurioms pašalintos kiaušidės (OVX), kontrole gydytų žiurkių bei hPTH-(1-31)-NH2, [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 ir [Leu27]ciklo(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 gydytų žiurkių šlaunikaulių trabekulių storis. Fig. 8 parodytas maksimalus kraujo spaudimo kritimas ir laikas iki maksimalaus kraujo spaudimo kritimo, imant 0,8 nmol/100 g hPTH-(1 -31 )-NH2, [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 arba [Leu27]ciklo(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 dozę. Peptidai buvo leidžiami arba po oda (balti stulpeliai) arba j veną (brūkšniuoti stulpeliai). Fig.9 parodyta [Leu27]-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO:5). Fig. 10 parodyta ciklo(Lys27-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID
[0040] Fig. 11 parodyta [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-30)-NH2 struktūra
[0041] Fig.12 parodyta įvairių šio išradimo analogų adenililciklazės
[0042] Fig.13 parodyta hPTH(1-31)NH2 ir hPTH(1-30)NH2 bei jų ciklinių
[0043] Fig.14 yra grafikas, iliustruojantis įvairių linijinio hPTH(1-31)-NH2 dozių
[0044] Fig. 15 parodyta [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-OH struktūra
[0045] Fig. 16 parodyta [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-34)-NH2 struktūra
[0046] Fig. 17 parodyta [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-34)-OH struktūra
[0047] Fig.18. parodyta [Ala27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO: 11). Fig.19 parodyta [Nle27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO:12). Fig.20 parodyta [Nle8J8;Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO: 13). Fig.21 parodyta ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO: 14). Fig.22 parodyta [lle27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO: 15). Fig.23 parodyta [Tyr27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO:16). Fig.24 parodyta a-acetil-[Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO: 17). Fig.25 parodyta [Leu27]ciklo(Lys22-Glu26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO:18). Fig.26 parodyta [Leu27]ciklo(Asp22-Orn26)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO:19). Fig.27 parodyta [Cys22;Cys26;Leu27]ciklo(Cys22-Cys26)-hPTH-(1-31)-NH2struktūra (SEQ ID N0:20). Fig.28 parodyta [Cys26;Cys30;Leu27]ciklo(Cys26-Cys30)-hPTH-(1-31)-NH2 struktūra (SEQ ID NO:21).
[0048] Kietafazės peptidų sintezės metodika, kurią ištobulino R.B. Merrifield ("Solid-Phase Peptide Synthesis", Advances in Enzymology 32, 221-296, 1969) (duodamas čia kaip literatūros šaltinis) yra plačiai ir sėkmingai naudojama polipeptidų, tokių kaip paratiroidinis hormonas, sintezei. Jos strategija paremta tuo, kad peptido aminorūgšties karboksi-galas yra prijungiamas prie kieto pagrindo. Tada didelėmis išeigomis laipsniškai prijungiamos aminorūgštys. N-galinė a-aminogrupė blokuojama taip, kad šią grupę būtų galima atskelti neatskeliant peptido nuo kieto pagrindo. Čia naudojami cheminiai virsmai apima pradinio Merrifield metodo, vadinamo Fmoc metodu, modifikaciją. Fmoc (fluorenilmetoksikarbonilo) grupę galima atskelti švelniai šarminėse sąlygose, kurios palieka nepaliestas šarmams stabilias šoninės grandinės apsaugines grupes ir jungtį su pagrindu. Šią metodiką aprašė E. Atherton and R. C. Sheppard, "Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach", IRL Press, New York, N.Y. (čia duodamas kaip literatūros šaltinis).
[0049] Linijinio hPTH-( 1- 31)- amido analogu sintezė ir gryninimas
[0050] Kopuliavimo metu aminorūgšties a-aminogrupė blokuojama 9-fluorenilmetoksikarbonilu (Fmoc). Kopuliavimo reakcijos vykdomos su hidroksibenzotriazolo (HOBt), 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluorborato (TBTU) ir diizopropiletilamino (DIPEA) mišiniu. Prijungiant Asn, Gln, His, Vai ir lle liekanas, dvigubai kopuliacijai naudojamas aktyvuotų aminorūgščių keturgubas perteklius. Prijungiant Arg ir Gly, kopuliavimo laikai pailginami nuo 30 iki 60 minučių. Pirmosios liekanos (Vai31) kopuliacija prie pagrindo (Tentagel* R, Rapp Polymere, Tubingen, Vokietija) atliekama rankiniu būdu. Visos kitos stadijos atliekamos PerSeptive Biosystems* Model 9050 Plus automatiniu peptidu sintezatoriumi. Šoninės grupės blokuojamos taip: Arg (2,2,5,7,8-pentametilchroman-6-sulfonilu); Glu, Asp ir Ser (t-butilu); His, Gln ir Asn (tritilu); Trp (t-butiloksikarbonilu).
[0051] Atskėlus Fmoc nuo N-galinio Ser, derva su peptidu plaunama DCM, po to vykdomas atskėlimas nuo dervos, plakant su 7,5 ml reagento K (6,19 ml TFA, po 0,38 ml vandens, 90 % fenolio vandenyje ir tioanizolo ir 0,19 ml 1,2-etanditiolio) 4 vai. 20 °C temperatūroje. Atskeltas peptidų mišinys nufiltruojamas ir nusodinamas, pridedant t-butil-metilo eterio. Nuosėdos nucentrifuguojamos, plaunamos 2x t-butilmetilo eteriu, po to džiovinamos vakuuminio centrifugavimo būdu.
[0052] Negrynintas produktas ištirpinamas 14 ml 15 % acetonitrilo tirpalo vandenyje su 0,1 % TFA ir chromatografuojamas per Vydac* Ci8-kolonėlę (10 H, 1 x 25 cm). Produktas eliuuojamas 1%/min acetonitrilo (14-40 %) 0,1 % TFA vandenyje gradientu. Galutinio produkto grynumas nustatomas analitinės HPLC per Vydac* Ci8-kolonėlę (10 n, 0,4 x 25 cm) metodu ir pagal molekulinę masę, nustatomą elektronų srauto masių spektrometru (VG Quattro). Taip gauto hPTH-(1-31)-NH2 duomenys pateikti žemiau duodamoje 1 lentelėje.
[0053] Cikliniu analogu sintezė ir gryninimas
[0054] [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Šis peptidas, turintis atitinkamai 26 ir 22 padėtyse Lys-Alloc ir Glu-OAII, buvo sintezuotas pagal 1 pavyzdyje aprašytą metodiką. Prijungus Fmoc-Ser17, derva su peptidu perkeliama iš kolonėlės j reakcijos indą (Minivial*, Applied Science), suspenduojama 1,7 ml tetrakis(trifenilfosfin)paladžio(0) (0,24 mmol), 5 % acto rūgšties ir 2,5 % N-metilmorfolino (NMM) tirpalo dichlormetane (DCM) argono amosferoje, po to purtoma 20 °C temperatūroje 6 vai., norint atskelti alilo ir alloc apsaugines grupes (Sole, N.A. et ai (1993) in Peptides: Chemistry, Structure, and Biology, Smith, J. and Hodges, R. (Eds), ESCOM pp. 93-94)
[0055] (duodamas kaip literatūros šaltinis). Po -to derva su peptidu plaunama 0,5 % dietilditiokarbamatu (DEDT), 0,5 % NMM DMF (50 ml), po to DMF (50 ml) ir DCM (50 ml). Peptidas (0,06 mmol) ciklizuojamas purtant su 0,06 mmol 1-hidroksi-7-azabenzotriazolo (HOAt)/0,12 mmol NMM 2 ml DMF 14 vai. 20 °C temperatūroje (Carpino, L. A. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 4397-4398). Derva su peptidu nufiltruojama, perplaunama vieną kartą DMF, sudedama j kolonėlę ir plaunama DMF, kol iš suspensijos pašalinami burbuliukai, Toliau sintezė vykdoma taip, kaip aprašyta 1 pavyzdyje, išskyrus tai, kad neatskeliama N-galinė Fmoc grupė. Fmoc-peptidas atskeliamas nuo dervos
[0056] reagentu K taip, kaip aprašyta aukščiau. HPLC vykdoma kaip ir 1 pavyzdyje, prieš galutinę HPLC atskėlus Fmoc grupę.
[0057] [ Leu27] ciklo( Lys26- Asp30)- hPTH-( 1- 31)- NH2 analogas buvo pagamintas pagal analogišką metodiką.
[0058] hPTH analogų geba susirišti su receptoriais ir aktyvuoti susijusj su adenililciklaze signalini mechanizmą buvo nustatoma, panaudojant galinčią diferencijuotis, panašią j osteoblastus ROS 17/2 žiurkių osteosarkomos (ROS) ląstelių liniją.Yra žinoma, kad šis aktyvumas yra tampriai susijęs su analogo geba atstatyti kaulų masę žiurkėms, kurioms buvo pašalintos kiaušidės. Adenililciklazės stimuliavimo aktyvumas buvo jvertintas iš pradžių pažymint ląstelinio ATP sankaupą [3H]-adeninu, po to matuojant kieki [3H]-ciklinio AMP, susidariusio iš [3H]-ATP per pirmąsias 10 min. sąlyčio su konkrečiu analogu. Šis testas paremtas VVhitfield et al, J. Cellular Physiology 150, 299-303, 1992 aprašyta metodika (duodamas kaip literatūros šaltinis).
[0059] Adenililciklazės rezultatai parodyti toliau duodamoje 2 lentelėje, kaip koncentracija, kurios reikia, kad būtų gaunama pusė AC aktyvumo padidėjimo maksimalios reikšmės. Duomenys taip parodyti fig.4. Fig.4 užtušuoti apskritimai rodo hPTH-(1-31)-NH2 adenililciklazės stimuliavimo aktyvumą, o [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2 ir [Leu27]ciklo(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 aktyvumai parodyti atitinkamai neužtušuotais ir užtušuotais trikampiais.
[0060] hPTH analogu anaboliniu aktyvumu nustatymas, panaudojant žiurkiu.
[0061] Dozės buvo paremtos hPTH(1-31)-NH2 dozės-atsako duomenimis.hPTH(1-31)-NH2 kaulų augimo potencija buvo tiriama, panaudojant keletą dozių (0,8, 0,6, 0,4 ir 0,2 nmol/100 g kūno masės), ir labiau regeneracinį arba gydymo gebos, negu prevencinį, modelį [11]. Prieš pradedant 6 savaičių trukmės kasdienines injekcijas, trijų mėnesių amžiaus žiurkės, kurioms buvo pašalintos kiaušidės, buvo laikomos 9 savaites, kad didžioji dalis neplokštelinio šlaunikaulio trabekulinio kaulo būtų gerokai sunykusi. Devintos savaitės pabaigoje jos prarado apie 75 % šlaunikaulio trabekulinio kaulo masės. Fig. 14 parodyta priklausantis nuo dozės vidutinio plokštelinio nusėdimo sukeltas trabekulinio storio padidėjimas, kurį davė šio fragmento 4 skirtingų dozių 36 injekcijos. Šis fragmentas taip pat gali stimuliuoti trabekulinio kaulo augimą ir daug senesnėms žiurkėms. Pavyzdžiui, 36 vidutinio dozių intervalo (0,6 nmol/100 g kūno masės) hPTH-(1-31)-NH2 injecijos gali žymiai padidinti vidutinį trabekulini storį virš normalių pradinių reikšmių prieš tai sunykusio (9 savaitės po OVX) šlaunikaulio trabekulinio kaulo storį 1 metų amžiaus žiurkėms, ir jos veikia taip pat efektyviai, kaip ir hPTH-(1-84) injekcijos. Tuo būdu, kitiems testams buvo pasirinktos 0,6 nmol/100 g kūno masės dozės.
[0062] Pilną metodikos aprašymą davė Rixon et al, J. Bone & Mineral Research 9, 1179-1189, 1994 ir VVhitfield at al, Clasif. Tissue Int. 58, 81-87, 1996 (duodami kaip literatūros šaltiniai). Normalios, apgaulingai-OVX (pašalintos kiaušidės) ir OVX Sprague-Dawley žiurkės (3 mėn. amžiaus; 255-260 g) buvo gautos iš Charles River Laboratories (St. Constant, QC). Žiurkės buvo atsitiktinai paskirstytos grupėmis po 8 gyvuliukus ir gavo Purina žiurkių maistą ir vandenį ad libitum. Neplanuotų mirčių nebuvo. Gyvuliukai gavo 6 (vieną kartą per dieną) injekcijas į savaitę, pradedant nuo antros savaitės galo po OVX ir baigiant aštuntos savaitės gale po OVX (t.y. 36 injekcijas). Aštuonios apgaulingai-OVX ir 8 OVX kontrolinės žiurkės gavo 36 skiediklio injekcijas (0,15 M NaCI, turintis 0,001 N HCI), o 8 OVX žiurkės gavo 0,6 nmol fragmento skiediklyje 100-ui g kūno masės injekcijas. Aštuntos savaitės gale po OVX, šlaunikauliai buvo išimti, nuvalyti, perpjauti per pusę diafizės viduryje ir arčiau kūno esanti pusė buvo išmesta. Pašalinus ilgojo kaulo galą, kiekviena šlaunikaulio pusė buvo perskelta išilgai į dvi dalis ir išimti kaulų čiulpai.
[0063] Fragmentų geba atauginti kaulus buvo jvertinama iš skirtingai gydytų gyvuliukų nutolusios nuo kūno vidurio šlaunikaulio pusės trabekulės vidutinio storio (plotas/perimetras). Norint išmatuoti vidutinį trabekulės storį, kiekvienos žiurkės dvi demineralizuotos šlaunikaulio pusės buvo dehidratuotos ir įtvirtintos parafine. Iš kiekvieno kaulo vidurio plokštumos buvo atpjauti išilginiai 10 ).im pjūviai ir nudažyti Sanderson'o greitaisiais kaulų dažais (Surgipath Medical Industries, Inc., VVinnipeg, MB, Canada). Vidutinis trabekulės storis išmatuotas naudojant M4 vaizdo sistemą ir kaulų morfometrijos programą iš Imaging Research Inc., (St. Catherines, ON, Canada).
[0064] Būdingi kaulų histologiniai pjūviai, paruošti aštuntos savaitės gale po OVX, parodyti fig.5. Šie rezultatai taip pat pateikti stulpelinės diagramos pavidalu fig.7. Stulpeliai rodo normalių žiurkių, žiurkių, kurioms pašalintos kiaušidės (OVX), apgaulingai-OVX žiurkių ir hPTH-(1-31)-NH2, [Leu27]ciklo(Glu22-Lys25)-hPTH-(1-31)-NH2 bei [Leu27]ciklo(Lys26-Asp30)-hPTH-(1-31)-NH2 gydytų žiurkių trabekulių storius. [Leu27]ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2rodo ypatingai daug didesnį aktyvumą lyginant su linijiniu analogu hPTH-(1-31)-NH2. Buvo parodyta, kad šis linijinis analogas yra pilnai aktyvus kaulų atstatymo požiūriu, bet jis naudoja tik vieną ląstelių signalų perdavimo (AC-aktyvacija) kelią. Taigi, galima laukti, kad šie cikliniai analogai, kaip ir jų linijinis analogas, turės mažiau nepageidautinų klinikinių pašalinių efektų nei jų ilgesni atitikmenys, tokie kaip hPTH-(1-34) arba hPTH-(1-84), kurie aktyvuoja abu ląstelių signalų "perdavimo mechanizmus.
[0065] Žiurkiu su žymiai sunykusiais trabekuliniais kaulais kaulu atstatymas hPTH
[0066] Šiame antrame kaulų atstatymo pavyzdyje lyginamas laktaminių fragmentų sugebėjimas atstatyti žymiai sunykusius trabekulinius kaulus.
[0067] h— ■ r w w Šiame eksperimente 6 savaičių trukmės programa, kurioje jaunoms seksualiai subrendusioms žiurkėms vieną kartą per dieną leidžiamos 0,6 nmol peptido/100 g kūno masės injekcijos, buvo pratęsta iki devintos savaitės galo po OVX. Per šį laikotarpį buvo prarasta 75 % jų trabekulinio kaulo. Kaip galima matyti iš f i g. 6, efektyviausias iš fragmentų yra [Leu27]ciklo[Glu22-Lys26]-hPTH-(1 -31 )-NH2. Jis atstatė trabekulinio kaulo tūrį iki normalios kontrolinių žiurkių reikšmės,
[0068] Sprague-Davvley žiurkių patelės (sveriančios daugiau nei 290 g) buvo anestezuotos intraperitoniškai suleidžiant natrio pentobarbitalį (65 mg/kg kūno masės). Rektalinė temperatūra buvo kontroliuojama YSI402 termistoriumi (Yellovv Springs Instrument Co„ Inc. Yellovv Springs, OH) ir per visą eksperimentą palaikoma tarp 36,0 ir 38,5 °C. Taip pat kontroliuojama ausies kaušelio temperatūra, naudojant YSI dengtą termistorių. Buvo apnuoginta uodegos arterija ir i ją įleista kaniulė su Jelco-25g/V kateteriu (Johnson and Johnson Medical Inc., Arlington, TX), kuri sujungiama su Statham slėgio davikliu, ir jo signalai registruojami skaitmeniniu būdu Biopac Systems MP100 monitoriumi (Harvard Instruments, Saint Laurent, QC, Canada). PTH arba vieno iš jo fragmentų intraveninėms injekcijoms buvo apnuoginta šlaunies vena. Po operacijos žiurkei leidžiama stabilizuotis 8 min., po to j šlaunies veną arba po pilvo oda suleidžiamas PTH arba vienas iš jo fragmentų (ištirpintas parūgštintame fiziologiniame tirpale, turinčiame 0,001 N HCI). Duomenys renkami 12 min. po intraveninės injekcijos arba 22 min. po poodinės injekcijos. Fig.8 parodytas maksimalus kraujo spaudimo kritimas ir laikas iki maksimalaus kritimo, suleidus 0,8 nmol/100 g [Leu27]ciklo[Glu22-Lys26]-hPTH-(1-31)-NH2 arba [Leu27]ciklo[Lys26-Asp30]-hPTH-(1-31)-NH2 dozę arba poodiniu (balti stulpeliai), arba intraveniniu (brūkšniuoti stulpeliai) būdu.
[0069] [Leu27]ciklo[Glu22-Lys26]-hPTH-(1-31)-NH2 analogas rodo didesnį bioprieinamumą, lyginant su [Leu27]ciklo[Lys26-Asp30]-hPTH-(1-31)-NH2. Tai
[0070] seka is daug trumpesnio laiko, kurio reikia, kad kraujo spaudimas nukristų iki minimumo po poodinės injekcijos. Abu cikliniai analogai po poodinio suleidimo rodo sustiprintus hipotenzinius efektus, lyginant su hPTH-(1 -31 )-NH2. Taigi, galima tikėtis, kad abu cikliniai analogai, leidžiant juos po oda, turės tinkamesnes savybes nei jų linijinis atitikmuo. Šios savybės yra: didesni bioprieinamumai, atsirandantys dėl padidnto atsparumo proteazėms, ir/arba padidintos gebos būti transportuojamiems iš lipidinės aplinkos. Pastaroji savybė gali būti susijusi su amfifilinės spiralės ties hormono C-galu stabilizacija.
[0071] h-PTH-(1-31)-NH2 (1): [Leu27]-hPTH-(1-31)-NH2 (2) (Fig.9); [Leu27]ciklo[Glu22-Lys26]-hPTH-(1-31)-NH2 (3) (Fig.2); [Leu27]ciklo[Lys26-Asp30]-hPTH-(1-31)-NH2 (4): ciklo[Lys27-Asp30]-hPTH-(1-31)-NH2 (5) (Fig.10); hPTH-(1-30)-NH2 (6): [Leu27]-h-PTH-(1-30)-NH2 (7); [Leu27]ciklo[Glu22-Lys26]-hPTH-(1-30)-NH2 (8).
[0072] Adenililciklazės aktyvumai. Mes anksčiau aprašėme, kad [Leu27]-hPTH-(1-34)-NH2 yra aktyvesnis stimuliuojant AC aktyvumą ROS ląstelių linijoje už hPTH-(1-34)-NH2 [5], Mes taip pat nustatėme, kad peptidas 2 (EC5o, 11,5±5,2 nM) yra aktyvesnis už natyvią seką 1 (EC5o, 19,9=3,9 nM) (Fig.12). Peptidai parodyti simboliais: 1( •); 2 ( ) ; 3 (=$); 4 (A); 5 (o). Laktamo tarp Glu22 ir Lys26 sudarymas (3) indukuoja dar didesnį AC stimuliavimo aktyvumą, ir EC5o reikšmės yra 3,3±0,3 nM (Fig.12). Taigi, vien tik ciklizacijos ir Lys27 pakeitimo Leu efektas yra aktyvumo-" padidėjimas 6 kartus. Priešingai, laktamo sudarymas arba tarp Lys26 ir Asp30 (4) arba tarp Lys27 ir Asp30 (5) sumažina adenililciklazės stimuliavimą, lyginant su pradine linijine seka. Tokiu būdu 26-30 laktamas (4) turi šiek tiek mažesnį aktyvumą nei jo linijinė forma (2) (EC5o = 17,0±3,3 nM lyginant su 11,5±5,2 nM). 27-30 laktamas (5) daug labiau sumažina pradinio linijinio peptido (1) aktyvumą (EC5o = 40,3±34,4 nM lyginant su 19±3,9 nM).
[0073] Anksčiau paskelbėme, kad hPTH-(1-30)-NH2 (6) turi AC stimuliavimo aktyvumą (EC50 = 20 nM) artimą analogo 1 aktyvumui. Dabar mes nustatėme, kad [Leu27]-hPTH-(1-30)-NH2 (7) ir ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-30)-NH2 (8) (Fig. 11) turi panašius kaip ir peptido 6 AC stimuliavimo aktyvumus.
[0074] Hipotenziniai efektai. Fig. 13 parodyta linijinių (6 ir 7) ir ciklinių laktaminių analogų (3 ir 8) hipotenzinis poveikis. Parodyti maksimalūs kraujo spaudimo kritimai (viršuje), gauti suleidus žiurkei 0,8 nmol/100 g kūno masės analogo dozę, ir laikas, per kuri pasiekiamas maksimalus kraujo spaudimo kritimas (apačioje). Analogai (iš kairės j dešinę peptidai 8, 7, 6, 3) buvo suleisti arba intraveniniu būdu (brūkšniuotas stulpelis), arba poodiniu būdu (baltas stulpelis). Vai31 pašalinimas visuose 6, 7 ir 8 analoguose pasireiškė žymiai sumažintais (p<0,05) suleistų po oda peptidų transporto i kraujagyslių sistemą greičiais (fig.13). Tikras bendras kraujo spaudimo kritimas peptidų 6 ir 8 atveju vis dėlto labai nesiskyrė (p>0,05) nuo kitų analogų, nepriklausomai nuo to, ar jie buvo suleisti intraveniniu ar poodiniu būdu, išskyrus peptidą 5.
[0075] Kaip aprašyta 6 pavyzdyje ir parodyta fig.8, greitas hipotenzinis efektas, stebimas po poodinės hPTH analogų injekcijos, turi savitarpio ryši su osteogeniniu aktyvumu. Tokiu būdu šis testas yra naudingas kandidatinių hPTH analogų, kurie galėtų turėti osteogeninj aktyvumą, atrinkimui ir leistų atmesti nehipotsnzinius darinius, nenužudant laboratorinių gyvuliukų.
[0076] Kaip foną mes naudojome unikalų rinkinj osteogeniniu ir. neosteogeninių AC, AC/PLC arba PLC aktyvuojančių PTH fragmentų, norėdami tiksliai jrodyti, kad būtent AC stimuliavimas mažina kraujo spaudimą, ir palyginti šių fragmentų hipotenzinius poveikius, leidžiant juos poodiniu arba intraveniniu būdu žiurkių patelėms. Mes parodėme, kad hipotenzini atsaką sukelia tik AC arba AC/PLC stimuliuojantys fragmentai, ir kad yra palyginus mažas hipotenzinis atsakas j poodinę injekciją ir ne kuo didesnis atsakas j intraveninę injekciją, kuris koreliuojasi su hPTH-(1-31)NH2, hPTH-(1-34) ir hPTH-(1-84) osteogeniniais aktyvumais bandymuose su OVX-žiurkėmis, bet nėra koreliacijos hPTH-(1-30)NH2 atveju, kuris stimuliuoja AC ir mažina kraujo spaudimą, bet nestimuliuoja kaulų formavimosi.
[0077] Konkrečiai imant, hPTH-(1-84) ir jo hPTH-(1-34), hPTH-(1-31)NH2 ir hPTH-(1-30)NH2 fragmentai sumažino anastezuotų Sprague-Dawley žiurkių uodegos arterijos spaudimą 42,4-61,7 % per maždaug 1 min. po injekcijos į šlaunies veną, bet sumažino spaudimą tik 8,5-36,2 % per 2-19 min. po poodinės injekcijos. hPTH-(1-84) ir hPTH-(1-34) stimuliuoja ir adenililciklazę, ir fosfolipazę-C jų tikslinėse ląstelėse, bet hipotenzinis poveikis turėtų būti stimuliuojamas būtent adenililciklazės aktyvavimo, nes hPTH-(1-30)NH2 ir hPTH-(1-31)NH2, kurie gali stimuliuoti tik adenililciklazę, turėjo labai stiprų hipotenzinį poveiki, suleidus juos j veną, tuo tarpu kai hPTH-(7-84), kuris gali stimuliuoti tik fosfolipazę-C, turėjo silpną hipotenzini poveikį, suleidus jį į veną. Kadangi PTH'ų osteogeninis veikimas taip pat yra surištas su adenililciklazės stimuliavimu, galima laukti, kad hipotenzinis atsakas galėtų būti panaudotas naujų PTH darinių, kurie gali pasižymėti osteogeniškumu, atrinkimui. Iš tikrųjų, po oda suleistų hPTH-(1-31)NH2, hPTH-(1-34) ir hPTH-(1-84) osteogeninis aktyvumas glaudžiai koreliuojasi su jų hipotenziniu aktyvumu, iš kurių hPTH-(1-34) turėjo didžiausią hipotenzini poveiki ir daug didesnį nei kitų dviejų molekulių. hPTH-(1-31)NH2 ir hPTH-(1-84) turėjo vienodą osteogeninį ir hipotenzinį poveikį. Tačiau ši koreliacija negalioja hPTH-(1-30)NH2 atveju, kuris stimuliuoja AC beveik taip pat stipriai kaip ir hPTH-(1-31)NH2 ir hPTH-(1-34) ir mažina kraujo spaudimą taip pat kaip ir hPTH-(1-31)NH2, bet nestirnuliuoja kaulų formavimosi. Vis dėlto, sugebėjimas žymiai sumažinti arterinį spaudimą yra bendra osteogeninių PTH ir PTH fragmentų savybė, ir todėl ji yra greitai nustatomas preliminarus PTH fragmentų bioaktyvumo in vivo indikatorius.
[0078] Kalbant dar konkrečiau, ir hPTH-(1-34) ir hPTH-(1-31)NH2 turėjo maksimalų hipotenzinį poveikį, imant 0,8 nmol/100 g kūno masės dozes.
[0079] Šį hipotenzinį atsaką lydi trumpalaikis (20-30 min.) žiurkės ausų ir letenėlių paraudimas, kuris gali būti laikomas naudingu vizualiniu kokybiniu rodikliu.
[0080] Nors AC ir AC/PLC stimuliuojantys fragmentai buvo potenciale hipotenziniai, kai jie suleidžiami j veną, hPTH-(7-84), kuris gali stimuliuoti til PLC, 0,8 nmol/100 g kūno masės intraveninė injekcija labai lėtai (9,8±2,( min) ir tik labai nedaug sumažino uodegos arterijos spaudimą 3,28±1,0 mnr Hg, lyginant su staigiu (0,9±0,08 min) 43,2±5,8 mm Hg sumažinimu, kur sukelia AC/PLC stimuliuojantis hPTH-(1-84) arba taip pat staigiu 51,6±3,C mm Hg kritimu, kuri sukelia AC stimuliuojantis hPTH-(1-31)NH2.
[0081] Viena poodinė AC arba AC/PLC stimuliuojančio fragmento injekcijc sukėlė daug lėtesni ir mažesni uodegos arterijos spaudimo sumažėjimą ne tos pačios dozės intraveninė injekcija. Pavyzdžiui, 0,8 nmol/100 g kūne masės hPTH-(1-34) dozė, suleista po oda, sumažino spaudimą tik 27,9±3,€ mm Hg, lyginant su 50,9±5,6 mm Hg, suleidus ją i veną. Ta pati hPTH-(1 31)NH2 dozė suleista po oda, sumažino spaudimą tik 11,1 ±6,6 mm Hg lyginant su 51,6±53,3 mm Hg, suleidus ją i veną.
[0082] Nėra didelių skirtumų tarp greitų ir didelių uodegos arterijos spaudime sumažėjimų, kuriuos sukelia j veną suleisti hPTH-(1-84), hPTH-(1-34) ir hPTH-(1 -31)NH2. bet hPTH-(1-34) buvo bent jau dvigubai efektyvesnis (p<0,01) ne kitos dvi molekulės, jeigu leidžiama po oda.
[0083] Vienas iš faktorių, kuris turi jtaką hipotenziniam poveikiui ir osteogeniškumui po oda suleistų PTH arba PTH fragmentų, yra jų gebs keliauti, neprarandant aktyvumo, iš injekcijos vietos j jo tikslinę vietą, pirmiausia per kraujagyslių tinklą, o po to j kaulus. Šią gebą atspindi laikas, kurio reikia, kad po injekcijos uodegos arterijos spaudimas nukristų iki minimalios reikšmės. Sutrumpinus PTH molekulę iš C-galo nuo 84 iki 31 liekanos, eliminuojama geba stimuliuoti PLC, nesumažinant gebos stimuliuoti AC, ir tai devynis kartus sumažina laiką, kurio reikia, kad uodegos arterijos spaudimas pasiektų minimumą. Pašalinus dar vieną liekaną ir pagaminant hPTH-(1-30)NH2, laikas, kurio reikia, kad kraujo spaudimas pasiektų minimumą, dramatiškai pailgėja nuo 2,0±0,31 min. hPTH-(1-31)NH2 atveju iki 13,8±2,3 min. Tačiau svarbu pažymėti, kad hPTH-(1-31)NH2 atveju kraujo spaudimo mažinimas užtrunka ne ilgiau, kaip hPTH-(1-84) atveju.
[0084] Panaudojimas šiame tyrime hPTH-(1-31)-NH2 - pirmojo PTH darinio, kuris gali stimuliuoti AC taip pat stipriai, kaip ir hPTH-(1-34), neaktyvuodamas PLC ir nestimuliuodamas susijusių su membranomis PKC'ų aktyvumo - dabar duoda tiesiogini įrodymą, kad PTH'ų hipotenzinis veikimas yra vien tik dėl AG aktyvacijos. Tokiu būdu, nors intraveninės 0,8 nmol/100 g kūno masės hPTH-(7-84), kuris gali stimuliuoti tik PLC/PKC, injekcijos žymiai nekeičia uodegos arterijos spaudimo, tos pačios dozės hPTH-(1-31)-NH2 intraveninės injekcijos mažina spaudimą taip pat kaip ir h-PTH-(1-34).
[0085] Kadangi AC taip pat tarpininkauja PTH sukeltame OVX-žiurkių kortikalinio ir trabekulinio kaulų susidarymo stimuliavime, atrodo, kad hipotenzinio atsako gavimas sveikoms žiurkių patelėms yra paprastas, greitai išmatuojamas PTH darinių galimo osteogeniškumo rodiklis. Antra vertus, negavus arterinio spaudimo sumažėjimo, reikėtų konkretaus fragmento daugiau nebetyrinėti, tokiu būdu išvengiant bereikalingo, brangaus ir ilgalaikio tyrimo su OVX-žiurkėmis. PTH'ų hipotenziniai atsakai j intraveninę injekciją nebuvo koreliuoti su osteogeniškumais. Tačiau daug mažesni hipotenziniai atsakai j suleistus po oda hPTH-(1-31)NH2, hPTH-(1-34) ir hPTH-(1-84) eina lygiagrečiai su šių molekulių osteogeniškumais, kur hPTH-(1-34) turi stipriausią hipotenzini ir osteogenini poveiki, o kitos dvi molekulės yra vienodai veiksmingos, tačiau jos mažiau veikia j kraujo spaudimo sumažėjimą ir kaulų susidarymo stimuliavimą nei hPTH-(1-34). Tačiau ši koreliacija negalioja hPTH-(1-30)NH2 atveju, kuris stimuliuoja AC beveik taip pat stipriai kaip ir hPTH-(1-31)NH2 ir hPTH-(1-34) ir mažina kraujo spaudimą taip pat kaip ir hPTH-(1-31)NH2, bet nestimuliuoja kaulų formavimosi [11], Lieka neaišku, kodėl šiuo atveju nėra osteogeniškumo. Nepanašu, kad taip yra vien tik dėl to, kad po oda suleistam hPTH-(1-30)NH2 reikia daugiau laiko kraujo spaudimui sumažinti, nes po oda suleistam hPTH-(1-84) reikia tiek pat laiko, kad sumažėtų kraujo spaudimas, tačiau jis yra labai osteogeninis. Aišku, kad osteogeninis atsakas priklauso nuo daugelio įvairių faktorių, kurių kombinacija apsprendžia pakankamai aktyvaus hormono arba hormono fragmento atkeliavimą iš injekcijos vietos į tikslinius PTH receptorius ekspresuojančius subrendusius osteobastus. AC stimuliuojančio, kraujo spaudimą mažinančio hPTH-(1-30)NH2 nesugebėjimas stimuliuoti kaulų formavimosi gali būti dėl didesnio nestabilumo, šiek tiek didesnės AC stimuliacijos EC50 reikšmės (t.y. 20 nm vietoj 16 nM hPTH-(1-31)NH2 ir hPTH(1-34)) ir ilgesnio laiko, reikalingo patekti į cirkuliaciją iš injekcijos vietos.
[0086] Nežiūrint į tai, kad hPTH-(1-30)NH2 nėra osteogeninis, geba žymiai sumažinti arterinį spaudimą vis tik yra bendra osteogeninių PTH'ų savybė, taigi tai yra greitai nustatomas galimo PTH fragmentų bioaktyvumo in vivo rodiklis, iš to seka, kad hipotenzinis atsakas turėtų taip pat būti efektyvus osteogeninio PTH darinio sugebėjimo pasiekti taikini, Įvedus ji peroraliniu arba kitokiu neinjekciniu būdu, rodiklis.
[0087] Hipotenzinės reakcijos kiekvienai injekcijai diskomfortas ir kitokios galimos pasekmės galėtų mažinti osteoporozinių pacientų ryžtą ilgą laiką gydytis PTH arba PTH fragmentu. Laimei, dabartiniu metu kaulų formavimosi stimuliavimui yra naudojamos kaitaliojamos PTH'ų injekcijos, ir šios molekulės turi daug mažesni hipotenzinį poveikį, kai jos leidžiamos po oda, lyginant su intraveninėmis injekcijomis. Kaip anksčiau įrodėme [6,7], hPTH-(1-31)NH2 turėtų turėti papildomą AC stimuliavimo pranašumą, nestimuliuodamas PLC ir jis neturėtų sukelti pašalinių efektų, kuriuose potencialiai tarpininkauja Ca2+ ir PKC.
[0088] 7 pavyzdys
[0089] Ciklo( Lys27- Asp30)- hPTH-( 1- 31)- NH2 ( 5). Sintezė vykdoma taip pat kaip ir [Leu27]-ciklo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2. Nustatyta, kad produkto grynumas yra >95 %, o molekulini masė 3700,64 (±0,38) (laukiama M + 1 = 3700,14). Laktamo padėties patvirtinimui nustatyta peptido seka.
[0090] [ Leu27]- ciklo( Glu22- Lys26)- hPTH-( 1- 31)- NH2 ( 8). Šis peptidas buvo sintetintas kaip ir peptidas 3, nenaudojant rankinio Vai prijungimo prie pagrindo. Nustatyta, kad produkto grynumas yra >97 %, o molekulinė masė 3586,14 (±0,19) (laukiama M + 1 = 3685,99).
[0091] oio įsraaimo analogai gan duli sKinami siuaKraujams zinauonams (jeigu to reikia), konkrečiai žmogui, parenteriniu, topiniu arba rektaliniu būdu, arba inhaliacijomis bei peroraliniu būdu. Gali būti patogiai pagaminama šių analogų parenterinė dozuota forma, kurioje yra maždaug 1-300 mg junginio dozuotame vienete kartu su įprastu skiedikliu, pagalbine medžiaga, rišikliu, apsaugine medžiaga, stabilizatoriumi, nuspalvinančiu agentu ir pan., kaip reikalauja Įprasta farmacinė praktika.
[0092] Vartojant parenteriniu būdu, ne dažniau kaip vieną kartą per dieną reikia padaryti 1-2 ml neskausmingą injekciją labai plona 30 mm švirkšto adata 1-2 metus (priklausomai nuo ligos aštrumo). Suleidžiamoje medžiagoje turėtų būti viena iš šio išradimo medžiagų vandeniniame izotoniniame steriliame tirpale arba suspensijoje (gali būti su apsaugine medžiaga, tokia kaip fenolis, arba su solubilizuojančiu agentu, tokiu kaip etilendiamino tetraacto rūgštis (EDTA)). Galimais vartoti skiedikiais ir tirpikliais yra vanduo, silpnai parūgštintas vanduo, Ringerio tirpalas ir izotoninis natrio chlorido tirpalas. Be to, kaip tirpikliai arba suspendavimo terpės paprastai yra vartojamos sterilios nelakios alyvos. Injekcijoms skirtų vaistinių formų gamyboje kaip nelakios alyvos randa pritaikymą sintetiniai monogliceridai, digliceridai, riebalų rūgštys (tokios kaip oleino rūgštis).
[0093] Rektaliniam vartojimui šio išradimo analogai gali būti paruošiami žvakučių forma, sumaišant juos su tinkama neerzinančia pagalbine medžiaga, tokia kaip kakavos sviestas arba poiletilenglikoliai.
[0094] Topiniam vartojimui šio išradimo analogai gali būti paruošiami tepalų, želė, tirpalų, suspensijų arba derminių pleistrų forma.
[0095] Inhaliacijoms skirtos .formos gali būti pagaminamos, pavyzdžiui, PCT publikuotoje paraiškoje nr. VV094/07514 aprašytais būdais.
[0096] Dienos dozė neturėtų viršyti 0,05 mg/kg kūno masės arba maždaug 3,5 mg/70 kg žmogui priklausomai nuo konkretaus junginio aktyvumo, gydomo subjekto amžiaus, svorio, lyties ir būklės. Kaip turėtų būti gerai žinoma, veikliojo ingrediento kiekis, kuris turi būti sumaišomas su nešikliais gaminant atskirus dozuotus vienetus, keisis priklausomai nuo gydomo subjekto ir nuo konkretaus vartojimo būdo.
[0097] Toliau duodamose lentelėse pateikiamas sąrašas analogų, kurie buvo pagaminti pagal aukščiau aprašytas metodikas.
[0098]
[0099] [1] Caulfield, M. P.; McKee, R. L.; Goldman, M, E.; Duong, L. T.; Fisher, J. E.; Gay, C. T.; DeHaven, P. A.; Levy, J. J.; Roubini, E.; Nutt, R. F.; Chorev, M.; Rosenblatt, M. The Bovine Renal Parathyroid Hormone (PTH) Receptor Has Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequencies - The Receptor Binding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located VVithin the 14-34 Region. Endocrinology 1990, 127, 83-87.
[0100] [2] Neugebauer, W.; Barbier, J.-R.; Sung, W. L.; VVhitfield, J. F.; VViIlick, G. E. Solution Structure and Adenylyl Cyclase Stimulating Activities of C-Terminal Truncated Human Parathyroid Hormone Analogues. Biochemistry 1995, 34, 8835-8842.
[0101] [3] Gardella, T. J.; VVilson, A. K.; Keutmann, H. T.; Oberstein, P..; Potts, J. T.; Kronenberg, H. M., and Nussbaum, S. R. Analysis of Parathyroid Hormone's Principal Receptor-Binding Region by Site-Directed Mutagenesis and Analog Design. Endocrinology 1993, 132, 2024-2030.
[0102] [4] Marqusee, S.; Baldvvin, R. L. Helix Stabilization by Glu...Lys+ Salt Bridges in Short Peptides De Novo Design. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987, 84, 8898-8902.
[0103] [5] Surevvicz, W. K.; Neugebauer, W.; Gagnon, L.; MacLean, S.; VVhitfield, J. F.; VViIlick, G. E. Structure-Function Relationships in Human Parathyroid Hormone: The Essential Role of Amphiphilic-Helix. In Peptides: Chemistry, Structure, and Biology 1993; Smith, J.; Hodges, R., Eds.; ESCOM Leiden, The Netherlandes, 1993, pp.556-558.
[0104] [6] VVhitfield, J. F.: Morley, P.: VViIlick, G. E.; Ross, V.; Barbier, J. R.;lsaacs, R. J.; Ohannessianbarry, L. Stimulation of the Growth of Femoral Trabecular Bone in Ovariectomized Rats by the Novel Parathyroid Hormone Fragment, hPTH-(1-31)NH2 (Ostabolin). Calcif. Tissue Int. 1996, 58, 81-87.
[0105] [7] VVhitfield, J. F.: Morley, P. Small Bone-Building Fragments of Parathyroid Hormone: New Therapeutic Agents for Osteoporosis. Trends Pharmacol. Sci. 1995, 16, 382-386.
[0106]
1. Žmogaus paratiroidinio hormono hPTH analogas, turintis tokią aminorūgščių seką:R-NH-R1-Val-Ser-Glu-lle-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-Rl2-R13-Y,kuriojeR = vandenilis arba bet kokios linijinės arba šakotosios grandinės alkilas,acilas arba arilo grupė,R1 = Ser, Ala arba Aib,R2 = Met arba gamtinė hidrofobinė aminorūgštis,R3 = His arba tirpi vandenyje aminorūgštis,R4 = Leu arba tirpi vandenyje aminorūgštis,R3 = Asn arba tirpi vandenyje aminorūgštis,Rs = Ser arba tirpi vandenyje aminorūgštis,R7 = Met arba gamtinė hidrofobinė aminorūgštis,R8 = Glu, Lys, Cys, Orn arba Asp,R9 = Arg, Lys, Orn, His, Cys arba Glu,R10 = Lys, Orn, Cys, Glu arba Asp,R11 = gamtinė hidrofobinė arba polinė aminorūgštis,R12 = Cys, Glu, Asp, Lys arba Orn,R13 = Asp, Cys arba Lys,X = OH, NH2irY = X, Val-X, Val-His-X, Val-His-Asn-X, Val-His-Asn-Phe-X, Val-His-Asn-Phe-Val-X, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-X irVal-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-X,ciklizuotas tarp vienos arba dviejų aminorūgščių porų 22 ir 26, 26 ir 30, 27 ir 30 ir 25 ir 29, kai R9 yra Lys arba Orn, ir R12 yra Glu arba Asp, kuriame viena iš ciklizacijų yra tarp aminorūgščių 22 ir 26 arba tarp aminorūgščių 25 ir 29,ir jo farmaciškai tinkamos druskos.
R-NH-R1-Val-Ser-Glu-lle-Gln-Leu-R2-His-Asn-Leu-Gly-Lys-R3-R4-R5-R6-R7-Glu-Arg-Val-R8-Trp-Leu-R9-R10-R11-Leu-Rl2-R13-Y,kuriojeR = vandenilis arba bet kokios linijinės arba šakotosios grandinės alkilas,acilas arba arilo grupė,R1 = Ser, Ala arba Aib,R2 = Met arba gamtinė hidrofobinė aminorūgštis,R3 = His arba tirpi vandenyje aminorūgštis,R4 = Leu arba tirpi vandenyje aminorūgštis,R3 = Asn arba tirpi vandenyje aminorūgštis,Rs = Ser arba tirpi vandenyje aminorūgštis,R7 = Met arba gamtinė hidrofobinė aminorūgštis,R8 = Glu, Lys, Cys, Orn arba Asp,R9 = Arg, Lys, Orn, His, Cys arba Glu,R10 = Lys, Orn, Cys, Glu arba Asp,R11 = gamtinė hidrofobinė arba polinė aminorūgštis,R12 = Cys, Glu, Asp, Lys arba Orn,R13 = Asp, Cys arba Lys,X = OH, NH2irY = X, Val-X, Val-His-X, Val-His-Asn-X, Val-His-Asn-Phe-X, Val-His-Asn-Phe-Val-X, Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-X irVal-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-X,ciklizuotas tarp vienos arba dviejų aminorūgščių porų 22 ir 26, 26 ir 30, 27 ir 30 ir 25 ir 29, kai R9 yra Lys arba Orn, ir R12 yra Glu arba Asp, kuriame viena iš ciklizacijų yra tarp aminorūgščių 22 ir 26 arba tarp aminorūgščių 25 ir 29,ir jo farmaciškai tinkamos druskos.2. Analogas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra ciklizuotas laktamine forma tarp aminorūgščių porų 22/26, 26/30, 25/29, kai R9 yra Lys arba Orn ir R12 yra Glu arba Asp, arba tarp aminorūgščių poros 27/30, kai R11 ir R13 yra Lys arba Asp; arba ciklizuotas disulfidinio tiltelio forma tarp Cys porų 22/26, 26/30 arba 25/29.
3. Analogas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad ciklizacija yra laktaminės formos arba disulfidinio tiltelio formos.
4. Analogas pagal bet kurj iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad laktamas yra 22-26 laktamas, Glu22-Lys26 laktamas arba 25-29 laktamas.
5. Analogas pagal bet kuri iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad R yra H, o X yra NH2.
6. Analogas pagal bet kurį iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad R11 yra Lys arba Leu.
7. Analogas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad R2 ir R7 yra M et arba Nle.
8. Analogas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad R1 yra Ser, R2 yra Met, R7 yra Met, R8 yra Glu, R9 yra Arg, R10 yra Lys, R12 yra Gln, o R13 yra Asp.
9. Analogas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad R3 yra His arba Lys, R4 yra Leu, Lys arba Arg, R5 yra Asn, Orn, Hci, Asp, Arg, Lys, D-Lys, Ser arba Gly, o R6 yra Ser, Lys, Asp arba Arg.
10. Analogas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad R3-R6 yra His-Lys-Lys-Lys, His-Leu-Lys-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys arba His-Leu-Lys-Ser.
11. Analogas pagal 8 punktą, besiskiriantis tuo, kad Y = X, Y= Val-X arba Y = Val-Leu-Asn-Phe-X.
12. Analogas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo seka yra SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 arba SEQ ID NO:19.
13. Analogas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad R11 yra Lys, Leu, Asp, Gln, Ala, Nle, lle arbaTyr.
14. Žmogaus paratiroidinio hormono hPTH (1-31) analogas, besiskiriantis tuo, kad jo 27 padėtyje yra Lys arba jis yra pakeistas tinkama hidrofobine liekana, ir jis yra ciklizuotas tarp Glu22 ir Lys26, sudarant laktamą.
15. Analogas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrofobinė liekana yra Leu, o analogas C-gale turi arba amidinę grupę, arba karboksigrupę.
16. Analogas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad hidrofobinę liekaną pasirenka iš grupės, susidedančios iš lle, norleucino, M et ir a-aminosviesto rūgšties.
17. Analogas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo seka yra SEQ ID NO:3.
18. Kompozicija skirta vartoti jos reikalingam šiltakraujui gyvūnui, besiskirianti tuo, kad joje yra žmogaus paratiroidinio hormono (hPTH)-(1-31) analogas pagal 14 punktą kartu su farmaciškai tinkamu nešikliu arba pagalbine medžiaga.
19. Kompozicija pagal 18 punktą, besiskirianti tuo, kad šiame analoge hidrofobinė liekana yra Leu.
20. Kompozicija pagal 18 punktą, besiskirianti tuo, kad šiame analoge hidrofobinę liekaną pasirenka iš grupės, susidedančios iš lle, norleucino, Met ir a-aminosviesto rūgšties.
21. Kompozicija pagal 18 punktą, besiskirianti tuo, kad šio analogo seka yra SEQ ID NO:3.
22. Žmogaus paratiroidinio hormono hPTH (1-31) analogas pagal 14 punktą, skirtas panaudoti šiltakraujo gyvūno gydymui.
23. Analogas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad šiame analoge hidrofobinė liekana yra Leu.
24. Analogas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad šiame analoge hidrofobinę liekaną pasirenka iš grupės, susidedančios iš lle, norleucino, Met ir a-aminosviesto rūgšties.
25. Analogas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad šio analogo seka yra SEQ ID NO:3.