[LT] Šiame išradime pateikiamas N-karbamoilmetilheksametilentetraamonio chloridas, pasižymintis antimikrobiniu aktyvumu. Išradime taip pat pateikta jo sintezė, antimikrobinis aktyvumas bei ūmus toksiškumas. Patentuojamas junginys pasižymi mažu toksiškumu (LD50=2890 mg/kg). Nustatyta, kad tai plataus antimikrobinio spektro medžiaga. Ji ypač efektyvi prieš Salmonella spp. ir Pseudomonas aeruginosa bakterijas.
[EN] The present invention relates to N-carbamoylmethyl hexamethilentetraammonium chloride which obtains antimicrobial activity. The method of synthesis, antimicrobial activity and acute toxicity are described. The novel compound shows low toxicity (LD50=2890 mg/kg) and provides antimicrobial activity esspecially on Salmonella spp. and Pseudomonas aeruginosa bacterium.
[0001] Išradimas priklauso farmacijos sričiai, nes gali būti naudojamas kaip antimikrobinis vaistas veterinarijos, medicinos ir kitoms sritims.
[0002] Iš daugelio antimikrobinių medžiagų artimiausi analogai yra banzoalkonijaus chloridas ir dovicilas-200. Cheminiu požiūriu jie, kaip ir siūlomas junginys yra ketvirtiniai amonio dariniai. Tačiau antimikrobinių poveikiu efektyvesnis yra banzoalkonijaus chloridas. Pastarojo darbinė koncentracija 0,01-0,1%, o dovicilo-200 - 0,1 -0,2%. Pagal suvestinę lentelę apžvalginiame straipsnyje (T. R. JIerHH, 2- 6poM-2- HHTponponaH-l, 3-ztHon ( 6p0H0n0Ji) h ero npon3BoaH £ »ie: c h h t e 3, CBOHCTBa, npHMeHeHue ( 0630p). Xhm. įapMaijeBT. >KypHaji, 1 996, 30, Ns 4, CTp. 54-64.) matosi, kad banzoalkonijaus chloridas tiek gramteigiamas (Gr+), tiek gramneigiamas (Gr-) bakterijas, tiek grybelius (mielėms panašius ir pelėsinius) vienintelis iš daugelio antimikrobiškai veikia mažiausiomis koncentracijomis.
[0003] Banzoalkonijaus chlorido toksiškumą nusako jo LD} 0, kuri mūsų duomenimis baltoms pelėms per os yra 100 mg/kg. Todėl jis priskiriamas prie vidutiniškai toksiškų medžiagų. Vis dėlto jau yra buvę apsinuodijimų (M. Van Berkel, F. A. de Wolff / Survival after acute benzalkonium chloride poisoning. // "Hum. Toxicol.", 1988, 7, ,N° 2, 191-193 (a n g 1.) • P- 5K • «T0KCHK0Ji0rH*» 1988 r. 9. 75. 442; B. Janiak / Viruzide und Spermizide mit einem Gehalt an ąuaternaren Ammoniumsalzen // Pat. 3706484 VFR. P. )K. «Xhmhh» 1 989 r. 90201 n.)
[0004] Banzoalkonijaus chloridas, ištirpintas vandenyje nepakankamai efektyvus { tokius mikrobus kaip Salmonella spp. (K. III. flocaHOB / HeKOTopbie acneKTM MexaHH3Ma fleftcTBHa npenapaTa h h p t a h h nepeKHcn Boaopofla Ha 6aKTepHH. // ABTopeįepaT flHccepTaium Ha cohck3hhs yneHoft cTeneHH KaH/iHaaTa BeTepHHapHBix HayK. MHHHcrepcTBO ce^ bCKoro xo3HHCTBa CCCP. Bcecoio3HsiH h a y h h o - HCcneaoBaTejitcKHH HHCTHTyT BeTepHHapHOH caHmapnH (03. 00. 07. - MHKpoSHonorHH), MocKBa, 1 979 r.) ir Pseudomonas aeruginosa (J. Plocek, A. Lukas, P. Maijer / Farm. obzor. - 1 988. - Vol. 57, 6. - p. 257-269.). Aišku, didinant koncentraciją, galima pasiekti gerą efektą ir į tik ką minėtus mikrobus. Tačiau su vidutinio toksiškumo banzoalkonijaus chlorido didelėmis koncentracijomis dirbti reikėtų atsargiai.
[0005] Šio išradimo esmę sudaro naujai sintezuotų N-karbamoilmetil heksametilentetraamonio darinių geras vandeninių tirpalų antimikrobinis poveikis ir žymiai mažesnis toksiškumas. Efektingiausias iš jų yra N-karbamoilmetil heksametilentetraamonio chloridas (lab. šifras U-77). Jo aktyvumas į Gr+ ir Gr-bakterijų atstovus, lyginant su banzoalkonijaus chloridu (lab. šifras BALcl)
[0006] naudojant difuzinį duobelių metodą (V. Girdzijauskas, D. Vikonytė - Vasiljevienė, H. Borisevičienė, V. Kartauskas / Mikrobų jautrumo antibiotikams nustatymas. // Medicininės mikrobiologijos praktinis vadovas. Valstybinė politinės ir mokslinės literatūros leidykla, Vilnius, 1961 m., , 113; W. Kohler, H. Mochmann / Resistenztestung gegen Antibiotiką. // Grundrip der Medizinischen Mikrobiologie. Vierte Auflage, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1975, 615.) matyti, kad stipriausiu ant i mikrobini u veikimu pasižymi U-7 7. Į E. coli, Streptococcus agalactiae ir Staphylococcus aureus bakterijas U-77 ir banzoalkonijaus chloridas veikia beveik vienodai, tačiau Salmonella spp. vystymąsi U-77 slopina beveik du kartus stipriau. { cheminėms medžiagoms atsparias Pseudomonas aeruginos a bakterijas U-77 taip pat veikia stipriau už banzoalkonijaus chloridą.
[0007] Nustačius toksiškumą (tuo pačiu metodu kaip ir banzoalkonijaus chloridui) gauta, kad U-77 yra mažai toksiška medžiaga. Jos LDsn= 2S90 mg/kg, t. y. beveik 29 kartus mažiau toksiška, nei banzoalkonijaus chloridas.
[0008] Tuo būdu yra visiškai akivaizdu, kad U-77 gali būti panaudota kaip efektingai veikianti, netoksiška a n t i m i k ro b i nė medžiaga. Jos struktūrinė formulė:
[0009] N- Karbamoilraetil hcksametilentetraamonio chlorido (U-77)
[0010] sintezė
[0011] Apvaliadugnėje 100 cm3 talpos kolbutėje su grįžtamuoju šaldytuvu ištirpinama šildant 2,8 g (0,02 molio) farmakopėj inio heksametilentetramino 30 - yje cm' trichlormetano, pridedame 1,87 g (0,021 molio) chloracetamido ir mišinį šildome vonioje 4 h prie 80°C (kad trichlormetanas virtų). Reakcijos eiga buvo sekama chromatografiškai kas 0,5 h.. Atšalus mišiniui iki kambario temperatūros baltos kristalinės nuosėdos surenkamos ant filtro, plaunamos keletą kartų karštu trichlormetanu (po 20 cm3). Gautos medžiagos vienalytiškumas tikrintas chromatografiškai ant silufolo - UV254 plokštelės eliuentu naudojant tirpiklių mišinį iš butanolio - etanolio - acto rūgšties ir vandens santykiu 8:2:1:3. Gauta 3,18 g (68%).
[0012] Dėmes ryškinome jodo garuose. Rf0,28. Lydimosi (skilimo) temperatūra 121-123°C. Elementinės analizės duomenys: išskaičiuota: N 29,85%; C1 15,14%. C8H17ONjC1. Gauta: N 29,73%; C1 14,85%.
[0013] Taip buvo pirmą kartą sintezuotas U-77 ir pateiktas biologiniams tyrimams.
[0014] Antimikrobinio aktyvumo tyrimas ir jo kiekybiniai rodikliai
[0015] Mikroorganizmų jautrumą tiriamajai U-77 medžiagai nustatėme naudodami difuzinį duobelių metodą (V. Girdzijauskas, D. Vikonytė - Vasiljevienė, H. Borisevičienė, V. Kantauskas / Mikrobų jautrumo antibiotikams nustatymas. // Medicininės mikrobiologijos praktinis vadovas. Valstybinė politinės ir mokslinės literatūros leidykla, Vilnius, 1961 m., 113; W. Kohler, H. Mochmann / Resistenztestung gegen Antibiotiką. // Grundrip der Medizinischen Mikrobiologie. Vierte Auflage, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1975, 61 5.): mėsos peptono agarą išpilstėme į Petri lėkšteles po ~40 ml. Ant pilnai paruošto mėsos peptono agaro užsėjome vieną kurių nors iš šių bakterijų E. coli, Salmonella cholerae suis, Salmonella enteritidis G artner i, Streptococcus agal a ct i a e, Staphylococcus aureus buljoninę kultūrą. Po to, išsiurbiant terpę, darėme 9 šulinėlius (8 mm. diametro): vieną centre, aštuonis iš šonų ratu. Į šulinėlius lašinome po 1 lašą mėsos peptono agaro, kad tiriamoji medžiaga nepatekėtų po terpe. Į šoninius šulinėlius lašinome po 0,1 ml skirtingos koncentracijos (0,05-10%) tiriamos medžiagos vandeninio tirpalo, o į centrinį šulinėlį nieko nelašinome (kontrolė). Lėkšteles laikėme termostate 18-24 vai. 37°C temperatūroje. Bakteriostatinį medžiagų veikimą įvertinome, matuojant apie šulinėlį esančios sterilios zonos diametrą milimetrais. 1 lentelėje pateikti tyrimų in vitro rezultatai. U-77 bakteriostatinį aktyvumą palyginome su benzoalkonijaus chloridu bakteriostatiniu aktyvumu. Norėdami gauti tikslesnius duomenis su kiekviena bakterijų kultūra ir tiriamos medžiagos koncentracija atlikome po 8 tyrimus.
[0016] Iš duomenų, pateiktų 1 lentelėje, matome kad U-77 pasižymi platesniu bakteriostatinio veikimo spektru už benzoalkonijaus chloridą. Jis gerai veikia ir Gr+ ( Streptococcus agalact iae ir Staphylococcus aureus), ir Gr- ( £ . coli, Salmonella cholerae suis ir Salmonella enteritidis Gartneri) bakterijas. Tuo tarpu 1% benzoalkonijaus chlorido tirpalas prastokai veikia Salmonella spp.
[0017] Papildomai ištyrėme banzoalkonij aus chlorido ir U-77 bakteriostatinį aktyvumą į labai atsparias Pseudomonas aeruginosa (kamienai L001, L002, L003, L004) bakterijas. Norėdami gauti tikslesnius duomenis su kiekviena medžiaga atlikome po 8 tyrimus. Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
[0018] Pseudomonas aeruginosa bakterijas U-77 tirpalas veikia šiek tiek stipriau už benzoalkonijaus chloridą. Tik kamienas L002 vienodai jautrus abiejoms medžiagoms. Atsižvelgdami į tai, kad Pseudomonas aeruginosa bakterijos yra labai atsparios cheminių medžiagų poveikiui, galime teigti, kad U-77 prieš jas veikia gana efektyviai.
[0019] Ūmaus toksiškumo tyrimas ir jo kiekybiniai rodikliai
[0020] U-77 junginio ūmų toksiškumą nustatėme atlikdami bandymus su baltomis pelėmis. Tiriamosios medžiagos toksiškumo įvertinimui buvo paimta 30 nelinijinių, abiejų lyčių 20-22 g svorio baltų pelių. Bandoma vaistinė medžiaga zondo pagalba buvo suduota tiesiai į skrandį (viso 5 skirtingos dozės). Kiekvienai dozei panaudota po 6 peles. Po preparato sudavimo pelės buvo stebimos 5 dienas, kreipiant dėmesį į bendrą savijautą, judrumą, jautrumą dirgikliams, apetitą ir gaišimo laiką. Pagrindiniu kriterijumi buvo pasirinktas pelių gaišimas nuo atitinkamos dozės. Nugaišusias peles skrodėme ir apžiūrėjome vidaus organus. Gautus duomenis apdorojome Ličfildo ir Uilkoksono (1949), modifikuotu Z. Roto, metodu (JI. BejieHtKHH / MeToa JlHTH<į>Hjifla h ymik0kc0ha (1949) // 3jieMeHTti kojihiectbehhoh o u e h k h į) ap m a ko ji o r h q e c k o ro 3<į) <įieKTa. rocygapcTBeHHoe H3flaTejii, ctbo MejHiiHHCKOii ji h Te p aiy p m , JleHHHrpaa 1963.). Naudojantis probitiniu tinkleliu ir nomogramomis apskaičiavome bandomųjų vaistinių medžiagų L D u, L D i0 (bei jos patikimumo ribas) ir LD34 . Remiantis gautais duomenimis, pagal farmakologijos ir chemioterapijos reikalavimus buvo nustatyta bandomosios medžiagos toksiškumo klasė. 3 lentelėje pateikti U-77 ūmaus toksiškumo parametrai baltoms pelėms.
[0021] Remiantis gautais duomenimis ir atsižvelgdami į chemioterapijos reikalavimus, galime teigti, kad U-77 priklauso mažai toksiškų medžiagų grupei, nes LDį0 (tai vidutinė mirtina dozė. Ji reiškia veikliosios medžiagos kiekį, kuris įduotas tam tikru būdu, sukelia 50% eksperimentinių gyvūnų mirtį) yra šios grupės parametrų ribose (500-5000 mg/kg).
1. N-karbamoi Įmeti 1 he ks a met i 1 eti te traamo n i o chloridas, turintis formulę:
2. Junginys pagal 1 punktą, skirtas naudoti kaip antimikrobinis vaistas, ypač prieš bakterijas Salmonella spp, ir Pseudomonas ueruginosa.
3. Junginys pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jo toksiškumas LD}Q - 2890 mg/kg.