[LT] Šis išradimas yra susijęs su farmacine kompozicija, skirta Alchaimerio ligos gydymui. Farmacinės kompozicijos sudėtyje veikliąja medžiaga yra 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onas (junginys A), kurios veiksmingumas paremtas baltymo -amiloido indukuoto neuronų toksiškumo sumažinimu.
[EN] Disclosed is a pharmaceutical preparation intended for treatment of the Alzheimer's disease. The preparation contains as an active substance 2-phenyl-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one (called compound A), the efficiency of which for reducing neuronal toxicity induced by -amyloid-proteins is proven.
[0001] Šis išradimas yra skirtas profilaktinei ir/arba terapinei Alchaimerio ligai gydyti skirtai farmacinei kompozicijai, kurioje kaip veiklioji medžiaga yra 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onas; be to, ši veiklioji medžiaga sumažina toksiškumą neuronams, kurj sukelia baltymas p-amiloidas.
[0002] Kai kuriose šalyse kaip profilaktiniai ir/arba terapiniai vaistai nuo Alchaimerio ligos yra naudojami acetilcholinesterazės inhibitoriai, tokie kaip pvz. fizostigminas arba tetrahidroaminoakridinas (THA). Tačiau jie rezultatų nedavė. Taip pat buvo bandyta panaudoti nervų sistemą veikiančius 5-HT-antagonistus, bet jų poveikio mechanizmas dar nėra visiškai ištirtas.
[0003] Yra žinoma (žr. S. J. Stohs, J. of Basic and Clin. Phys. and. Pharm., 1995, 6: 205-228 apžvalgą), kad su amžiumi susijusių ligų, įskaitant Alchaimerio ligą ir kitus neurologinius sutrikimus, patofiziologijoje didelj vaidmenį vaidina reaktingos deguonies formos (laisvieji radikalai). Jų metabolinėje detoksikacijoje dalyvauja fermentas - glutationperoksidazė.
[0004] Patologiniai Alchaimerio ligos požymiai apima senilines plokšteles ir PTH (suporuotų spiralinių skaidulų) sankaupą smegenyse.
[0005] p-Amiloidas (toliau žymimas AP), kuris yra senilinių plokštelių pagrindinė sudėtinė dalis, yra netirpus peptidas, susidedantis iš maždaug 40 aminorūgščių liekanų. Buvo nustatyta, kad Ap biochemiškai kenkia neuronams ir kad šį poveikį ypatingai sukelia koaguliuotas netištirpęs Ap.
[0006] Todėl buvo norima surasti medžiagą, kuri tiktų Alchaimerio tipo senatvinės silpnaprotystės progresavimo profilaktikai ir/arba gydymui ir sukurti kompoziciją, kuri slopintų toksinio Ap sukeltą neuronų žuvimą, bei neutralizuotų oksidacinio streso sukeltus laisvuosius radikalus.
[0007] Yra žinoma, kad 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onas (arba ebselenas) in vivo pasižymi panašiu į glutationperoksidazę aktyvumu (A. Muller et ai., Biochem. Pharmacol. 1984, 33: 3235; (A. Muller et al., Biochem. Pharmacol. 1985, 34: 1185; H. Sies, Free Radical. Biol. Med. 1993, 14:313) ir gali naikinti aukščiau minėtus laisvuosius radikalus. Ebselenas veikia prieš hipoksijos/išemijos sukeltą neuronų pažeidimą (S. Knollema et al., Neuroscience Res. Comm., 1996, 19: 47-56), pasižymi neuroapsauginėmis savybėmis prieš smegenų pažeidimus, sukeltus žiurkėms panaudojant trumpalaikės židininės smegenų išemijos modelj (D. A. Dawson et al., Neurosci. Lett., 1995, 185: 65-69), sumažina kepenų intoksikaciją, hemoraginį pankreatitą (H. Johshita et al., Actą Neurochir., suppl. 1990, 51:239). PCT paraiškoje WO 92/02221 aprašytas ebseleno panaudojimas cis-platinos šalutinių poveikių (nefrotoksiškumo ir neurotoksiškumo) sumažinimui ir profilaktikai.
[0008] Šio išradimo autoriai atliko du plačius tyrimus, ir netikėtai surado, kad 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onas (ebselenas) (toliau žymimas junginys A) inhibuoja neuronų žuvimą, kurj sukelia Ap. Tokiu būdu šiame išradime siūloma panaudoti jungini A. kaip profilaktinę ir/arba terapinę farmacinę priemonę Alchaimerio ligai gydyti.
[0009] Ap buvo identifikuotas kaip patologinio Alchaimerio ligos požymio senilinių plokštelių pagrindinė sudedamoji dalis. Jis susideda iš 39-40 aminorūgščių liekanų. Be to, yra žinoma, kad AP turi neurotoksinį poveiki ir tuo būdu sukelia ląstelės žuvimą. Visai neseniai buvo rasta, kad neurotoksinio Ap sukeltas PC12 ląstelių žuvimas, esant Ap, slopinamas, kai įvedamas junginys A (ebselenas). Todėl galima manyti, kad junginys A yra puiki profilaktinė ir/arba terapinė priemonė Alchaimerio ligos gydymui.
[0010] Šiame išradime naudojamas junginys A gali būti susintetintas Japonijos patente (kokoku) Nr. 2-38591 (Japonijos patentinė publikacija (kokai) Nr. 57-67568) aprašytu būdu.
[0011] Junginys A gali būti paruošiamas vartojimui įvairiomis vaistinėmis formomis, tokiomis, kaip pavyzdžiui, tabletės, kapsulės, milteliai, granulės, sirupai arba injekcijoms skirtos formos, panaudojant žinomas vaistų gaminimo metodikas ir priedus, nešiklius, rišančias medžiagas, tabletes ardančias medžiagas bei tirpiklius.
[0012] Toliau duodamoje lentelėje pateikiama, pavyzdžiui, tabletės sudėtis:
[0013] Junginys A turi aukščiau aprašytą poveikj bet kokiu vartojimo būdu, pavyzdžiui, jprastu peroraliniu būdu arba parenteriniu būdu, pvz. injekcijomis.
[0014] Naudojant peroraliniu būdu, junginio A dozė suaugusiam yra 100-2000 mg/dienai ribose, geriausia 200-1000 mg/dienai ribose; be to, priklausomai nuo paciento klinikinės būklės, ji gali būti atitinkamai padidinta arba sumažinta.
[0015] Tiriant junginio A toksiškumą, buvo nustatyta LD5o vertė pelėms ir žiurkėms. Pagal išradėjų duomenis nustatytos LD5o vertės pelėms yra >6810 mg/kg, jvedant peroraliniu būdu, ir 740 mg/kg - jvedant intraperitoniniu būdu. Nustatytos LD5o vertės žiurkėms yra >6810 mg/kg, jvedant peroraliniu būdu, ir 580 mg/kg - jvedant intraperitoniniu būdu. Šios LD5o vertės rodo, kad junginys A yra labai netoksiškas.
[0016] Taigi, kai pelėms ir žiurkėms buvo duodama didelė junginio A dozė, nebuvo stebima jokių problemas sukeliančių šalutinių poveikių.
[0017] Toliau šis išradimas aprašytas -pavyzdžiais, kurie neapriboja jo apimties.
[0018] Junginio A, kaip AP sukelto neuronų žuvimo inhibitoriaus, poveikis,
[0019] Išaugintos PC12 ląstelės (iš žiurkių, chromafininis auglys) buvo vėl auginamos 100 mm lėkštelėje (Corning gaminys), kuri padengta polilizinu ir j kurią jpilta DMEM terpės, turinčios 10 % FCS ir 5 % arklio serumo (Sigma produktas). Kitaip tariant, PC12 ląstelės (1x 106 ląstelių/lėkštelei) buvo auginamos polilizinu padengtoje 100 mm lėkštelėje. Skirtingai nuo nurodymų PC12 ląstelėms, šios PC12 ląstelės buvo auginamos 7 dienas DMEM terpėje, kurioje buvo 5 % FCS, 50 ng/ml NGF ir 1 % arklio serumo. Norint gauti ląstelių suspensiją, PC12 ląstelės susiurbiamos pipete ir suspenduojamos tinkamoje terpėje. Ląstelių suspensija išpilstoma j polilizinu padengtą plokštelę su 96 duobutėmis po 1x104 ląstelių/duobutei. J duobutes pridedama AP (Bachem Feinchemikalien AG), kad galutinė jo koncentracija būtų 10 |iM. Po to pridedamas junginys A, kad jo galutinė koncentracija būtų 0,1, 1,0 arba 2,5 |iM. Kaip kontrolinė medžiaga naudojamas junginys B (junginys A, kuriame Se pakeistas siera, neturintis j glutationoksidazę panašaus poveikio; 2-fenil-1,2-benzotiazol-3(2H)-onas; gautas iš Nattermann) lygiai tokios pačios koncentracijos ir tokiu pačiu būdu. Pridėjus junginio A arba junginio B, ląstelės buvo auginamos 48 vai.
[0020] J taip apdorotas ląsteles pridedama MTT reagento (3-(4,5-dimetiltiazol-2-i I) -2,5-dif eniltetrazol r o bromido). Inkubuojama 4 vai., ir ląstelės lizuojamos. Toliau apdorojama panaudojant taip vadinamą MTT būdą, kuris paremtas kolorimetriškai nustatoma reagento redukcijos reakcija, ir iš to įvertinamas suspensijoje esančių ląstelių gyvybingumas (Behl, C. et a!., Cell, 77: 817-827).
[0021] T testas skaičiuojamas grupėms, kuriose buvo pridėtas A|3 (10 įiM).
[0022] Kaip galima vienareikšmiškai matyti iš 1 lentelės, neuronų žuvimą sukėlė AJ3, be to, junginys B žuvimo greičio nepaveikė. Tačiau pridėjus 0,1 įiM, 1 |iM arba 2,5 įiM junginio A, visais atvejais žymiai inhibuojamas neuronų žuvimas (P<0,0082, P<0,0018 ir P<0,0001).
[0023] Išaugintos PC12 ląstelės (iš žiurkių, chromafininis auglys) buvo vėl auginamos 100 mm lėkštelėje (Corning gaminys), kuri padengta polilizinu ir į kurią jpilta DMEM terpės, turinčios 10 % FCS ir 5 % arklio serumo (Sigma produktas). Kitaip tariant, PC12 ląstelės (1x 106 ląstelių/lėkštelei) buvo auginamos polilizinu padengtoje 100 mm lėkštelėje. Skirtingai nuo nurodymų PC12 ląstelėms, šios PC12 ląstelės buvo auginamos 7 dienas DMEM terpėje, kurioje buvo 5 % FCS, 50 ng/ml NGF ir 1 % arklio serumo. Norint gauti ląstelių suspensiją, PC12 ląstelės susiurbiamos pipete ir suspenduojamos tinkamoje terpėje. Ląstelių suspensija išpilstoma į 60 mm polilizinu padengtą lėkštelę su 96 duobutėmis po 1x104 ląstelių/duobutei. Kai ląstelės prilipo, buvo atliktas toks bandymas.
[0024] Tokios prilipusios PC12 ląstelės patalpinamos j DMEM terpę, pridedama 10 jaM SNAP ir 2,5 p.M junginio A. j kontrolinę grupę pridedama tik SNAP. Kiekvienas bandinys inkubuojamas 3 vai. Kiekvienas PC12 turintis bandinys sumaišomas su paruoštu DCFH-DA tirpalu (Molecular Probes, Inc.) DMSO (1 mg/413 įiI), kad galutinė jo koncentracija būtų 5 |iM. Po to bandiniai inkubuojami 30 min. Ląstelės pašalinamos panaudojant tripsiną-EDTA ir vėl surenkamos centrifuguojant (1000 aps. x 5 min.) Vėl surinktos ląstelės suspenduojamos 50 įJ PBS(-) šaldant ledu. Viduląstelinio vandenilio peroksido kiekis nustatomas srovės citometru. Atliekamas ląstelių suspensijos FACS (fluorescencinis aktyvuotų ląstelių rūšiavimas) ir išmatuojamas peroksidu oksiduotos fluorescuojančios medžiagos - 2',7'-dichlorfluoresceino (DCFH) - kiekis. Buvo nustatyta, kad pridėjus SNAP pasigamino 1,3-1,4 kartus daugiau vandenilio peroksido, negu tuo atveju, kai SNAP nebuvo pridėta. Šis padidintas vandenilio peroksido susidarymas dėl SNAP pridėjimo yra aiškiai slopinamas, kai pridedama 2,5 |iM junginio A (P < 0,0015).
[0025] SNAP: S-nitrozo-N-acetil-DL-penicilinaminas
[0026] Čia turima omenyje tai, kad iš Ap atsiradęs NO pagreitina vandenilio peroksido susidarymą. Tačiau, kaip matyti iš 2 lentelės, vandenilio peroksido susidarymas yra gana gerai slopinamas pridėjus 2,5 įiM junginio A.
[0027] Neseniai buvo pabrėžiama, kad esant Alchaimerio ligai, apoptozė turi ryšj su neuronų žuvimu. Dėl to vėliau buvo teigiama, kad Ap sukelia neuronų žuvimą ir kad vandenilio peroksido susidarymas yra neurotoksiškumo priežastis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 7951-7955, 1993).
[0028] Kaip aprašyta aukščiau, Ap sukeltas vandenilio peroksido susidarymas yra aiškiai slopinamas, pridėjus junginio A. Todėl galima teigti, kad junginys A turi turėti puikų profilaktini arba terapini poveikį gydant Alchaimerio ligą. Taigi, šiame išradime aptariamas junginys A yra ypatingai tinkamas profilaktinei arba terapinei kompozicijai, skirtai senatvinės silpnaprotystės, ypač Alchaimerio ligos, gydymui gauti.
[0029] Polilizinas - lizino polipeptidas, turintis jvairaus ilgio grandines;
[0030] DMEM - Delbecco modifikuota Eagle terpė;
[0031] DCFH - 2',7'-dichlorfluoresceinas;
[0032] FCS - fetalinis veršiuko serumas;
[0033] DMSO - dimetilsulfoksidas;
[0034] Tripsino EDTA - kompleksas etilendiaminotetraacto rūgšties pagrindu;
[0035] Taigi, šis išradimas yra skirtas farmacinei kompozicijai Alchaimerio ligos gydymui. Išradime siūlomoje farmacinėje kompozicijoje, kaip veiklioji medžiaga, yra 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onas (junginys A), kurio poveikis pagrįstas p-amiloido sukelto neurotoksiškumo sumažinimu.
1. 2-Fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-ono panaudojimas farmacinei kompozicijai, skirtai silpnaprotystės profilaktikai ir/arba gydymui, pagaminti.
2. Panaudojimas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad ši farmacinė kompozicija yra skirta senatvinės silpnaprotystės profilaktikai ir/arba gydymui.
3. Panaudojimas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad ši farmacinė kompozicija yra skirta Alchaimerio tipo senatvinės silpnaprotystės profilaktikai ir/arba gydymui.
4. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad joje kaip veiklioji medžiaga yra 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onas, ir ši kompozicija yra skirta Alchaimerio ligos profilaktikai ir/arba gydymui.
5. Vaistas pagal bet kurj iš aukščiau apibrėžtų punktų, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad jis yra vartojamas tablečių, kapsulių, miltelių, granulių, sirupo arba injekcijoms skirtų vaistinių formų pavidalu.